Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Неинвазивный метод для doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Рыболовство, вызванной изменения в эксплуатируемых ракообразных рыболовства, такие как американский омар рыболовства, может потенциально повлиять на их репродуктивные динамику, что привело к сокращению брачного успеха. Цель данного исследования заключалась в разработке неинвазивный метод для выяснения спаривания успех женских омаров, которые могут быть физиологически или функционально зрелым.

Abstract

Несмотря на то, один из самых продуктивных рыболовства в Северо-Западной Атлантике, многое остается неизвестным о природных репродуктивных динамики американских омаров. Последние работы в эксплуатируемых популяций ракообразных (крабы и омары) предполагает, что есть обстоятельства, когда самки не в состоянии полностью реализовать свой репродуктивный потенциал из-за ограничения спермы. Чтобы исследовать эту возможность в разных регионах американского омара рыболовства, надежный и неинвазивный метод был разработан для отбора проб большое количество женских омаров в море. Этот метод включает вставки тупым наконечником иглу в семеприемника самки, чтобы определить наличие или отсутствие плагина спермы и отозвать образец, который может быть исследован на наличие спермы. Серия контрольных исследований были проведены в доке и в лаборатории, чтобы проверить надежность этой техники. Эти усилия повлекло выборки 294 женщин омары, чтобы подтвердить, что присутствие офа спермы плагин является надежным показателем спермы в приемник и, таким образом, спаривание. Эта статья детализирует методологию и результаты, полученные из подмножества общих женщин, отобранных. Из 230 женщин омаров, взятых из банка Георгия и Cape Ann, Массачусетс (диапазон размеров = 71-145 мм в длину панциря), 90,3% были положительными для спермы. Потенциальные объяснения отсутствие сперматозоидов в некоторых самок включают: незрелость (отсутствие физиологической зрелости), разбивку вилки спермы после использования, чтобы оплодотворить сцепление яиц, а также отсутствие спаривания деятельности. Исследования показывают, что этот метод для изучения спаривания успех женских омаров является надежным прокси который может быть использован в области документировать репродуктивную активность в природных популяциях.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Американский омар (Homarus атепсапиз) является одним из самых продуктивных рыболовства в Северной Атлантике (~ 56 000 т в 2011 году, стоимостью более $ 390 млн.) 1. Тем не менее, существует общее непонимание относительно репродуктивных динамики этого вида в популяциях диких. Создание более точные оценки репродуктивного выходе, включая числа и размеров особей, активно участвующих в воспроизводстве, могут улучшить процесс оценки запасов. Например, самки, которые помешали полностью раскрыть свой ​​репродуктивный потенциал из-за ограничения спермы были определены как забота о нескольких промысловых морских ракообразных в том числе: лангустов 2, синего крабов 3, королевских крабов 4, каменные крабы 5 и снежных крабов 6. Общая цель заключается в определении, если ограничение сперма может быть фактором в некоторых регионах американского омара рыболовства, а также.

нт "> Первые признаки потенциальной проблеме ограничения спермы в омаров наблюдались при проведении неродственного исследование мечения с ovigerous женщин омаров (с заметно неповрежденных, недавно экструдированных яиц). Отбить отчеты из рыбаков указал, что ~ 15% этих животных упала их яйца клатчи только после 1-2 месяцев. Рабочая гипотеза в том, что некоторые омары несли яйца, которые не были оплодотворены и, как следствие, "упал" 7. По предварительным данным последующем исследовании подтвердили тот факт, что омары будет выдавливать яйца даже если они еще не успешно повязана и эти неоплодотворенные яйца производиться только в течение ~ 1 месяц 8. Таким образом, учитывая наблюдение женщин, несущих неоплодотворенные яйца в природных популяциях, мы стремились определить, в какой степени ограничение сперма может быть, способствующий субмаксимальная уровень воспроизводства по половозрелых омаров. Для достижения этой цели, была разработана методика для определения spermatophore сданный на мужчин во время спаривания.

