Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En noninvasiv metode til doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Fiskerivarer-inducerede ændringer udnyttede krebsdyr fiskerier såsom det amerikanske hummer fiskeri, kan potentielt påvirke deres reproduktive dynamik, hvilket fører til en reduktion i parring succes. Denne undersøgelse mål var at udvikle en noninvasiv metode til at konstatere parring succes kvindelige hummere, der kan være fysiologisk eller funktionelt modne.

Abstract

Trods at være en af ​​de mest produktive fiskerier i det nordvestlige Atlanterhav, stadig meget ukendt om de fysiske reproduktive dynamikken i amerikanske hummere. Nyligt arbejde i udnyttede krebsdyr populationer (krabber og hummere), tyder på, at der er omstændigheder, hvor modne kvinder er i stand til at nå deres fulde reproduktive potentiale grundet sperm begrænsning. For at undersøge denne mulighed i forskellige regioner i den amerikanske hummer fiskeriet blev en pålidelig og noninvasiv metode udviklet for prøvetagning stort antal kvindelige hummere på havet. Denne metode indebærer indsættelse en stump spids nål i kvindens skelsættende beholder til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af en sædcelle stik og trække en prøve, der kan undersøges for tilstedeværelsen af ​​sædceller. En række kontrol-undersøgelser blev udført ved kajen og i laboratoriet for at teste pålideligheden af ​​denne teknik. Disse bestræbelser indebar prøveudtagning 294 kvindelige hummere for at bekræfte, at tilstedeværelsen ofa sperm plug var en pålidelig indikator for sperm inden i beholderen og dermed parring. Dette papir beskriver den metode og de opnåede resultater fra en delmængde af de samlede hunner stikprøven. Af de 230 kvindelige hummere stikprøven fra Georges Bank og Cape Ann, MA (størrelsesorden = 71-145 mm rygskjoldslængde), 90,3% var positive for sperm. Potentielle forklaringer til manglende sædceller i nogle hunner omfatter: umodenhed (manglende fysiologisk modenhed), nedbrydning af sædcellerne stik efter bruges til at befrugte en kobling af æg, og mangel på parring aktivitet. Undersøgelserne viser, at denne teknik til at undersøge parringssucces kvindelige hummere er en pålidelig proxy, der kan anvendes inden for området til at dokumentere reproduktiv aktivitet i naturlige populationer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Amerikansk hummer (Homarus americanus) er en af de mest produktive fiskeri i det nordlige Atlanterhav (~ 56.000 mt i 2011, værdsat mere end 390 millioner dollar) 1.. Imidlertid er der en generel mangel på forståelse for de reproduktive dynamik af denne art i de vilde bestande. Generering mere præcise skøn over den reproduktive output, herunder antallet og størrelser af personer deltager aktivt i reproduktion, kan forbedre bestandsvurdering processen. For eksempel har hunner, der er forhindret i at nå deres fulde reproduktive potentiale på grund af sperm begrænsning blevet identificeret som en bekymring for flere kommercielt udnyttede marine krebsdyr, herunder: languster 2, blå krabber 3, kongekrabber 4, sten krabber 5 og sne krabber 6.. Det overordnede mål er at afgøre, om sæd begrænsning kan være en faktor i visse områder af den amerikanske hummer fiskeri så godt.

nt "> De første tegn på en potentiel sperm begrænsning problem i hummere blev observeret, når der udføres en uafhængig tagging studie med rugende kvindelige hummere (med synligt intakte, for nylig ekstruderede æg). Genvind rapporter fra fiskere viste, at ~ 15% af disse dyr var faldet deres æg koblinger efter kun 1-2 måneder. Arbejdshypotesen var, at nogle hummere transporterer æg der ikke var blevet befrugtet, og som et resultat, "faldt" 7.. Foreløbige data fra en efterfølgende undersøgelse har bekræftet, at hummere vil ekstrudere æg, selv om de ikke med held har parret, og disse ubefrugtede æg foretages kun for ~ 1 måned 8. Derfor får observation af hunnerne bærer ubefrugtede æg i naturlige populationer, vi har forsøgt at bestemme, i hvilket omfang sperm begrænsning kunne bidrage til en submaksimal niveau af reproduktion af kønsmodne hummere. at nå dette mål blev en teknik udviklet til at detektere spermatoPhore deponeret af mænd under parring.

