Ischémie-reperfusion modèle de lésions rénales aiguës et post blessures fibrose chez la souris

Summary

Nous décrivons les modèles de lésions rénales ischémie-reperfusion induite modérée et sévère dans laquelle les souris subissent unilatérale pédicule rénal serrage suivie par néphrectomie controlatérale simultanée ou différée, respectivement. Ces modèles donnent systématiquement lieu à une insuffisance rénale et une fibrose post-traumatique, mais la gravité des blessures et la survie dépendent de fond, l'âge et chirurgical de la souris.

Abstract

Insuffisance rénale aiguë induite par l'ischémie-reperfusion (IR-AKI) est largement utilisé comme un modèle de AKI chez la souris, mais les résultats sont souvent très variable avec des taux élevés de mortalité souvent non déclarés qui peuvent fausser les analyses. Bilatérale pédicule rénal serrage est couramment utilisé pour induire IR-AKI, mais les différences entre les pressions de serrage efficaces et / ou des réponses à une ischémie rénale entre reins conduisent souvent à des résultats plus variables. En outre, les temps de serrage plus courtes sont connus pour induire des lésions aux tubules plus variable, et alors que les souris subissant une blessure bilatérale avec des temps de serrage plus développer lésion tubulaire plus cohérente, ils meurent souvent dans les 3 premiers jours après une blessure due à une insuffisance rénale sévère. Pour améliorer la survie post-traumatique et d'obtenir des résultats plus cohérents et prévisibles, nous avons développé deux modèles de lésions d'ischémie-reperfusion unilatérale suivie par néphrectomie controlatérale. Les deux chirurgies sont effectuées en utilisant une approche dorsale, la réduction du stress chirurgical résultant from laparotomie ventrale, couramment utilisé pour les souris IR-Aki chirurgies. Pour l'induction de blessures souris BALB / c modérés subissent unilatérale de serrage du pédicule rénal pour 26 min et subissent également une néphrectomie controlatérale simultanée. En utilisant cette approche, 50-60% des souris de développer modérée AKI 24 heures après la blessure, mais 90-100% des souris survivent. Pour induire une IRA plus grave, des souris BALB / c subissent pédicule rénal serrage pendant 30 min suivie par néphrectomie controlatérale 8 jours après la blessure. Cela permet une évaluation fonctionnelle de récupération rénale après une blessure à 90-100% de survie. Au début des lésions tubulaires post-traumatique ainsi que après une blessure fibrose sont hautement compatibles avec ce modèle.