Эта статья и видео описывают неинвазивный, простой метод, разработанный для выяснения спаривания успех женских омаров. Этот метод может быть быстро и надежно использовать в море, либо на борту исследовательских и коммерческих рыболовных судов. Детали этого метода отбора проб, а также некоторые репрезентативные результаты, иллюстрирующие применение техники.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Часть А: Полевые испытания Техника

1. Женский Измерения

  1. Для каждого женского омаров, измерьте длину панцирь (CL) и ширину второго абдоминального сегмента до ближайших 1,0 мм с использованием пары суппортами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Второй брюшной сегмент измеряется поскольку ширина живота (где женщины носят их яйца) является показателем половой зрелости. Кроме того, может быть предпочтительным, чтобы установить стадию линьки, чтобы соответствовать позже эти данные с репродуктивной стадии (см. шаг 1.2).
  2. Клип небольшой дистальной части с одной из брюшной плеоподов (стандартная методологическая протокола в омаров) и хранить плеопод в чистой морской водой для последующего просмотра с рассекает микроскопом 9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также может выявить наличие цементных желез на плеоподов, которые свидетельствует, что женщины готовят для выдавливания их яйца 10.

2. Игла Insertion

  1. Вставьте иглу шприца (18 г, см. таблицу 1) ~ 1 см в семеприемника, под углом к хвосту при ~ 45 ° (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В омаров с неповрежденными пробками спермы, игла может встретить некоторое сопротивление во время введения, так как он толкнул через пробку спермы до достижения высокую концентрацию спермы на нижней части семеприемника (рис. 1).
    ВНИМАНИЕ: Наличие вилке, само по себе, является надежным показателем того, что омары вязка. У некоторых животных может быть мало сопротивления, возможно, потому что ни сперматофора нет, сперматофора мал, он не затвердел в пробку еще, или это, возможно, уже используется для удобрения один или несколько кладки яиц.

Рисунок 1 Рисунок 1. Введения иглы и вид омаров семеприемника. Вставка тупой наконечником иглу в семеприемника омара, чтобы извлечь образец спермы. Угол и глубина иглы оба важны для получения последовательных выборок. Справа: Вид семеприемника, который был расчлененный и разделен по вертикали. Вилка спермы занимает верхнюю или самую наружную часть емкости, в то время как сперматозоиды расположены в нижней части (глубокой точке) сосуда. Важно отметить, что отбор проб ниже этой глубины может проколоть емкость и привести в образце крови загрязненных. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

3. Проникая сперма пробка

  1. После первоначального введения, круче угол иглы до почти вертикально (перпендикулярно к оси тела), и очень медленно начать работатьвниз в емкость.
  2. Держите иглу наклоненный под углом так, чтобы кончик слегка заостренные к хвосту. В данном случае кончик иглы сжатия верхнюю часть пробки, пока он в конечном счете не проникает в матрицу.
  3. Продолжайте медленно толкать иглу вниз, пока не почувствуете сопротивление еще раз - это дно сосуда и где берется проба.

4. Сперма Удаление

  1. Удаление образца (часто твердый материал пробки, жидкий сперму и других жидкостей) со дна сосуда и хранение образца в меченого 2,0 мл пластиковую пробирку.
  2. Промойте емкость с ~ 0,1-0,5 мл холодной морской воде.
  3. Снимите приблизительно 0,3 мл жидкости и месте в той же пробирке.
  4. Образцы хранить сперму на льду, пока они не могут быть рассмотрены в лаборатории.
    Часть B: Экспертиза образцы спермы в лаборатории
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, удаленные из семенных сосудов индивидуального л obsters должны быть рассмотрены, чтобы определить, сперматозоиды были присутствовать или отсутствовать.
  5. Удалить ~ 50 мкл жидкости из каждой пластиковой трубки, место на предметное стекло с покровным и видом на 100X с сложным микроскопом.
  6. Оценка образцов как: спермы дефицитного, многочисленных или отсутствующего (это исследование не количественно реальные цифры спермы, рисунок 2).