Dette papir og video beskriver en noninvasiv, enkel metode udviklet til at konstatere parring succes kvindelige hummere. Teknikken kan udnyttes hurtigt og pålideligt på havet, enten ombord forskning eller kommercielle fiskefartøjer. Detaljerne i denne prøveudtagningsmetode samt nogle repræsentative resultater er vist for at illustrere anvendelsen af ​​teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Del A: Field Sampling Teknik

1.. Kvindelige Målinger

  1. For hver hun hummer, måle rygskjoldslængde (CL) og bredden af ​​den anden abdominal segment til nærmeste 1,0 mm ved hjælp af et par glidere.
    BEMÆRK: Den anden abdominal segment måles fordi bredden af ​​maven (hvor hunner bære deres æg) er en indikator for seksuel modenhed. Derudover kan det være fordelagtigt at fastslå fældningen scenen til senere matche disse data med reproduktiv fase (se trin 1.2).
  2. Klip et lille distal del fra en af de abdominale pleopods (en standard metodologisk protokol i hummere) og gemme den pleopod i rent havvand til senere visning med et dissektionsmikroskop 9.
    BEMÆRK: Dette trin kan også afsløre tilstedeværelsen af cement kirtler på pleopods, som er en indikation af, at kvinder er klar til at presse deres æg 10.

2. Needle Insertion

  1. Stik kanylen (18 G, se tabel 1) ~ 1 cm i den skelsættende beholder, vinklet mod halen ved ~ 45 ° (figur 1).
    BEMÆRK: I hummere med intakte sædceller stik, kan nålen mødes modstand under indføring, som det er skubbet gennem sæd proppen før det når den højeste koncentration af sædceller i bunden af den skelsættende beholder (figur 1).
    BEMÆRK: Tilstedeværelsen af ​​stikket i sig selv er en pålidelig indikator for, at hummere har parret. I nogle dyr kan der være lidt modstand, muligvis fordi ingen spermatophore er til stede, spermatophore er lille, det har ikke hærdet i en prop endnu, eller det muligvis allerede blevet brugt til at befrugte et eller flere kløer æg.

Figur 1 Figur 1. Needle isætning og visning af hummer skelsættende beholder. Indsættelse af stump spids nål ind i skelsættende beholder af hummer til at udtrække en sædprøve. Vinklen og dybden af ​​nålen er begge kritiske for at opnå homogene prøver. Højre: Udsigt et skelsættende beholder, der er blevet dissekeret og delt lodret. Sæden stik i den øverste eller yderste del af beholderen, mens spermatozoer er placeret i bunden (dybeste punkt) af beholderen. Det er vigtigt at bemærke, at stikprøver under denne dybde kan punktere beholderen og resultere i en blodprøve-kontamineret. Klik her for at se større billede .

3. Trænge ind Sperm Plug

  1. Efter den indledende indføring stejlere vinkel nålen til næsten lodret (vinkelret på kroppen akse), og meget langsomt begynde at arbejde detned i beholderen.
  2. Hold nålen skråt, så spidsen peger lidt mod halen. I dette tilfælde nålespidsen komprimerer toppen af ​​proppen, indtil den til sidst trænger ind i matrixen.
  3. Fortsæt til langsomt at skubbe nålen nedad indtil der mærkes modstand endnu engang - det er i bunden af ​​beholderen og hvor prøven er taget.

4.. Sperm Fjernelse

  1. Fjerne en prøve (ofte fast prop materiale, flydende sæd og andre væsker) fra bunden af ​​beholderen og deponere prøven i et mærket 2,0 ml plastrør.
  2. Skyl beholderen med ~ 0,1-0,5 ml kold havvand.
  3. Fjern ca 0,3 ml væske og sted i det samme rør.
  4. Store sædprøver på is, indtil de kan undersøges i laboratoriet.
    Del B: Undersøgelse af sædprøver i laboratoriet
    BEMÆRK: Prøver fjernet fra skelsættende beholdere enkelte l obsters bør undersøges for at afgøre, om sædceller var til stede eller fraværende.
  5. Fjern ~ 50 pi af væske fra hvert plastrør sted på et objektglas med et dækglas, og visning på 100X med en forbindelse mikroskop.
  6. Score prøver som: sperm knappe, talrige, eller fraværende (denne undersøgelse ikke kvantificere faktiske sperm numre, figur 2).