Introduction

Une variété de modèles expérimentaux d'insuffisance rénale aiguë (IRA) ont été développés pour répondre à la diversité et à la complexité de la condition humaine (voir référence pour un récent examen exhaustif ^1). Chacun de ces modèles a ses propres forces et faiblesses, et tandis que chaque imite les conditions humaines correspondantes avec des rendements variés, aucun modéliser précisément la physiopathologie de leurs homologues humains. ischémie-reperfusion (IR) induite par AKI a été développé comme un modèle de lésion rénale induite par l'ischémie aiguë chez les rongeurs. Alors que la gravité de la blessure tubulaire rénale vu dans ce modèle est rarement observée chez les patients souffrant de lésions de hypoperfusion rénale ^2, malgré ses limites et en grande partie en raison de la nature relativement reproductible de ce modèle, son utilisation intensive a fourni, et il est prévu, continuera de fournir des indications importantes sur la plupart des mécanismes communs de base de AKI, la réparation et la thérapie ^3. Chirurgie IR nécessite familiarity avec l'anatomie du rein de souris, que nous avons illustré sous une forme simplifiée dans la figure 1. Chirurgie des lésions rénales ischémie-reperfusion (IR) peut être réalisée par des approches ventrales (laparotomie) ou dorsale (rétropéritonéale). Nous utilisons une approche dorsale car elle est moins traumatisante, permettant des temps de récupération plus rapide et une meilleure survie (en particulier lors de la première étude de la procédure). Rénale blessure IR peut être effectuée unilatéralement ou bilatéralement. Toutefois, les différences entre les pressions efficaces de serrage (qui peut résulter de l'interposition de la graisse péri-hilaire entre les mâchoires de la pince) et / ou des différences dans les réponses à une ischémie rénale entre les côtés conduit à des résultats plus variables. Si ce n'est pas un problème insurmontable, il peut augmenter la variabilité entre les expériences, ce qui est un enjeu majeur pour ce modèle. IR unilatérale peut être réalisée avec une néphrectomie controlatérale. C'est notre méthode de choix car elle réduit la variabilité de serrage entre pédicules, et en même temps uneP ermet un à évaluer la fonction rénale, qui n'est pas affecté par IR unilatérale seul. Il ya eu des discussions sur ce qui est la méthode la plus pratique vs optimale afin d'évaluer la fonction rénale chez les souris. Urée sanguine (BUN) fournit une mesure de la fonction rénale et est un "premier regard" marqueur utile dans certains modèles de AKI, y compris les blessures IR. Cependant, les niveaux BUN peuvent être affectés par l'état du volume des souris susceptibles d'être affectés, notamment à la suite ventral blessure IR d'approche, lorsque la récupération tardive réduit la prise orale de fluides pour un nombre de jours post-opératoires. La créatinine sérique est moins influencée par l'état d'hydratation mais il est clairement affectée par la masse musculaire. Une des difficultés avec des mesures de la créatinine sérique a eu des problèmes avec la détection des chromogènes non-créatinine dans le sérum de souris en utilisant des techniques à base d'acide picrique. Comme alternative, un certain nombre de centres ont mis au point une méthode HPLC à base de quantifier la créatinine de la souris qui n'est pas affectée par cet artefact ^4. Cependant, UNLike BUN et dosages de la créatinine de l'acide picrique, qui ne nécessitent 5-10 ul de sérum, HPLC tests nécessitent environ 25 pi par dosage sérique, qui si elle est effectuée en double, il faudra ~ 100 ul de sang total par dosage. Cela peut être un facteur limitant pour les études de souris. Certains centres ont développé des méthodes HPLC et spectrométrie de masse basée sur plus sensibles qui permettent une analyse de petits volumes d'échantillons ^{5, 6.} Cependant, ces technologies ne sont pas largement disponibles. Un essai en cascade alternative enzymatique (qui nécessite seulement 5-10 ul de sérum) a été évaluée dans des échantillons de sérum souris et le rat et montré ressemblerait de près mesures HPLC de la créatinine sérique alors que les tests de l'acide picrique toujours des valeurs de créatinine surestimer ^7. Bien que ce test n'est pas largement utilisé dans la littérature AKI, le dosage est disponible dans le commerce, simple à utiliser, et nous trouvons donne des résultats fiables avec ce modèle d'IR induite par AKI chez la souris.

