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Um método não invasivo para doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Mudanças induzidas pela pesca para a pesca de crustáceos explorados, tais como a pesca de lagosta americano, poderia influenciar a sua dinâmica reprodutiva, levando a uma redução no sucesso de acasalamento. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método não invasivo para determinar o sucesso de acasalamento de lagostas fêmeas que podem ser fisiologicamente ou funcionalmente maduro.

Abstract

Apesar de ser uma das mais produtivas da pesca no Noroeste do Atlântico, muito permanece desconhecido sobre a dinâmica reprodutiva naturais de lagostas americanas. Trabalhos recentes em populações de crustáceos exploradas (caranguejos e lagostas) sugere que há circunstâncias em que fêmeas maduras não são capazes de alcançar o seu pleno potencial reprodutivo, devido à limitação do esperma. Para examinar esta possibilidade em diferentes regiões da pesca de lagosta americano, um método confiável e não invasivo foi desenvolvido para provar um grande número de lagostas fêmeas no mar. Este método envolve a inserção de uma agulha de ponta romba no receptáculo seminal da fêmea para determinar a presença ou ausência de um tampão de espermatozóides e para retirar uma amostra que pode ser examinada para a presença de esperma. Uma série de estudos de controle foram realizados no cais e no laboratório para testar a confiabilidade desta técnica. Estes esforços de amostragem envolveu 294 lagostas fêmeas para confirmar que a presença oplugue esperma fa era um indicador confiável de esperma dentro do recipiente e assim, o acasalamento. Este documento detalha a metodologia e os resultados obtidos a partir de um subconjunto da totalidade da amostra fêmeas. Dos 230 lagostas fêmeas amostradas de Banco de George e Cape Ann, MA (intervalo size = 71-145 mm de comprimento da carapaça), 90,3% foram positivas para o esperma. Explicações potenciais para a ausência de espermatozóides em algumas fêmeas incluem: imaturidade (falta de maturidade fisiológica), avaria da tomada de esperma depois de ser utilizado para fertilizar uma ninhada de ovos, e falta de atividade de acasalamento. As pesquisas indicam que esta técnica para analisar o sucesso de acasalamento de lagostas do sexo feminino é um proxy confiável que pode ser usado no campo para documentar atividade reprodutiva em populações naturais.

Introduction

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Lagosta americana (Homarus americanus) é uma das pescas mais produtivas do Atlântico Norte (~ 56 mil toneladas em 2011, avaliado em mais de $ 390000000) 1. No entanto, há uma falta geral de compreensão sobre a dinâmica reprodutiva da espécie em populações selvagens. Gerando estimativas mais precisas de produção reprodutiva, incluindo o número e tamanho de indivíduos participando ativamente na reprodução, pode melhorar o processo de avaliação de estoque. Por exemplo, as mulheres que são impedidos de alcançar seu pleno potencial reprodutivo, devido à limitação do esperma foram identificados como uma preocupação para vários crustáceos marinhos explorados comercialmente incluindo: lagostas, caranguejos azuis 2 3, rei caranguejos 4, caranguejos de pedra 5 e caranguejos da neve 6. O objetivo geral é determinar se a limitação de esperma pode ser um fator em certas regiões da pesca da lagosta americana.

nt "> Os primeiros sinais de um potencial problema de limitação de esperma em lagostas foram observadas durante a realização de um estudo de marcação relacionado com lagostas fêmeas ovígeras (com visivelmente intactos, ovos recentemente extrudados). recapturar relatos de pescadores indicaram que aproximadamente 15% desses animais caiu suas desovas após apenas 1-2 meses. A hipótese de trabalho foi que algumas lagostas estavam carregando os ovos que não foram fertilizados e, como resultado, 'caiu' 7. Dados preliminares de um estudo posterior confirmou o fato de que as lagostas vontade expulsar os ovos, mesmo que eles não tenham acasalado com sucesso e esses ovos não fertilizados só são realizadas para ~ 1 mês 8. Portanto, dada a observação de mulheres que levam os ovos não fertilizados em populações naturais, buscou-se determinar até que ponto a limitação de espermatozóides pode estar contribuindo para um nível submáximo de reprodução por lagostas sexualmente maduros. Para atingir este objetivo, a técnica foi desenvolvida para detectar a spermatophore depositado pelos machos durante o acasalamento.

