Summary
-Visserij-geïnduceerde veranderingen om uitgebuit schaaldier visserij, zoals de Amerikaanse kreeft visserij, kan mogelijk invloed hebben op hun reproductieve dynamiek, wat leidt tot een vermindering van de paring succes. Het doel van deze studie was om een niet-invasieve methode voor het vaststellen van de paring succes van vrouwelijke kreeften die fysiologisch of functioneel volwassen kunnen ontwikkelen.
Abstract
Ondanks het feit dat een van de meest productieve visserij in het noordwestelijk deel van de Atlantische Oceaan, er nog veel onbekend is over de natuurlijke voortplanting dynamiek van Amerikaanse kreeften. Recent werk in uitgebuit schaaldieren populaties (krabben en kreeften) suggereert dat er omstandigheden zijn waarin volwassen vrouwtjes in staat zijn om hun volledige potentieel te bereiken reproductieve vanwege sperma beperking. Om deze mogelijkheid in verschillende gebieden van de Amerikaanse kreeft visserij onderzoeken, werd een betrouwbare en niet-invasieve methode ontwikkeld voor het bemonsteren van grote aantallen vrouwelijke kreeften op zee. Deze werkwijze omvat het plaatsen van een stompe getipt naald in de vrouwelijke vruchtbare houder om de aanwezigheid of afwezigheid van een sperma plug bepalen en een monster dat kan worden onderzocht op de aanwezigheid van sperma trekken. Een reeks control studies werden uitgevoerd bij het dok en in het laboratorium om de betrouwbaarheid van deze techniek te testen. Deze inspanningen meebrengt bemonstering 294 vrouwelijke kreeften te bevestigen dat de aanwezigheid ofa sperma plug was een betrouwbare indicator van sperma binnen de houder en dus paring. Dit document beschrijft de methodologie en de resultaten van een subset van de totale vrouwelijke bemonsterde resultaten. Van de 230 vrouwelijke kreeften bemonsterd uit George's Bank en Cape Ann, MA (grootte range = 71-145 mm in lengte van de schaal), 90,3% waren positief voor sperma. Mogelijke verklaringen voor het ontbreken van zaadcellen in sommige vrouwen zijn onder andere: onvolwassenheid (gebrek aan fysiologische rijpheid), afbraak van het sperma stekker na gebruik om een koppeling van eieren bevruchten, en gebrek aan paring activiteit. De onderzoeken geven aan dat deze techniek voor de behandeling van de paarsucces vrouwelijke kreeften is een betrouwbare proxy die kan worden gebruikt in het veld tot reproductieve activiteit documenteren natuurlijke populaties.
Introduction
Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) is een van de meest productieve visserij in de Noord-Atlantische Oceaan (~ 56.000 mt in 2011, ter waarde van meer dan $ 390.000.000) 1. Echter, er is een algemeen gebrek aan begrip over de reproductieve dynamiek van deze soort in het wild levende populaties. Het genereren van meer nauwkeurige schattingen van de reproductieve output, zoals het aantal en grootte van individuen die actief deelnemen aan de voortplanting, kan de evaluatie van de visstand te verbeteren. Zo hebben vrouwen die verhinderd zijn hun volledige reproductieve potentieel bereiken als gevolg van sperma beperking is geïdentificeerd als een zorg voor verschillende commercieel geëxploiteerde mariene schaaldieren inclusief: langoesten 2, blauwe krabben 3, koning krabben 4, steen krabben 5, en sneeuw krabben 6. Het algemene doel is om te bepalen of sperma beperking een factor zou kunnen zijn in bepaalde gebieden van de Amerikaanse kreeft visserij ook.
nt '> De eerste tekenen van een mogelijke beperking sperma probleem kreeften waargenomen tijdens het uitvoeren van een onafhankelijke tagging studie met eierdragende vrouwelijke kreeften (met zichtbaar intacte onlangs geëxtrudeerd eieren). Herover rapporten van vissers aangegeven dat ~ 15% van deze dieren was gedaald hun ei klauwen na slechts 1-2 maanden. De werkhypothese was dat sommige kreeften werden met eieren die niet was bevrucht en, als gevolg daarvan, 'viel' 7. Voorlopige gegevens van een volgende studie hebben het feit bevestigd dat kreeften zal extrusie van eieren zelfs als ze niet met succes gekoppeld en deze onbevruchte eitjes worden alleen uitgevoerd voor ~ 1 maand 8. Daarom, gezien de constatering van de vrouwen het dragen van onbevruchte eitjes in natuurlijke populaties, we gevraagd om te bepalen in welke mate sperma beperking zouden kunnen bijdragen aan een submaximale niveau van reproductie door seksueel volwassen kreeften. Om dit doel te bereiken, werd een techniek ontwikkeld om de spermato detecterenPhore afgezet door mannetjes tijdens de paring.Dit document en video beschrijven een niet-invasieve, eenvoudige methode ontwikkeld voor het bepalen van de paring succes van vrouwelijke kreeften. De techniek kan snel en betrouwbaar worden gebruikt op zee, hetzij aan boord van onderzoek of commerciële vissersvaartuigen. De details van deze bemonsteringsmethode en enkele representatieve resultaten worden aan de toepassing van de techniek illustreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deel A: Het gebied Sampling Techniek
1. Vrouw Metingen
- Voor elk vrouwtje kreeft, meet de lengte van de schaal (CL) en de breedte van de tweede abdominale segment van de dichtstbijzijnde 1,0 mm met een paar beugels.
OPMERKING: De tweede abdominale segment wordt gemeten omdat de breedte van de buik (waar vrouwtjes dragen hun eieren) is een indicator van seksuele rijpheid. Daarnaast kan het voordelig zijn om na te gaan de rui podium om later overeenkomen deze gegevens met reproductieve stadium (zie stap 1.2). - Clip een kleine distale deel van een van de abdominale pleopods (een standaard methodologische protocol kreeften) en bewaar de pleopod in schoon zeewater om later te bekijken met een dissectiemicroscoop 9.
OPMERKING: Deze stap kan ook de aanwezigheid van cement klieren op de pleopods, wat een indicatie is dat vrouwen zich voorbereiden op hun eieren 10 extruderen zijn onthullen.
2. Naald Insertion
- Steek de naald (18 G, zie tabel 1) ~ 1 cm in de rudimentaire bakje, schuin in de richting van de staart bij ~ 45 ° (figuur 1).
Opmerking: In kreeften met intacte sperma pluggen, kan de naald weerstand ontmoeten tijdens inbrengen, aangezien het wordt geduwd door het sperma plug vóór het bereiken van de hoogste concentratie van sperma aan de onderkant van de rudimentaire houder (fig. 1).
NB: De aanwezigheid van de stekker, op zich, is een betrouwbare indicator die kreeften hebben gepaard. In sommige dieren is er mogelijk weinig weerstand zijn, possibly omdat er geen spermatofoor aanwezig is, de spermatofoor klein is, is het nog steeds niet in een plug gehard, of het kan zijn al gebruikt om een of meer legsels bevruchten.
Figuur 1. Naald inbrengen en uitzicht op kreeft rudimentaire bakje. Plaatsen van de stompe getipt naald in de rudimentaire vergaarbak van de kreeft op een sperma monster te behandelen. De hoek en diepte van de naald zijn beide van cruciaal belang voor het verkrijgen van consistente monsters. Rechts: Mening van een rudimentaire vergaarbak die is ontleed en verticaal gesplitst. Het sperma plug neemt de bovenste of buitenste deel van de houder, terwijl de spermatozoa zich onderaan (diepste punt) van de houder. Het is belangrijk op te merken dat de bemonstering op deze diepte de houder kan lek raken en resulteren in een bloed-verontreinigd monster. Klik hier voor grotere afbeelding .
3. Penetreren van de Sperma Plug
- Na de eerste insertie, steiler de hoek van de naald bijna verticale (loodrecht op de lichaamsas), en zeer langzaam beginnen te werkennaar beneden in de houder.
- Houd de naald gekanteld staat in een hoek, zodat de punt iets gericht is naar de staart. In dit geval wordt de naaldpunt wordt samendrukken van de bovenkant van de plug, totdat het uiteindelijk dringt in de matrix.
- Langzaam blijven duwen de naald naar beneden tot weerstand nogmaals wordt gevoeld - dit is de bodem van het bakje en waar het monster is genomen.
4. Sperma Removal
- Verwijder een monster (vaak met expander materiaal vloeibaar sperma en andere vloeistof) vanaf de onderkant van de houder en breng de monster in een gelabelde 2,0 ml plastic buis.
- Spoel het bakje met ~ 0,1-0,5 ml koud zeewater.
- Verwijder ongeveer 0,3 ml vloeistof en in dezelfde buis.
- WINKEL sperma monsters op ijs tot zij in het laboratorium onderzocht.
Deel B: Onderzoek van sperma monsters in het lab
OPMERKING: Monsters uit de rudimentaire houders van de individuele l obsters moeten worden onderzocht om te bepalen of zaadcellen aanwezig of afwezig waren. - Verwijder ~ 50 ul van vloeistof van elke plastic buis plaats op een glasplaatje met een dekglas en aanzicht 100x met een samengestelde microscoop.