Protocol

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Notez que si l'on effectue plusieurs opérations sur différents souris, rincer les instruments après chaque utilisation, puis stériliser l'aide d'un stérilisateur à billes chaud. Il ne suffit pas de faire tremper dans de l'éthanol à 70%.
2. Donner 0,5 ml S / C saline normale stérile préopératoire et postopératoire immédiate pour compenser la perte de liquide corporel pendant la chirurgie.
3. Peser les souris.
4. Anesthésier la souris en utilisant xylazine IP / mélange kétamine. Il prend habituellement 3-5 min pour les souris à atteindre chirurgicale plan anesthésie.
5. Raser le site chirurgical avec suffisamment zone frontalière pour garder les cheveux de contaminer le site d'incision. Cela doit être effectué dans une zone de préparation, pas là où l'opération est effectuée.
6. Appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la procédure.
7. Placer la souris sujettes à la surface chauffée couverte avec la garniture de banc absorbant. jambes de bande à la surface chirurgicale.
8. Si vous utilisezle système de bain d'eau, mettre la chaleur à 38 ° C 1 heure avant la chirurgie.
9. Préparation aseptique utilisant Betadine solution tampon bâton: gommage du centre du site vers la périphérie 3x, chaque fois suivi d'un nettoyage avec Nolvasan pour enlever la Betadine. Tous Betadine doit être retiré du champ chirurgical avant l'incision par un rinçage à l'Nolvasan. Avant de commencer gants de procédures aseptiques devraient être modifiés pour être stériles.
10. Couvrir champ opératoire avec un champ opératoire stérile. Cela permettra d'éviter cheveux parasite de pénétrer dans le champ opératoire et offrir un espace où reposer instruments stériles pendant la chirurgie.
11. Palper emplacement du rein à travers la peau.
12. Coupez la peau du dos le long de la ligne médiane de souris (environ 1,5 cm) à l'aide des ciseaux et des pinces.
13. Séparer la peau et les couches sous-cutanées sur les côtés dorsal gauche et droite à travers cette incision par dissection avec des ciseaux et des pinces.
14. Faire une petite incision à travers le droit flANK musculaire et fascia-dessus du rein et extérioriser le rein droit.
15. Disséquer soigneusement les pôles supérieur et inférieur du rein libres du tissu environnant. Notez que les tissus adipeux de partout dans le pôle supérieur contient la glande surrénale portant son propre approvisionnement en sang qui peut être poussée hors du rein, mais de toute évidence ne doit pas être retiré de la souris (Figure 1). Après rein libérateur de tissu environnant, attacher le fil de soie 4-0 autour du hile du rein droit en utilisant un noeud à double chirurgicale. Laisser une extrémité de la suture ~ 2 en long pour contenir le rein que vous coupez distale du nœud de sorte que vous pouvez visualiser le site à couper. Irriguer le moignon avec une solution saline stérile.
16. Fermez la couche musculaire en utilisant suture absorbable.
17. Faire une petite incision dans le muscle du flanc gauche et au-dessus du fascia rein et extérioriser le rein gauche (figure 2A).
18. Tenez soigneusement rein en utilisant le forceps émoussé tout en libérant rénalepédicule du tissu environnant graisse à l'aide des pinces (figures 2B-2F). Trop de pression sur le rein en utilisant les forceps émoussé peut provoquer des lésions rénales on doit donc tenir compte lors de la conception des contrôles «Sham» pour les études. Si vous trouvez que vos commandes fictives se développent des lésions rénales (comme en témoigne une augmentation de la créatinine sérique), une méthode alternative, vous pouvez envisager de libérer le tissu adipeux environnant du pédicule rénal est de faire rouler doucement les tissus avec une solution saline stérile imbibée de coton écouvillons pointe. Dans notre expérience, la graisse est assez fermement attaché à la pédicule rénal et ne peut pas être enlevé facilement avec des cotons-tiges, de sorte que ce ne soit pas la première approche que vous souhaitez utiliser. Cependant, comme d'autres aspects de ce modèle, c'est quelque chose que vous aurez à mettre en place pour vous-même avec la pratique et l'expérience.
19. Clamp gauche pédicule rénal utilisant clamp vasculaire non traumatique aide d'une pince de fixation (pour faciliter le positionnement de la pince), utiliser la minuterie pour différentes clamp fois en fonction de la souche de souris et de la gravité des blessures nécessaire (voir tableau 1).
20. Couvrir le rein gauche avec la peau (figure 2H).
21. Couvrir incision de la peau avec gaze imbibée saline.
22. Extérioriser rein, confirmer l'aspect sombre uniforme et relâcher la pince après les heures indiquées, et confirmer que l'aspect sombre revers uniformément dans le rein (Figure 2I / G). Si le rein n'est pas rapidement et uniformément re-perfuser (jusqu'à rose) de la souris devrait être exclu de l'analyse. Poussez doucement les reins en arrière dans l'espace rétro-péritonéal.
23. Fermez la couche musculaire en utilisant suture absorbable.
24. Fermez la couche de peau en utilisant monofilament en nylon non résorbable.
25. Administrer la buprénorphine analgésie.
26. Transfert souris loin du champ opératoire sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'ils se réveillent.
27. Remettre les souris à la salle des animaux.
28. Surveiller de près les souris et donner des doses supplémentairesde la buprénorphine comme indiqué ci-dessus toutes les 8-12 h pour la douleur ou d'inconfort. Les signes cliniques résultant de l'administration d'analgésiques comme la dépression ou d'autres changements de comportement, l'apparence anormale ou posture comme horripilation, posture courbée, le manque de toilettage et de manger, ou à l'immobilité.

Representative Results

Modéré IR induite par AKI. IR unilatérale avec néphrectomie controlatérale simultanée réduit considérablement la variabilité des résultats, mais avec des temps de serrage courtes nécessaires pour les souris de survivre à cette procédure, nous avons trouvé encore que seulement 50-60% des souris ont développé l'insuffisance rénale attendu 24 heures après une blessure (figure 3A). En termes pratiques, cela crée des difficultés à évaluer les données, sauf si les études portent sur les régimes de traitement qui peuvent être initiées au moins 24 heures après l'accident, laissant le temps d'évaluer la fonction rénale et jetez-souris qui ne développent pas une insuffisance rénale.