Este artigo e vídeo descrever um método não invasivo, simples desenvolvido para determinar o sucesso de acasalamento de lagostas do sexo feminino. A técnica pode ser utilizada de forma rápida e confiável no mar, ou a bordo de investigação ou de embarcações de pesca comercial. Os pormenores deste método de amostragem, bem como alguns resultados representativos são apresentado para ilustrar a aplicação da técnica.

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Protocol

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Parte A: Técnica Campo Amostragem

1. Feminino Medidas

  1. Para cada lagosta fêmea, medir o comprimento da carapaça (CL) e a largura do segundo segmento abdominal com uma aproximação de 1,0 milímetros usando um par de pinças.
    NOTA: O segundo segmento abdominal é medida porque a largura do abdômen (onde as fêmeas carregam seus ovos) é um indicador da maturidade sexual. Além disso, pode ser vantajoso para determinar a fase muda depois para combinar estes dados com a fase reprodutiva (ver passo 1.2).
  2. Clipe uma pequena porção distal de um dos pleópodos abdominais (um protocolo metodológico padrão em lagostas) e armazenar o pleópodo na água do mar limpa para posterior visualização com um microscópio de dissecação 9.
    NOTA: Esta etapa também pode revelar a presença de glândulas de cimento nos pleópodos, que são uma indicação de que as mulheres estão se preparando para expulsar seus ovos 10.

2. Agulha Insertion

  1. Insira a agulha da seringa (18 G, ver Tabela 1) ~ 1 cm no receptáculo seminal, em ângulo em direção à cauda em ~ 45 ° (Figura 1).
    NOTA: Em lagostas com bujões de esperma intactas, a agulha pode encontrar alguma resistência durante a inserção, como é empurrado através do tampão de esperma antes de alcançar a maior concentração de esperma no fundo do receptáculo seminal (Figura 1).
    NOTA: A presença do plugue, em si, é um indicador confiável que as lagostas acasalaram. Em alguns animais pode haver pouca resistência, possivelmente porque não spermatophore está presente, o spermatophore é pequeno, ele não tenha endurecido num tampão, no entanto, ou pode já ter sido utilizado para fertilizar uma ou mais garras de ovos.

Figura 1 Figura 1. Inserção da agulha e visão de lagosta receptáculo seminal. Inserção da agulha de ponta romba no receptáculo seminal da lagosta para extrair uma amostra de esperma. O ângulo e profundidade da agulha são ambos críticos para a obtenção de amostras consistentes. Direita: Vista de um receptáculo seminal que foi dissecado e dividida verticalmente. A ficha de esperma ocupa a porção de topo ou exterior do recipiente, enquanto os espermatozóides são localizados na parte inferior (ponto mais fundo) do receptáculo. É importante notar que a amostragem abaixo desta profundidade pode perfurar o recipiente e resultar em uma amostra contaminada com sangue. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

3. Penetrando o esperma plug

  1. Após a inserção inicial, steepen o ângulo da agulha, a quase vertical (perpendicular ao eixo do corpo), e muito lentamente começa a trabalharpara baixo, para dentro do receptáculo.
  2. Manter a agulha inclinada a um ângulo de modo que a ponta está apontado ligeiramente para a cauda. Neste caso, a ponta da agulha está a comprimir a parte superior do obturador, até que, eventualmente, penetra na matriz.
  3. Continue a empurrar lentamente a agulha para baixo até sentir resistência, mais uma vez - este é o fundo do recipiente e onde a amostra é colhida.

4. Remoção de esperma

  1. Retirar uma amostra (muitas vezes o material tampão sólido, esperma líquido e outro fluido) a partir do fundo do recipiente, e depositar a amostra para um tubo de plástico de 2,0 ml marcado.
  2. Lave o recipiente com ~ 0,1-0,5 ml de água do mar fria.
  3. Retire cerca de 0,3 ml de líquido e coloque no mesmo tubo.
  4. Amostras de esperma loja no gelo até que possam ser examinadas em laboratório.
    Parte B: exame de amostras de esperma no laboratório
    NOTA: As amostras retiradas dos receptáculos seminais do indivíduo l obsters deve ser examinado para determinar se as células do esperma estavam presentes ou ausentes.
  5. Remover ~ 50 mL de fluido de cada tubo de plástico, coloque em uma lâmina de vidro com uma lamela e vista no 100X com um microscópio composto.
  6. Pontuação amostras como: esperma escassos, numerosos, ou ausente (este estudo não quantificar o número de esperma reais, figura 2).