Рисунок 2
Рисунок 2. Образец Омар спермы изображений. Изображения образцов омар спермы, взятых из семеприемника самки, если смотреть с соединением микроскопом при 40-кратном увеличении. Изображение на левой показан образец, который содержал многочисленные сперму, а другой (справа) показывает редкие образец (шкалы = 10 мкм).JPG "целевых =". _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Данные, представленные здесь, были для подмножества женщин омаров, которые произошли из так прибрежной зоне и оффшорных зонах. Прибрежная группа состояла из 44 омаров, которые были сняты в прибрежных водах у мыса Энн, штат Массачусетс, и перевозимых в холодильниках в лабораторию для экспертизы. В общей сложности 186 морских омаров были захвачены на банк Георгия и пробовали в коммерческом изолятор в Нью-Гемпшире.

Образцы спермы были получены от всех животных и сразу же исследуют на наличие или отсутствие сперматозоидов в соответствии со способами, описанными выше. В общей сложности 90,3% всех женщин в этой подгруппе были сперму в их семенных сосудов. Удивительно, но те, что не хватало сперму не обязательно в меньшем конце диапазоне размеров (рис. 3).

ighres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 3. Результаты выборочного присутствии спермы в омаров. Процент женщин омаров в 5 мм Размер CL класса бункеров, которые имели сперму в их семенных сосудов (процентов положительный) как индикатор спаривания. Женщины были захвачены в водах вблизи мыса Энн, штат Массачусетс (71-83 мм CL) и от Банка Георгия (89-154 мм CL). Числа внутри баров представляют общий размер выборки для этого мусорное ведро. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Это видео и бумаги план и продемонстрировать способ определения, если женщина омары успешно повязана. Этот подход достаточно прост что он может быть использован для крупномасштабного выборки омаров в море с помощью различных пользователей. Метод основан на обнаружении присутствия сперматофора в семеприемника, который передается от мужчины к женщине омаров во время спаривания. Эти сперматофоры частично затвердевает в пробку спермы вскоре после они оседают в приемнике, таким образом, присутствие вилки спермы также указывает спаривания успех. В данном исследовании, а также последующего увеличения исследовании было установлено, что большинство из штекеров спермы было спермы, связанных с ними 11. Тем не менее, в то время как наличие плагина является надежным индикатором спаривания деятельности, ее отсутствие не является.

Хотя мы не можем быть полностью уверены, является ли эта технология выборки несет негативное влияние на способность женщин омаров на нерестг успешно оплодотворить их яйца сцепление, есть аспекты этого протокола отбора проб спермы, которые предполагают, что ущерб будет минимальным или к сперматофора или сосудом. Есть данные (из текущих исследований лаборатории), которые показывают некоторые омаров, отбор проб после спермы, все еще выдавливать оплодотворенные (п = 3) кладки яиц и способны оплодотворять более одного сцепление яиц, используя тот же сперматофор. Эти яйца развиваются и люк аналогично омаров, которые не были в выборку. Кроме того, этот метод выборки только служит, чтобы пробовать небольшую долю от общего спермы. Он не предназначен для количественного пробовать все содержимое сосуда. Благодаря комплексной физической архитектуры сосуда 12,13, другая техника (например рассечение) должны будут получить эти виды результатов.

Сперма была найдена в ряде отобранных животных, в которых отсутствует плагин спермы, возможно, потому что сперматофора было относительно пEW, и еще не закаленные в пробку или сперматофора ранее использовался для удобрения один или несколько кладки яиц и ухудшилось. Таким образом, чтобы получить наиболее точный показатель ответной успеха важно как чек на вилку спермы и образца для спермы.