- Score monsters: sperma schaars, talrijk, of afwezig is (deze studie niet gekwantificeerd werkelijke aantal zaadcellen, figuur 2).
Figuur 2. Kreeft spermastaal beelden. Beelden van kreeft sperma monsters genomen van rudimentaire vergaarbak van een vrouw, zoals gezien met een samengestelde microscoop bij 40x vergroting. Afbeelding aan de linkerkant toont een voorbeeld dat veel sperma bevatte, terwijl de andere (rechts) toont een spaarzame monster (schaal bar = 10 micrometer).. Jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier vermelde gegevens zijn voor een subset van vrouwelijke kreeften die ontstaan uit zowel nearshore en offshore locaties. De nearshore groep bestond uit 44 kreeften die zijn gevangen in de kustwateren in de buurt van Cape Ann, Massachusetts en vervoerd koelers naar het laboratorium voor onderzoek. Een totaal van 186 offshore-kreeften werden gevangen op George's Bank en bemonsterd met een commercieel bedrijf faciliteit in New Hampshire.
Sperma monsters werden verkregen van alle dieren alsmede van de aanwezigheid of afwezigheid van sperma direct onderzocht volgens de werkwijzen hierboven beschreven. Een totaal van 90,3% van alle vrouwen in deze subgroep had sperma in hun rudimentaire vaten. Verrassenderwijs die sperma ontbrak niet noodzakelijkerwijs aan het kleinere uiteinde van de orde van grootte (figuur 3).
ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 3. Bemonsteringsresultaten aanwezigheid van sperma in kreeften. Percentage vrouwelijke kreeften in 5 mm CL grootteklasse bakken die sperma hadden in hun rudimentaire houders (percentage positieve) als indicator van de paring. Teven werden gevangen uit wateren in de buurt van Cape Ann, MA (71-83 mm CL) en van George's Bank (89-154 mm CL). Nummers binnen staven geven de totale steekproef voor die bak. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video en papier omtrek en tonen een werkwijze voor het bepalen of vrouwelijke kreeften succes gedekt. Deze benadering is eenvoudig genoeg dat het kan worden gebruikt voor grootschalige bemonstering van kreeften op zee door verschillende gebruikers. De methode is gebaseerd op het detecteren van de aanwezigheid van een spermatofoor in de rudimentaire vergaarbak die wordt doorgegeven van man naar vrouw kreeften tijdens de paring. Deze spermatoforen gedeeltelijk verharden tot een zaadcel plug kort nadat ze zijn afgezet in de houder, dus de aanwezigheid van sperma plug wijst eveneens paarsucces. In deze studie, en een volgende grotere studie werd vastgesteld dat de meeste sperma pluggen had sperma daarmee verbonden 11. Echter, terwijl de aanwezigheid van een plug is een betrouwbare indicator van de paring activiteit, de afwezigheid daarvan niet.
Hoewel we niet helemaal zeker kan zijn als deze bemonsteringsmethodologie loopt een negatief effect op het vermogen van de vrouwelijke kreeften een paaiend succes bevruchten hun ei koppeling, zijn er aspecten aan dit sperma sampling protocol die suggereren dat de schade minimaal tot ofwel de spermatofoor of de houder zou zijn. Er zijn gegevens (lopende laboratoriumstudies) dat sommige kreeften, post-sperma sampling nog extruderen bevruchte legsels (n = 3) en kunnen bevruchten meer dan een legsel met dezelfde spermatofoor geven. Deze eitjes ontwikkelen en uitkomen op dezelfde wijze als kreeften die niet zijn bemonsterd. Daarnaast is deze steekproeftechniek dient slechts een kleine fractie van de totale sperma proeven. Het is niet bedoeld om kwantitatief proeven van de volledige inhoud van een houder. Vanwege de complexe fysieke architectuur van de houder 12,13, zou een andere techniek (zoals dissectie) verplicht dat soort resultaten.
Sperma werd gevonden in een aantal bemonsterde dieren die een sperma plug ontbrak, mogelijk omdat de spermatofoor was relatief nEW, en nog niet verhard tot een stekker, of de spermatofoor was eerder gebruikt om een of meer legsels bevruchten en was verslechterd. Teneinde de meest nauwkeurige index van paarsucces verkrijgen is belangrijk voor zowel controle voor sperma plug en monster sperma.