Figura 2
Figura 2. Imagens de amostra de esperma Lobster. Imagens de amostras de lagosta esperma retiradas de receptáculo seminal da fêmea, como visto com um microscópio composto em 40X de ampliação. Imagem à esquerda mostra uma amostra que continha numerosos espermatozóides, enquanto o outro (direita) ilustra uma amostra escassa (barra de escala = 10 mm)."Target =". Jpg _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Representative Results

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Os dados aqui apresentados foram para um subconjunto de lagostas fêmeas que se originou a partir de ambos nearshore e offshore. O grupo nearshore consistiu de 44 lagostas que foram capturados nas águas costeiras perto de Cape Ann, Massachusetts e transportados em caixas térmicas para o laboratório para exame. Um total de 186 lagostas no mar foram capturados em Banco de George e amostrado a uma instalação de detenção comercial em New Hampshire.

As amostras de esperma foram obtidos a partir de todos os animais e imediatamente analisados ​​quanto à presença ou ausência de esperma de acordo com os métodos descritos acima. Um total de 90,3% de todas as mulheres neste subgrupo teve esperma em seus receptáculos seminais. Surpreendentemente, aqueles que não tinham esperma não foram, necessariamente, na extremidade menor da gama de tamanho (Figura 3).

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Figura 3. Resultados de amostragem para presença de esperma em lagostas. Percentual de lagostas do sexo feminino em cinco milímetros caixas tamanho CL classe que tinham esperma em seus receptáculos seminais (percentagem positiva) como um indicador de acasalamento. As fêmeas foram capturados em águas perto de Cape Ann, MA (71-83 mm CL) e do Banco de George (89-154 mm CL). Números dentro de barras representam o tamanho total da amostra para que bin. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Discussion

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Este vídeo e papel esboço e demonstrar um método para determinar se as lagostas fêmeas acasalaram com sucesso. Esta abordagem é simples o suficiente para que ele possa ser utilizado para a amostragem em larga escala de lagostas no mar por uma variedade de utilizadores. O método baseia-se na detecção da presença de um spermatophore no receptáculo seminal que é transmitido a partir do sexo masculino para lagostas fêmea durante o acasalamento. Estes spermatophores parcialmente endurecer e formar um tampão de esperma logo depois de serem depositados no receptáculo, portanto, a presença de um tampão de esperma também é indicativo de sucesso de acasalamento. Neste estudo, bem como um maior estudo subsequente, determinou-se que a maior parte dos tampões de espermatozóides tinham esperma que lhes estão associados 11. No entanto, enquanto a presença de um plugue é um indicador confiável da atividade de acasalamento, a sua ausência não é.

Embora não possamos estar totalmente certo se esta metodologia de amostragem incorre em um efeito negativo sobre a capacidade de lagostas fêmeas para desovar umd fertilizar com sucesso a sua embreagem ovo, há aspectos a este protocolo de amostragem de esperma que sugerem que os danos seriam mínimos, quer ao espermatóforos ou receptáculo. Há dados (a partir de estudos de laboratório em curso) que indicam algumas lagostas, amostragem pós-esperma, ainda expulsar garras de ovos fertilizados (n = 3) e são capazes de fertilizar mais de uma ninhada de ovos usando o mesmo espermatóforos. Estes ovos eclodem e desenvolver de forma semelhante a lagostas que não foram amostradas. Além disso, esta técnica de amostragem só serve para provar uma pequena fração do total de espermatozóides. Ela não se destina a provar quantitativamente o conteúdo completo de um receptáculo. Devido à arquitetura física complexa do receptáculo 12,13, uma técnica diferente (por exemplo, dissecção) seria necessário para obter esses tipos de resultados.

O esperma foi encontrado num número de animais amostrados que careciam de um tampão de esperma, possivelmente porque o spermatophore foi relativamente new, e ainda não tinha endurecido em uma ficha, ou o espermatóforo já havia sido usado para fertilizar uma ou mais ninhadas de ovos e tinha-se deteriorado. Portanto, a fim de obter o índice mais preciso do sucesso de acasalamento é importante tanto para a verificação de um tampão e amostra de esperma para o esperma.

Orientação precisa da agulha durante o processo de amostragem é crítico, por várias razões. Em primeiro lugar, garantir que a agulha é paralelo ao plano lateral do corpo evita que ela penetre no lado fino do receptáculo seminal. Quando a técnica é executada correctamente, ele não causa de mortalidade, como a agulha nunca realmente penetra na cavidade do corpo. Em segundo lugar, o ângulo de inserção de 45 °, seguido por um aumento da inclinação da agulha, ajuda a garantir que a agulha alcança o fundo do recipiente em que os espermatozóides são concentradas, sem penetrar a parede do spermatophore e entrar na cavidade do corpo adjacente (Figura 1) .

13. Uma vez que o esperma ter reagido, eles começam a quebrar na amostra e tornar-se difícil de identificar. Por esta razão, a agitação dos frascos de amostra deve ser mantido a um mínimo. Manter as amostras de fresco também parece ajudar a preservar a integridade do esperma. Por fim, sugere-se usar água do mar esterilizada quando o processamento da amostra. Este pode actuar para minimizar o crescimento de bactérias e outros microorganismos (mais 36-48 h) que pode danificar o esperma.

A maioria (90,3%) das lagostas fêmeas amostra tinham acasalado com êxito, com base na presença de esperma nos seus receptáculos seminais. O restante dos animais pode não ter sido esperma positivo porque ou eles eram sexualmente imaturos, os plugues de esperma se deteriorou ao longo do tempo ou teve seren totalmente utilizado para fertilizar uma ou mais ninhadas de ovos, ou eles nunca tinha acasalado, possivelmente porque nunca encontrou um homem adequado no momento certo em seu ciclo de muda 11. Lagostas fêmeas em região do George Bank tem um tamanho relativamente grande-at-maturidade, com apenas 50% das fêmeas amadurecem a 100 mm 14. Fêmeas Cape Ann amadurecer em um tamanho um pouco menor do que as lagostas no mar, com 50% de fêmeas amadurecem em 90 milímetros CL 15. Portanto, tendo em conta que os menores do sexo feminino foram 71 mm CC, não é razoável sugerir que algumas das mulheres que faltam fichas de esperma foram provavelmente imaturo e, portanto, não teria acasalado. Muitas grandes lagostas femininos, como os verificados em nosso subconjunto no mar, pode gerar em anos consecutivos, sem a muda e remating 16.

Vários adubações usando o mesmo espermatóforos podem, eventualmente, resultar em um colapso do material de plugue e pode usar-se o esperma contido no receptacle, produzindo um resultado negativo. No entanto, a avaria mecânica do plug esperma ao longo do tempo não tem, a nosso conhecimento, foram descritos. Finalmente, é possível que as fêmeas sem esperma em seus recipientes foram incapazes de localizar um companheiro. Relações sexuais femininos enviesadas foram documentados em estoque de lagosta Banco do George 17, ea possibilidade de que isso leva à limitação de esperma merece mais atenção devido às potenciais consequências para a saída reprodutiva da população de lagosta.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a todos os pescadores de lagosta comerciais da Nova Inglaterra, cujos barcos foram autorizados a amostra a partir de - a sua cooperação é muito apreciada. Além disso, agradecemos a Little Bay Lobster Company (Newington, NH) e de Champlin frutos do mar (Point Judith, RI), que permitiu a realização de amostragem em suas instalações. Os seguintes estudantes UNH prestou assistência valiosa ao longo deste estudo: Haley Branco, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, e maio Grose. Este projecto foi apoiado por subsídios da NH SeaGrant a WHW (projeto # R/CFR-11) e um Programa Bolsa UNH Marine para JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. Available from: http://www.fao.org (2012).
  2. MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
  3. Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
  4. Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
  5. Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
  6. Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
  7. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
  8. Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
  9. Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
  10. Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
  11. Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
  12. Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
  13. Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. Academic Press. NY. 177-216 (1995).
  14. Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
  15. Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
  16. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
  17. Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. Washington, D.C. (2009).
Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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