Точная ориентация иглы во время процедуры отбора проб имеет решающее значение по нескольким причинам. Во-первых, уверяя, что игла параллельна боковой плоскости тела защищает его от проникновения в тонкую сторону семеприемника. Когда метод выполняется правильно, он не вызывает смертность, как игла фактически никогда не проникает в полость тела. Во-вторых, угол 45 ° вставки, а затем укручение иглы, помогает гарантировать, что игла достигает дна сосуда, где сперматозоиды сосредоточены, не проникая стенку сперматофора и ввод смежный синус тела (рис. 1) .

13. После того, как сперма отреагировали, они начинают разрушаться в образце и стать трудно определить. По этой причине, агитация ампулами должно быть сведено к минимуму. Хранение образцов прохладно также появляется, чтобы помочь сохранить целостность спермы. Наконец, предлагается использовать стерильную морскую воду при обработке образца. Это может действовать, чтобы минимизировать рост бактерий и других микроорганизмов (в течение 36-48 ч), что может повредить сперму.

Большинство (90,3%) женских омаров, отобранных успешно паре, на основании наличия сперматозоидов в их семенных сосудов. Остальная часть животных, возможно, не сперма положительным, потому что либо они были сексуально незрелые, их пробки спермы ухудшилось с течением времени или было бытьан полностью используется для удобрения один или несколько кладки яиц, или они никогда не повязана, возможно, потому, что они никогда не сталкивались с соответствующей мужчина в нужное время в их линьки цикла 11. Женский омары в Георгия банка региона имеют относительно большой размер по достижении половозрелости, и только 50% женщин созревают в 100 мм 14. Cape Ann самки созревают в несколько меньшего размера, чем сделать оффшорные омаров, с 50% женщин созревают в 90 мм CL 15. Поэтому, учитывая, что наименьшие самки 71 мм CL, это не является необоснованным предположить, что некоторые из женщин, не имеющих спермы пробки, вероятно незрелыми и, таким образом, не было бы в паре. Многие крупные женские омары, такие как пробы в нашей оффшорной подмножества, может породить в лет подряд без линьки и remating 16.

Несколько оплодотворения, используя тот же сперматофор в конечном итоге может привести к нарушению плагина материала и может использовать до сперму, содержащейся в ReceptAcle, уступая отрицательный результат. Тем не менее, механические поломки штекера спермы с течением времени не, насколько нам известно, были описаны. Наконец, не исключено, что эти женщины без спермы в их сосудах были не в состоянии найти себе пару. Кривые женские соотношение полов были зарегистрированы в банк омара акций Георгия 17, и возможность того, что это приводит к ограничению спермы заслуживает дальнейшего внимания в связи с потенциальными последствиями для репродуктивной выходе населения омара.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить всех Новой Англии коммерческие lobstermen чьи лодки нам разрешили пробовать от - их сотрудничество высоко ценится. Кроме того, мы благодарим Little Bay Lobster Company (Newington, NH) и морепродукты Champlin в (Point Judith, RI), который позволил нам провести отбор проб на своих объектах. Следующие UNH студенты оказали неоценимую помощь всем этом исследовании: Haley белый, Франсуаза Моррисон, Сара Havener, Audra Chaput и может Grose. Этот проект был поддержан грантами NH SeaGrant до WHW (проект № R/CFR-11) и учреждения Организации Объединенных Наций морской программы грантов на JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. Available from: http://www.fao.org (2012).
  2. MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
  3. Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
  4. Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
  5. Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
  6. Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
  7. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
  8. Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
  9. Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
  10. Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
  11. Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
  12. Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
  13. Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. Academic Press. NY. 177-216 (1995).
  14. Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
  15. Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
  16. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
  17. Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. Washington, D.C. (2009).
Неинвазивный метод для<em&gt; В месте</em&gt; Определение Спаривание успеха в женских американских Омары (<em&gt; Homarus атепсапиз</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter