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Une méthode non invasive pour doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Les changements induits par la pêche-à pêche de crustacés exploités, comme la pêche au homard américain, pourraient influer sur leur dynamique de reproduction, conduisant à une réduction dans le succès de l'accouplement. L'objectif de cette étude était de développer une méthode non invasive pour déterminer le succès d'accouplement des homards femelles qui peuvent être physiologiquement ou fonctionnellement mature.

Abstract

En dépit d'être l'une des pêches les plus productives de l'Atlantique Nord-Ouest, il reste encore beaucoup sur la dynamique de reproduction naturelle de homards américains. Des travaux récents dans les populations de crustacés exploités (crabes et homards) suggère qu'il existe des circonstances où les femelles matures sont incapables d'atteindre leur potentiel de reproduction complet en raison de la limitation de sperme. Pour examiner cette possibilité dans les différentes régions de la pêche au homard, une méthode fiable et non invasive a été développé pour échantillonner un grand nombre de femelles homards en mer. Ce procédé consiste à insérer une aiguille à pointe arrondie dans le réceptacle séminal de la femelle pour déterminer la présence ou l'absence d'un bouchon de spermatozoïdes et de retirer un échantillon qui peut être examinée pour la présence de spermatozoïdes. Une série d'études de contrôle ont été menées sur le quai et dans le laboratoire pour tester la fiabilité de cette technique. Ces efforts ont entraîné échantillonnage 294 homards femelles pour confirmer que la présence ofa fiche de sperme était un indicateur fiable de spermatozoïdes dans le réceptacle et donc, l'accouplement. Ce document détaille la méthodologie et les résultats obtenus à partir d'un sous-ensemble de l'ensemble des femmes de l'échantillon. Parmi les 230 homards femelles prélevées dans le banc Georges et Cape Ann, MA (gamme de taille = 71 à 145 mm de longueur de carapace), 90,3% étaient positifs pour le sperme. Explications possibles de l'absence de spermatozoïdes dans certaines femelles comprennent: l'immaturité (manque de maturité physiologique), la répartition de la prise de sperme après avoir été utilisé pour fertiliser une couvée d'oeufs, et le manque d'activité de l'accouplement. Les enquêtes indiquent que cette technique pour examiner le succès d'accouplement des femelles homards est un indicateur fiable qui peut être utilisé dans le domaine de documenter l'activité de reproduction dans les populations naturelles.

Introduction

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Homard d'Amérique (Homarus americanus) est l'une des pêches les plus productives de l'Atlantique Nord (~ 56 000 tonnes en 2011, d'une valeur plus de 390 millions $) 1. Cependant, il ya un manque général de compréhension en ce qui concerne la dynamique de reproduction de cette espèce dans les populations sauvages. Produire des estimations plus précises de la reproduction, y compris le nombre et la taille des individus participant activement à la reproduction, peut améliorer le processus d'évaluation des stocks. Ainsi, les femelles qui sont empêchés de réaliser leurs potentialités reproductives raison de limitation de spermatozoïdes ont été identifiés comme une inquiétude pour plusieurs de crustacés marines exploitées commercialement, notamment: langoustes de 2, crabes bleus 3, crabes royaux 4, crabes 5 et crabes des neiges 6. L'objectif global est de déterminer si la limitation de sperme pourrait être un facteur dans certaines régions de la pêche au homard américain ainsi.

nt "> Les premiers signes d'un problème potentiel de limitation du sperme chez les homards ont été observés pendant la conduite d'une étude de marquage sans rapport avec les homards femelles ovigères (avec des oeufs visiblement intactes, récemment extrudés). Récupération des rapports de pêcheurs a indiqué que ~ 15% de ces animaux avait chuté leurs couvées après seulement 1-2 mois. L'hypothèse de travail est que certains homards portaient des oeufs qui n'ont pas été fécondés et, par conséquent, «tombé» 7. données préliminaires d'une étude qui a suivi ont confirmé le fait que les homards extruder des oeufs, même si elles ne sont pas accouplés avec succès et ces œufs non fécondés ne sont effectués pour ~ 1 mois 8. Par conséquent, compte tenu de l'observation des femelles portant des oeufs non fécondés dans les populations naturelles, nous avons cherché à déterminer la mesure dans laquelle la limitation de sperme pourrait contribuer à un niveau sous-maximal de reproduction par homards sexuellement matures. Pour atteindre cet objectif, une technique a été développée pour détecter la spermatophore déposé par les hommes pendant l'accouplement.

Ce papier et vidéo décrivent une méthode simple non invasif développé pour déterminer le succès d'accouplement des femelles homards. La technique peut être utilisée rapidement et de façon fiable à la mer, soit à bord de la recherche ou des navires de pêche commerciale. Les détails de ce procédé de prélèvement, ainsi que quelques résultats représentatifs sont présentés pour illustrer l'application de la technique.

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Protocol

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Partie A: Domaine Technique d'échantillonnage

Une. Mesures femmes

  1. Pour chaque homard femelle, mesurer la longueur de la carapace (CL) et la largeur de la deuxième segment abdominal à la plus proche de 1,0 mm en utilisant une paire d'étriers.
    NOTE: Le deuxième segment abdominal est mesurée parce que la largeur de l'abdomen (où les femmes portent des œufs) est un indicateur de la maturité sexuelle. En outre, il pourrait être avantageux de déterminer le stade de la mue pour correspondre à plus tard ces données avec le stade de la reproduction (voir l'étape 1.2).
  2. Couper une petite partie distale de l'un des pléopodes abdominaux (un protocole méthodologique standard homards) et stocker l'eau de mer propre dans pleopod pour les visionner plus tard avec un microscope de dissection 9.
    REMARQUE: Cette étape peut également révéler la présence de glandes de ciment sur ​​les pléopodes, qui sont une indication que les femmes se préparent à extruder leurs œufs 10.

2. Aiguille Insertion

  1. Insérez l'aiguille de la seringue (18 G, voir le tableau 1) ~ 1 cm dans le réceptacle séminal, inclinées vers la queue à 45 ° ~ (figure 1).
    NOTE: Dans les homards avec des bouchons de spermatozoïdes intacts, l'aiguille peut rencontrer une certaine résistance lors de l'insertion, comme il est poussé à travers le bouchon de sperme avant de parvenir à la plus forte concentration de sperme au fond de la réceptacle séminal (Figure 1).
    NOTE: La présence de la fiche, en soi, est un indicateur fiable que les homards se sont accouplés. Chez certains animaux, il peut y avoir peu de résistance, peut-être parce que personne ne spermatophore est présent, le spermatophore est petit, il n'a pas encore durci dans un bouchon, ou il peut avoir déjà été utilisé pour féconder un ou plusieurs couvées.

Figure 1 Figure 1. insertion de l'aiguille et vue de homard réceptacle séminal. place de l'aiguille pointe arrondie dans le réceptacle séminal de la langouste pour extraire un échantillon de sperme. L'angle et la profondeur de l'aiguille sont à la fois critique d'obtenir des échantillons homogènes. Droite: Vue d'un réceptacle séminal qui a été disséqué et partagée verticalement. Le bouchon de sperme occupe la partie supérieure ou plus à l'extérieur du récipient, tandis que les spermatozoïdes sont situés dans le bas (du point le plus profond) du récipient. Il est important de noter que l'échantillonnage en dessous de cette profondeur peut percer le récipient et entraîner dans un échantillon de sang contaminé. Cliquez ici pour agrandir l'image .

3. Pénétrant Plug sperme

  1. Après l'insertion initiale, s'accentuer l'angle de l'aiguille à presque verticale (perpendiculaire à l'axe du corps), et très lentement commencer à travaillervers le bas dans le réceptacle.
  2. Gardez l'aiguille inclinée à un angle de sorte que la pointe est dirigée légèrement vers la queue. Dans ce cas, la pointe de l'aiguille est la compression de la partie supérieure du bouchon, jusqu'à ce qu'elle pénètre finalement dans la matrice.
  3. Continuer à pousser lentement l'aiguille vers le bas jusqu'à sentir une résistance, une fois de plus - ce qui est le fond du récipient et où l'échantillon est prélevé.

4. Retrait sperme

  1. Prélever un échantillon (souvent solide de matériau de bouchon, le sperme et le liquide d'un autre fluide) à partir du fond du récipient et au dépôt de l'échantillon dans un tube en plastique de 2,0 ml étiqueté.
  2. Rincer le récipient avec ~ 0.1-0.5 ml d'eau de mer froide.
  3. Enlevez environ 0,3 ml de liquide et le placer dans le même tube.
  4. des échantillons de sperme de magasin sur la glace jusqu'à ce qu'ils puissent être examinés dans le laboratoire.
    Partie B: Examen des échantillons de sperme dans le laboratoire
    NOTE: Les échantillons retirés des réceptacles séminaux de l individu obsters devraient être examinés afin de déterminer si les spermatozoïdes étaient présents ou absents.
  5. Retirer ~ 50 pi de liquide de chaque tube en plastique, placer sur une lame de verre avec une lamelle, et vue à 100X avec un microscope composé.
  6. Note échantillons: sperme rares, nombreux, ou absent (cette étude n'a pas quantifié le nombre de spermatozoïdes réels, figure 2).