Nauwkeurige oriëntatie van de naald tijdens de bemonstering procedure is van cruciaal belang om verschillende redenen. Eerst verzekeren dat de naald parallel aan het zijlichaam vliegtuig belet penetreren van de dunne kant van de rudimentaire houder. Als de techniek goed wordt uitgevoerd, veroorzaakt geen mortaliteit, als de naald niet dringen door de lichaamsholte. Ten tweede, de 45 ° insteekhoek, gevolgd door een steiler de naald, zorgt ervoor dat de naald de bodem van de opvangbak waar de zaadcellen geconcentreerd zonder penetreren van de wand van de spermatofoor en invoeren van het aangrenzende lichaam sinus (figuur 1) reikt .
13. Zodra het sperma hebben gereageerd, ze beginnen af te breken in het monster en moeilijk te identificeren zijn. Daarom moet roeren van het monster flesjes tot een minimum worden beperkt. Houd de monsters koel lijkt ook de integriteit van de zaadcellen behouden. Tenslotte wordt voorgesteld om steriel zeewater gebruikt als monster verwerking. Dit kan handelen om de groei van bacteriën en andere micro-organismen (in 36-48 uur) dat het sperma kunnen beschadigen minimaliseren.
Most (90,3%) van de vrouwelijke kreeften bemonsterd met succes gekoppeld, gebaseerd op de aanwezigheid van sperma in de rudimentaire houders. De rest van de dieren misschien niet sperma positief zijn geweest omdat ze ofwel waren niet geslachtsrijp, hun sperma stekkers had in de tijd verslechterd of gehaden volledig gebruikt om een of meer legsels bevruchten, of hadden ze nog nooit gedekt, mogelijk omdat ze nooit een geschikte man aangetroffen op het juiste moment in hun molt cyclus 11. Vrouwelijke kreeften in de George's Bank regio hebben een relatief grote omvang-bij-de vervaldag, met slechts 50% van de vrouwen rijpen op 100 mm 14. Cape Ann vrouwtjes volwassen op een iets kleiner formaat dan doen de offshore kreeften, met 50% van de vrouwen rijpen bij 90 mm CL 15. Aangezien volgens de kleinste wijfjes waren 71 mm CL, is het niet onredelijk om te suggereren dat sommige vrouwen ontbreken sperma stekkers waren waarschijnlijk onvolwassen en derhalve ook niet gedekt. Veel grote vrouwelijke kreeften, zoals die zijn bemonsterd in onze offshore subgroep, kan paaien in opeenvolgende jaren zonder rui en remating 16.
Meerdere bevruchtingen met dezelfde spermatofoor kan uiteindelijk resulteren in een uitsplitsing van de stekker materiaal en kunnen gebruik maken van de zaadcellen in het receptacle, waardoor een negatief resultaat. Echter, de mechanische afbraak van het sperma stekker na verloop van tijd niet, voor zover wij weten, zijn beschreven. Tenslotte is het mogelijk dat deze vrouwen geen sperma in hun houders konden een partner vinden. Scheve vrouwelijk geslacht verhoudingen zijn gedocumenteerd in de George's Bank kreeft voorraad 17, en de mogelijkheid dat dit leidt tot sperma beperking verdient nadere aandacht vanwege de mogelijke gevolgen voor de reproductieve output van de kreeft bevolking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle New England commerciële lobstermen wiens boten mochten we proeven van dank - hun medewerking wordt zeer gewaardeerd. Daarnaast danken wij Little Bay Lobster Company (Newington, NH) en Champlin's Seafood (Point Judith, RI) die liet ons toe om steekproeven uit te voeren bij hun faciliteiten. De volgende UNH studenten van onschatbare waarde hulp in deze studie: Haley Wit, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, en mei Grose. Dit project werd ondersteund door subsidies van NH SeaGrant tot WHW (project # R/CFR-11) en een UNH Marine Program Grant JSG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calipers | Mitutoyo Digimatic | 500-196-20 | http://www.globalindustrial.com |
| 3 ml Luer-Lok syringe | Beckton-Dickinson | 309585 | www.bd.com |
| Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 | Webster Veterinary | 8881202348 | www.mywebstervet.com |
| 2.0 ml Plastic storage tubes | Eppendorf | wu-06333-72 | http://www.coleparmer.com |
| Styrofoam cooler with ice | |||
| Compound light microscope | Olympus | BH System | http://www.olympusamerica.com |
| Glass sides with cover slip | 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness | ||
| Pipettor with disposable tips |
References
- FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. , Available from: http://www.fao.org (2012).
- MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
- Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
- Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
- Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
- Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. , Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
- Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
- Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
- Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
- Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
- Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
- Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. , Academic Press. NY. 177-216 (1995).
- Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
- Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
- Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. , Washington, D.C. (2009).