IR sévère induite par AKI. Outre l'exécution IR unilatérale avec néphrectomie controlatérale simultanée, nous effectuons IR unilatérale seul. Les souris peuvent survivre beaucoup plus longues périodes d'ischémie et ont tendance à se développer plus sévère fibrose post-traumatique. Avec la même période de l'ischémie, les souris soumises à déve d'ischémie unilatéralelop fibrose plus sévère que l'ischémie bilatérale ou unilatérale avec ischémie néphrectomie ^8, si ce modèle est également utilisé comme un modèle de post-AKI fibrose. L'inconvénient est qu'il n'est pas possible d'évaluer la récupération fonctionnelle après une lésion unilatérale IR donc il n'y a aucun moyen d'évaluer la gravité des blessures sans prélèvements de tissus rénaux et qui ne peut être possible pour des études à plus long terme. Pour cette raison, nous avons développé un protocole pour induire de graves lésions IR unilatérale, et d'évaluer la récupération de la fonction rénale en effectuant une néphrectomie controlatérale 8 jours après la lésion initiale. En utilisant cette approche 90-100% des souris survivre à la blessure, mais surtout les souris développent des lésions rénales très cohérent et peuvent être évaluées pour la récupération fonctionnelle après AKI dès le premier jour les compter 9 (figure 3B). Ces résultats sont cohérents avec les études chez le rat indiquent que plus rénales fois de serrage pédiculaires induisent lésion tubulaire rénale plus constitutif de courte pince ti mes conçu pour induire légère à modérée AKI ^9. En outre, en accord avec des études précédentes ^8, ces souris développent constamment la fibrose rénale des blessures poste (que nous avons évalué au jour 28). Ce n'est pas associée à une protéinurie au moins sur un fond BALB / c: après les graves IR-AKI au jour 28 rapport albumine / créatinine urinaire après la lésion est de 0,8 ± 0,04 (moyenne ± SEM en ug / mg). On ignore si la sévère modèle IR-AKI donne lieu à une protéinurie sur d'autres horizons.

Figure 1. Anatomie de la souris rénale hile poste. Illustrant de la gaine vasculaire rénale par rapport à l'uretère, coussinets adipeux périnéphrétique et la glande surrénale à l'approvisionnement en sang. Le cercle noir marque la position des micro-clamp.

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Figure 2. L'exposition et le serrage de la gaine vasculaire du rein de souris (A), l'exposition du rein gauche après dissection de la peau et la couche musculaire;. (B - E), le rein gauche est tenue doucement avec une pince émoussée tandis que la graisse perinephric est soigneusement enlevé en utilisant une pince. (F), exposé à gauche pédicule rénal (flèche verte). La ligne en pointillé blanc marque la position attendue de l'uretère dans le coussinet adipeux périhilaire. Cette région doit être évité avec la pince vasculaire. (G), Micro-pince appliquée au rein gauche. (H), Clamped rein gauche est recouvert de la peau. (I), (G), Apparition du rein avant (A), au cours de (I) et après (G) après le retrait de la pince vasculaire.

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Figure 3. La récupération fonctionnelle après l'IRA. Variations de créatinine sérique (par dosages enzymatiques) après une blessure IR modérée (26 min Temps de serrage) et néphrectomie controlatérale (A), les changements de la créatinine sérique après l'induction de blessures graves (30 min Temps de serrage) et néphrectomie controlatérale à Jour 8 (B). Des études réalisées chez des souris BALB / c, n = 6 par groupe. Résultats exprimés en moyenne + /-SEM créatinine sérique en mg / dl, mesuré en utilisant un dosage enzymatique.

souche de souris	L'âge approximatif de la souris	Poids approximatif de la souris	Type de fixation	Société et le numéro de catalogue	temps d'ischémie de blessures graves	temps d'ischémie de lésions corporelles modérées	température du tampon de chauffage
BALB / c 4-5 mois	25-28 g	Clamp vasculaire (795 g pression)	Roboz, RS-5459	30 min (ou plus)	26 min	38 ° C
C57BL / 6	4-5 mois	24-27 g	Clamp vasculaire (795 g pression)	Roboz, RS-5459	29 min (ou plus)	26 min	38 ° C
CD1	4-5 mois	36-39 g	Clamp vasculaire (75-85 pression g)	FST, 18055-02	29 min (ou plus)	26 min	38 ° C

Tableau 1. Recommandé clamps vasculaires, le temps d'ischémie, et les souches de souris que nous avons évalué.