Figure 2
Figure 2. Images d'échantillons de homard de sperme. Images d'échantillons de sperme prélevés homard de réceptacle séminal de la femelle, comme vu avec un microscope composé à grossissement de 40X. L'image à gauche montre un échantillon qui contenait de nombreux sperme tandis que l'autre (à droite) illustre un échantillon bien maigre (barre d'échelle = 10 pm).Jpg "target =". _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Representative Results

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Les données présentées ici sont pour un sous-ensemble de homards femelles qui proviennent à la fois du littoral et les centres offshore. Le groupe de nearshore composée de 44 homards qui ont été capturés dans les eaux côtières près de Cape Ann, Massachusetts et transportés dans des glacières au laboratoire pour examen. Un total de 186 homards en mer ont été capturés sur le banc Georges et échantillonné à un centre de détention commercial dans le New Hampshire.

Des échantillons de sperme ont été obtenus à partir de tous les animaux et immédiatement examinés pour la présence ou l'absence de sperme selon des méthodes décrites ci-dessus. Un total de 90,3% de toutes les femmes de ce sous-ensemble avait du sperme dans leurs réceptacles séminaux. De manière surprenante, ceux qui manquait spermatozoïdes sont pas nécessairement à l'extrémité inférieure de la gamme de taille (figure 3).

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Figure 3. Les résultats d'échantillonnage pour la présence de sperme dans les homards. Pourcentage des homards femelles dans 5 bacs mm de taille de CL de classe qui avaient sperme dans leurs réceptacles séminaux (pourcentage positif) comme un indicateur de l'accouplement. Les femelles ont été capturés dans les eaux près de Cape Ann, MA (71-83 mm CL) et de la Banque de George (89-154 mm CL). Chiffres dans les barres représentent la taille totale de l'échantillon pour que Ben. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

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Cette vidéo et papier contour et démontrer une méthode pour déterminer si les homards femelles se sont accouplés avec succès. Cette approche est suffisamment simple pour qu'il puisse être utilisé pour l'échantillonnage à grande échelle de homards en mer par une variété d'utilisateurs. La méthode est basée sur la détection de la présence d'un spermatophore dans le réceptacle séminal qui est passée du sexe masculin au homards femelles pendant l'accouplement. Ces spermatophores durcissent partiellement dans un bouchon de sperme peu de temps après ils sont déposés dans le récipient; donc, la présence d'un bouchon de sperme est également un signe de succès de l'accouplement. Dans cette étude, ainsi que d'une plus grande étude ultérieure, on a déterminé que la plupart des bouchons de sperme ont spermatozoïdes qui leur sont associés 11. Toutefois, bien que la présence d'un bouchon est un indicateur fiable de l'activité de l'accouplement, son absence est pas.

Bien que nous ne pouvons pas être tout à fait certain si cette méthode d'échantillonnage entraîne un effet négatif sur la capacité des homards femelles à frayer und féconder leur accouplement des oeufs, il ya des aspects de ce protocole sperme échantillonnage qui suggèrent que les dommages seraient minimes soit le spermatophore ou le récipient. Il existe des données (à partir d'études de laboratoire en cours) qui indiquent des homards, post-sperme échantillonnage, extruder encore embrayages fécondés d'œufs (n = 3) et sont capables de féconder plus d'une couvée d'oeufs en utilisant le même spermatophore. Ces oeufs se développent et éclosent similaire à homards qui n'ont pas été échantillonnées. En outre, cette technique d'échantillonnage ne sert à prélever une faible fraction du total de spermatozoïdes. Il n'est pas destiné à échantillonner quantitativement le contenu complet d'un récipient. En raison de l'architecture physique complexe du récipient 12,13, une technique différente (par exemple de dissection) serait nécessaire pour obtenir ce genre de résultats.

Le sperme a été trouvé dans un certain nombre d'animaux échantillonnés qui ne disposaient pas d'une prise de sperme, peut-être parce que le spermatophore était relativement new, et n'avait pas encore durci dans un bouchon, ou le spermatophore avait déjà été utilisé pour féconder un ou plusieurs pontes et s'était détériorée. Par conséquent, afin d'obtenir l'indice le plus précis de la réussite de l'accouplement, il est important à la fois pour l'enregistrement d'une fiche de sperme et de l'échantillon de sperme.

L'orientation exacte de l'aiguille au cours de la procédure d'échantillonnage est critique pour plusieurs raisons. En premier lieu, en assurant que l'aiguille est parallèle au plan de l'organe latéral empêche de pénétrer dans le côté mince du réceptacle séminal. Lorsque la technique est effectuée correctement, elle ne provoque aucune mortalité, en tant que l'aiguille pénètre jamais réellement la cavité du corps. Deuxièmement, l'angle de 45 ° d'insertion, suivie par une accentuation de l'aiguille, permet de s'assurer que l'aiguille atteigne le fond du récipient où les spermatozoïdes sont concentrés sans pénétrer dans la paroi du spermatophore et entrant dans le sinus de corps adjacente (Figure 1) .

13. Une fois le sperme ont réagi, ils commencent à se décomposer dans l'échantillon et devenir difficile à identifier. Pour cette raison, l'agitation des flacons d'échantillon doit être maintenu à un minimum. Garder les échantillons refroidir apparaît également pour aider à préserver l'intégrité du sperme. Enfin, il est suggéré d'utiliser l'eau de mer stérile lors du traitement de l'échantillon. Cela peut agir pour réduire la croissance des bactéries et d'autres micro-organismes (plus de 36-48 heures) qui pourraient nuire aux spermatozoïdes.

La plupart (90,3%) des homards femelles échantillonnées avaient accouplés avec succès, sur la base de la présence de sperme dans leurs réceptacles séminaux. Le reste des animaux pourrait ne pas avoir été sperme positif, soit parce qu'ils étaient sexuellement immatures, leurs prises de sperme se sont détériorées au fil du temps ou être eufr entièrement utilisés pour fertiliser une ou plusieurs pontes, ou qu'ils n'avaient jamais accouplés, peut-être parce qu'ils n'ont jamais rencontré un homme approprié au bon moment dans leur cycle de mue 11. Homards femelles dans la région de la Banque de George ont une taille relativement grande à la maturité, avec seulement 50% des femmes d'âge mûr à 100 mm 14. Cape Ann femelles atteignent la maturité à une taille légèrement plus petite que ne le font les homards en mer, avec 50% des femmes d'âge mûr à 90 mm ​​CL 15. Par conséquent, étant donné que les petites femelles étaient de 71 mm CL, il n'est pas déraisonnable de penser que certaines des femmes qui n'ont pas les bouchons de sperme étaient probablement immature et donc, n'aurait pas accouplés. Beaucoup de grands homards femelles, tels que ceux échantillonnés dans notre sous-ensemble au large des côtes, peuvent engendrer dans les années consécutives sans mue et remating 16.

Fécondations multiples utilisant le même spermatophore peuvent éventuellement provoquer une rupture de la matière de prise et peuvent utiliser le sperme contenu dans le receptacle, ce qui donne un résultat négatif. Cependant, la ventilation mécanique de la prise de spermatozoïdes dans le temps n'a pas, à notre connaissance, été décrite. Enfin, il est possible que ces femmes sans sperme dans leurs récipients ont été incapables de trouver un compagnon. Rapports de sexe asymétriques ont été documentés dans le homard Banque des actions de la George 17, et la possibilité que cela conduit à une limitation de sperme mérite une plus grande attention en raison des conséquences potentielles pour la sortie de la reproduction de la population de homard.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier tous les pêcheurs de homard de la Nouvelle Angleterre commerciales dont les bateaux nous ont permis d'échantillonner - leur coopération est très appréciée. En outre, nous remercions Little Bay Lobster Company (Newington, NH) et fruits de mer de Champlin (Point Judith, RI) qui nous a permis de procéder à un échantillonnage à leurs installations. Les étudiants UNH suivantes ont fourni une aide précieuse tout au long de cette étude: Haley Blanc, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, et mai Grose. Ce projet a été financé par des subventions NH Seagrant à WHW (projet # R/CFR-11) et une subvention du programme UNH Marine à JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

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References

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Une méthode non invasive pour<em&gt; In situ</em&gt; Détermination du succès de l&#39;accouplement chez les femelles homards américains (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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