Figur 2
Figur 2. Lobster sædprøve billeder. Billeder af hummer sædprøver taget fra en kvindelig skelsættende beholder, set med en forbindelse mikroskop ved 40X forstørrelse. Billede til venstre viser en prøve, der indeholdt talrige sperm, mens den anden (højre) viser en sparsom prøve (skala bar = 10 mM).. Jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De her rapporterede data var for en delmængde af kvindelige hummere, der stammer fra både nearshore og offshore placeringer. Den nearshore gruppe bestod af 44 hummere, der blev taget til fange i de kystnære farvande nærheden af ​​Cape Ann, Massachusetts og transporteret i kølere til laboratoriet til undersøgelse. I alt 186 offshore hummere blev fanget på Georges Bank og samplet ved en erhvervsdrivende bedrift facilitet i New Hampshire.

Sædprøver blev opnået fra alle dyrene og straks undersøgt for tilstedeværelse eller fravær af sæd i overensstemmelse med fremgangsmåder beskrevet ovenfor. I alt 90,3% af alle kvinder i denne undergruppe havde sperm i deres skelsættende beholdere. Overraskende dem, der manglede sædceller ikke nødvendigvis ved den mindre ende af størrelsesområdet (figur 3).

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Prøveresultater for tilstedeværelse af sædceller i hummere. Procent af de kvindelige hummere i 5 mm CL størrelsesklasse skraldespande, der havde sperm i deres skelsættende beholdere (procent positivt) som en indikator for parring. Hunnerne blev fanget fra farvandene nær Cape Ann, MA (71-83 mm CL) og fra Georges Bank (89-154 mm CL). Tal inde søjler repræsenterer samlede stikprøve størrelse for at bin. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne video og papir skitse og demonstrere en metode til bestemmelse af, om kvindelige hummere med succes har parret. Denne fremgangsmåde er enkel nok, at det kan anvendes til storskala prøvetagning af hummere på havet ved en række brugere. Metoden er baseret på at påvise tilstedeværelsen af ​​en spermatophore i skelsættende beholder, der er gået fra mandlige til kvindelige hummere under parring. Disse spermatophores delvis hærdes til en sædcelle plug kort tid efter de er deponeret i beholderen, og dermed tilstedeværelsen af ​​en sædcelle stikket er også tegn på parringssucces. I dette studie, samt en efterfølgende større undersøgelse blev det bestemt, at de fleste sædceller stikpropper havde sædceller forbundet med dem 11. Men mens tilstedeværelsen af ​​et stik er en pålidelig indikator for parring aktivitet, dens fravær er det ikke.

Selvom vi ikke kan være helt sikker på, hvis dette prøveudtagningsmetoden pådrager en negativ effekt på evnen af ​​kvindelige hummere at gyde end held befrugte deres æg kobling, der er aspekter i denne sperm prøvetagningsprotokol der tyder på, at skaden vil være minimal til enten spermatophore eller beholderen. Der er data (fra igangværende lab studier), som angiver nogle hummere, post-sperm prøvetagning, stadig extrude befrugtede kløerne på æg (n = 3), og er i stand til at gøde mere end en kobling af æg ved hjælp af den samme spermatophore. Disse æg udvikle og klækkes på samme måde hummere, der ikke er stikprøven. Desuden er det kun denne prøve teknik tjener til at prøve en lille brøkdel af den samlede sædceller. Det er ikke hensigten at kvantitativt prøve det fulde indhold af en beholder. På grund af den komplekse fysiske arkitektur af beholderen 12,13, ville være påkrævet en anden teknik (f.eks dissektion) for at opnå den slags resultater.

Sperm blev fundet i en række stikprøven dyr, der manglede en sædcelle stikket, muligvis fordi spermatophore var relativt new, og havde endnu ikke hærdet i et stik, eller spermatophore tidligere er blevet brugt til at befrugte et eller flere kløer æg og var forværret. Derfor, for at opnå den mest præcise indeks for parring succes er det vigtigt at både check for en sædcelle stik og prøve for sæd.