Discussion

Nous décrivons deux modèles d'IR-AKI pour étudier les effets de l'atteinte rénale modérée et sévère. Ces modèles nous permettent d'induire des lésions cohérente et prévisible avec une faible mortalité. Notre protocole décrit bon nombre des difficultés et des écueils traditionnellement associés à ce modèle. Par ailleurs, nous avons montré que selon la longueur du pédicule rénal serrage, le modèle induit une légère ou modérée AKI largement réversibles, ou plus grave AKI avec récupération incomplète et la fibrose rénale persistante. Fibrose post-traumatique sévère dans le modèle IR-AKI peut résulter du fait que les souris sont capables de survivre avec atteinte rénale plus sévère que ce qui serait possible si ces temps plus ischémiques ont été effectués bilatéralement. Cependant, il est également prouvé que la présence d'un rein controlatéral indemne pendant les quelques premiers jours après IR améliore post-AKI fibrose ^8. Par conséquent, alors que les mécanismes de la diaphonie entre les reins indemnes et les blessés restent à être étainstitué, ce mécanisme peut aussi expliquer pour une meilleure fibrose post-traumatique que nous observons dans ce modèle. Bien qu'il reste à déterminer si les résultats à l'aide de ces modèles peuvent être convertis en produits thérapeutiques pour les maladies humaines, ils fournissent des modèles fiables pour étudier les mécanismes et thérapeutiques dans IR-AKI et de prévenir post-AKI fibrose rénale, un problème clinique qui est en train de devenir un contributeur majeur dans la maladie rénale chronique évolutive ^{10, 11.}

Il ya un certain nombre de questions cruciales qui peuvent influer sur la gravité de AKI suite à une blessure IR qui doivent être soigneusement assisté à: souche de souris ^12, genre ^{13, 14} ans et le poids de la souris, le clamp vasculaire utilisé, et les systèmes de chauffage ^15. Choisir les clamps vasculaires droit peut être un défi. Efficacité de la pince est évaluée au cours de l'intervention chirurgicale que le rein doit devenir uniformément noire à l'intérieur de 5-10 min de placement de serrage. Cependant, il est également important que l'ensemble du rein est re-perfusion (roses up) rapidement après le retrait de la pince. Nous avons trouvé quelques-uns des plus lourdes pinces fonctionnent bien avec certaines souches (par exemple BALB / c et C57BL / 6), mais dans d'autres, ces pinces induire des lésions vasculaires et la reperfusion rénale est souvent incomplète (ex: CD1). Un résumé des clamps vasculaires, des poids de serrage (pression) et des souches de souris que nous avons évaluées est répertorié dans le tableau 1. Pour les systèmes de chauffage, un certain nombre de chercheurs utilisent les coussins chauffants auto-régulées avec des sondes de température pour surveiller et maintenir la température corporelle constante. Bien que théoriquement avantageux, nous avons trouvé ce système de chauffage peut entraîner des fluctuations importantes de la température corporelle au cours de la chirurgie, donnant lieu à des résultats très variables. En outre, ces systèmes sont relativement cher, donc peut limiter le nombre de souris on peut opérer à n'importe quel moment. Après beaucoup d'essais et erreurs, nous sommes passés à une température constante, une circulation d'eau HEAsystème ting. Le principal avantage de cela est que la plate-forme de chauffage donne des températures stables (38 ° C) tout au long de l'opération. Avec le grand espace de plate-forme, il est également possible de faire fonctionner sur un certain nombre de souris sur la surface à un moment donné (qui est une exigence pratique pour la plupart des études IR-Aki). Cela dit, nous n'avons trouvé qu'il y avait encore une grande variabilité des blessures suite à modérée (mais pas grave) IR-AKI. Ce n'est pas un problème pour les études dans lesquelles les traitements sont lancés 24 heures ou plus après la blessure, puisque les souris en développement blessure insuffisante ou trop sévère peuvent être retirés de l'étude avant la randomisation par une analyse de la créatinine sérique. Toutefois, si les souris sont traitées avant la lésion ou si les modèles génétiques sont utilisés, des contrôles supplémentaires sur la variabilité expérimentale faudra peut-être mis en place. Depuis fluctuation de la température centrale du corps est susceptible d'être le principal contributeur à la variabilité des blessures IR dans ce modèle, une approche pour limiter la variabilité serait de mtempératures de base en utilisant des sondes rectales Onitor afin de déterminer animaux appropriés pour inclure ou exclure dans les analyses subséquentes. Les considérations finales sont l'âge de la souris, le poids et le sexe. La plupart de notre expérience a été avec des souris BALB / c, et nous avons obtenu les meilleurs résultats lorsque les souris atteignent le poids corporel stable par 4-5 mois d'âge, de poids de corps ~ 25-28 g. Enfin, puisque les hommes ont une plus grande sensibilité aux IR-AKI que les femmes de ^13, nous effectuons toutes nos études utilisant des souris mâles seulement. Cependant, il ya des variables supplémentaires qui sont difficiles à contrôler, de sorte que chaque laboratoire et chaque chercheur devront établir les durées et conditions de serrage précis pour induire la gravité des blessures qu'ils désirent dans la souche de souris de leur choix.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15" W x 24" Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2’’ x 2’’ Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.