Præcis orientering af nålen under proceduren prøveudtagning er kritisk for flere grunde. Første at sikre, at nålen er parallel med den laterale organ flyet forhindrer den i at trænge den tynde side af den skelsættende beholder. Når teknikken er udført korrekt, det forårsager ingen dødelighed, som nålen faktisk aldrig trænger ind i kropskaviteten. For det andet, indsættelsen vinkel 45 °, efterfulgt af en stejlere nålen, bidrager til at sikre, at nålen når bunden af beholderen, hvor spermatozoer koncentreret uden at trænge ind i væggen af spermatophore og ind i tilstødende organ sinus (figur 1) .

13.. Når sædcellerne har reageret, begynder de at bryde ned i prøven og blive vanskelige at identificere. Af denne grund bør omrøring af prøvehætteglas holdes på et minimum. Holde prøverne cool synes også at bidrage til at bevare integriteten af ​​sædceller. Endelig foreslås det at bruge sterilt havvand når prøve behandling. Det kan handle for at minimere væksten af ​​bakterier og andre mikroorganismer (over 36-48 timer), der kan skade sædcellerne.

De fleste (90,3%) af de kvindelige hummere i stikprøven havde parret med succes, baseret på tilstedeværelsen af ​​sædceller i deres skelsættende beholdere. Resten af ​​dyrene måske ikke været sperm positivt, fordi de enten var seksuelt umodne, deres sæd stik var blevet forværret over tid eller havde væreen fuldt ud til at befrugte et eller flere koblinger af æg eller de aldrig havde parret, muligvis fordi de aldrig stødt på en passende mand på det rigtige tidspunkt i deres Molt cyklus 11. Kvindelige hummere i George Bank region har en forholdsvis stor størrelse-at-modenhed, med kun 50% af kvinderne modne ved 100 mm 14. Cape Ann hunner modne ved en lidt mindre størrelse end at gøre offshore hummere, med 50% af kvinderne modne på 90 mm ​​CL 15. Derfor, da de mindste kvinder var 71 mm CL, er det ikke urimeligt at antage, at nogle af de kvinder, der mangler sæd stikpropper var sandsynligvis umodne og dermed ikke ville have parret. Mange store kvindelige hummere, såsom dem, der udtages prøver af i vores offshore delmængde kan gyde i på hinanden følgende år uden molting og remating 16.

Flere fertilizations bruger samme spermatophore kan i sidste ende resultere i en opdeling af plug materiale og kan bruge op sæden er indeholdt i receptacle, hvilket giver et negativt resultat. Den mekaniske opdeling af sperm stik gennem tiden har ikke, at vores viden, er blevet beskrevet Dog. Endelig er det muligt, at disse kvinder uden sædceller i deres beholdere var ude af stand til at finde en mage. Skæve kvindelige køn nøgletal er dokumenteret i George Bank hummer lager 17, og muligheden for, at dette fører til sperm begrænsning fortjener yderligere opmærksomhed på grund af de potentielle konsekvenser for den reproduktive output af hummer befolkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke alle New England kommercielle lobstermen hvis både vi fik lov til at prøve fra - deres samarbejde er meget værdsat. Desuden takker vi Little Bay Lobster Company (Newington, NH) og Champlin Seafood (Point Judith, RI) som tilladt os at foretage stikprøver på deres faciliteter. De følgende UNH studerende uvurderlig bistand i hele denne undersøgelse: Haley Hvid, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, og maj Grose. Dette projekt blev støttet af tilskud fra NH SeaGrant til WHW (projekt # R/CFR-11) og en UNH Marine Program Grant til JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. Available from: http://www.fao.org (2012).
  2. MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
  3. Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
  4. Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
  5. Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
  6. Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
  7. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
  8. Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
  9. Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
  10. Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
  11. Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
  12. Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
  13. Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. Academic Press. NY. 177-216 (1995).
  14. Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
  15. Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
  16. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
  17. Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. Washington, D.C. (2009).
En noninvasiv metode til<em&gt; In situ</em&gt; Bestemmelse af Parring Succes i kvindelig amerikansk Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter