Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

Summary

I denne publikation beskriver vi en hurtig og bekvem procedure for isolering og dyrkning primære pancreas acinarceller fra murine bugspytkirtlen. Denne metode udgør en værdifuld tilgang til at studere fysiologi af friske primære normale / utransformeret exokrine bugspytkirtlen celler.

Abstract

Denne protokol tillader hurtig isolation (i mindre end 1 time) af murine pancreas acini, hvilket gør det muligt at fastholde dem i kultur for mere end en uge. Mere end 20 x 10 ⁶ acinuscellerne kan opnås fra en enkelt murin bugspytkirtel. Denne protokol giver mulighed for selvstændigt at bearbejde så mange som 10 bugspytkirtler parallelt. Fordi den bevarer acinært arkitektur, er denne model velegnet til at studere fysiologi eksokrine pancreas in vitro i modsætning til cellelinier etableret fra pankreatiske tumorer, som udviser mange genetiske ændringer resulterer i delvis eller fuldstændig tab af deres acinar differentiering.

Introduction

Et ofte stødt problem for forskningslaboratorier arbejder på exokrint pankreasvæv er vanskeligheden ved at dyrke acinar celler in vitro for en periode tilstrækkelig lang til at tillade en langsigtet eksperiment.

En faktor hæmme udviklingen af ​​sådanne dyrkningssystemer er den iboende følsomhed pankreasvæv til eksperimentel manipulation grund af det høje indhold i glycolytiske, proteolytiske og lipolytiske enzymer, som bogstaveligt talt fordøje Bugspytkirtelvævet når de frigives under isoleringen af ​​pancreasceller.

En anden faktor er den bemærkelsesværdige in vitro plasticitet acinarceller, som har en tendens til at miste deres sekretoriske egenskaber og transdifferentiate til andre modne celler, såsom pankreatiske duktale celler eller hepatocyt-lignende celler ^1.. In vitro varierer denne celle plasticitet med de eksperimentelle betingelser (såsom dyrkningsmedium sammensætning) ^2. 1..

Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til isolering og dyrkning af acinarceller, først fra marsvin bugspytkirtlen ^3-5. I første omgang disse protokoller involveret fordøjelse af pancreas væv med collagenase, chymotrypsin og en protease cocktail, med ultimativ isolation ved kraftig mekanisk dissociation. Pancreas celler isoleret på denne måde viste unormale strukturelle og funktionelle egenskaber, herunder især et tab på apikale strukturer og betydelige skader på deres membran receptorer. Isolerede celler forblev levedygtige for kun 1 eller 2 dage.

Udarbejdelse af spredte acini fastholder deres intra-og intercellulære arkitektur, bevare cellemembraner og begrænse skader på overfladen receptorer og dermed forbedre eksokrin sekretion som respons på antidiabetika ^6-8. Som en result, denne metode giver den store fordel, at udvide acinar cellelevedygtighed til 7-10 dage in vitro. Desuden er denne metode i øjeblikket foretrukket at acinære celleisolering ^9-12 fordi vedligeholdelse af intercellulære kontakter, herunder celle kobling af gap junctions, er en væsentlig faktor for eksokrine pancreas acinar celle fænotype ^13..

Som dedifferentiering af acinar celler og deres transdifferentiation til duktale celler er en af de foreslåede mekanismer for tilblivelsen af aggressive exokrine pancreascancer ^14, den dispergerede acini modellen er også et passende system til at studere bugspytkirtlen plasticitet og dets efterfølgende molekylære mekanismer. Endvidere i kombination med anvendelse af genetisk modificerede dyr ^15,16 og udvikling af genoverførsel teknikker (adenoviral ² eller lentiviral transduktion, anvendelsen af nanopartikler, osv.), dette in vitro primære acinar celle model kanvære meget nyttige i at bestemme, hvor forskellige genetiske dysfunktioner påvirker reguleringen af ​​acinære celledifferentiering eller dedifferentiering og bør give en bedre forståelse for de molekylære begivenheder, der er ansvarlige for indtræden af ​​pancreatitis, forstadier til kræft, samt ændringer i celle plasticitet.

Isolering af spredte acini er den tilgang, vi bruger i vores laboratorium til kultur bugspytkirtlen acinarceller. Vi her beskrive og diskutere den anvendte metode. Det indebærer enzymatisk dissociation af pancreasvæv (med en bakteriel collagenase) koblet til mekanisk sprængning uden dissociation af acinar celler. Mens de fleste protokollerne omfatter dyrkning af acini, enten i suspension eller på specialbehandlet plastsubstrater, vi dyrker dem i suspension kun kortvarigt (til 24 timer), såning dem bagefter på matrix stilladser hvis langvarig cellekultur er påkrævet.

Denne protokol giver mulighed for hurtig isolation (i mindre end 1 time) af dispergeret pancreas acini, bæredygtig for mere end en uge i kultur. Det tillader isolering af mere end 20 x 10 ⁶ acinarceller per mus bugspytkirtlen. Sin enkelhed gør det muligt at behandle uafhængigt så mange som 10 bugspytkirtler parallelt. Ved at opretholde intra-og intercellulære arkitektur acini og dermed acinært fænotype af isolerede primærelementer, udgør denne model et system for studiet af transdifferentiation mekanismer som alle andre eksokrine pancreas modeller øjeblikket er til rådighed stammer fra pancreas tumorer, der udviser mange genetiske ændringer, der fører til cellulær transformation.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af en etik udvalg under regulerende af statslig myndighed ("Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transit de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). Mus blev opretholdt i en SPF-dyr facilitet på "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, Frankrig) og håndteres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer.

En skematisk fremstilling af den fremgangsmåde er vist i figur 1..

1.. Pancreas Dissektion og Dilaceration (dag 0)

En meget hurtig dissektion er afgørende for en optimal udbytte af ekstraktion og at sikre en god levedygtigheden af ​​celler i kultur. For at reducere den nødvendige tid til bugspytkirtlen isolation, skal alle instrumenter og udstyr være klar før musen dødshjælp.

1. Afliv musen ved CO ₂ kvælning eller halsdislokation.

Fra dette trin, har alle procedurer, der skal udføres i henhold til en steril atmosfære (mikrobiologisk sikkerhed kabinet, level II) med sterilt dissektion udstyr.

2. Fastgør musen og spray musen maven med 70% ethanol. Med eventuelle dissekere saks og pincet, lave en V-formet indsnit ved kønsdelene og fortsætte det op til mellemgulvet til at åbne helt bughulen.
3. Placer leveren lapper mod mellemgulvet de skal forblive der, hvis kroppen hulrum er åbent langt nok. Træk tarmen og tyktarmen uden bughulen til venstre, og find endetarmen. Med et par buede pincet og dissekere saks, grab og afsnit endetarmen.
4. Med den samme tang, rulles forsigtigt helt tarmen fra endetarmen til maven ved at trække tarmen på din venstre.

ent "> I dette trin, kan bugspytkirtlen skelnes som en lille strimmel mellem mavesækken og begyndelsen af ​​tarmen. Dets ligeringer med milten forbliver intakt.

5. Brug Noyes saks og en pincet, forsigtigt skære bugspytkirtlen langs tarmen og befri det med milten fra resten af ​​fordøjelseskanalen.
6. Grab milt og afsnittet bugspytkirtlen knyttet til det (figur 2).

På dette trin, skal sikre, at ingen mesenteriske fedtvæv og / eller andre tilstødende væv (milt, tarm, etc.) kan indsamles med bugspytkirtlen, for at undgå cellulær forurening.

For resten af proceduren, skal alle buffere fremstilles uden calciumion ^{Ca2 +} chelatorer at undgå fuldstændig dissociation af exokrint pankreasvæv i enkelte acinarceller.

7. Skyl bugspytkirtlen to gange i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x.

På dette trin vil som fedtvæv flyde strid med bugspytkirtlen, vil synke, er det let muligt at visualisere og hurtigt fjerne det forurenende hvide fedtvæv stadig er knyttet til bugspytkirtlen.

Hvis bugspytkirtlen skal transporteres til cellekultur facilitet, skal det holdes på is i HBSS 1x.

8. Overfør bugspytkirtlen i en steril petriskål indeholdende 5 ml HBSS 1x. Brug Noyes saks og en skalpel, slice bugspytkirtlen i små stykker på 1 til ³ mm 3 (figur 3A).

2.. Enzymatiske og mekaniske dissociationer i bugspytkirtlen (dag 0)

1. Overføre dem i en steril 50 ml polypropylenrør.
2. Centrifuger i 2 min ved 450 xg og 4 ° C. Aspirer og kassér supernatanten at fjerne celle fragmenter og blodceller.
3. Tilføj 10 ml collagenase IA opløsning (HBSS 1x indeholdende 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenaSE IA, og 0,25 mg / ml trypsin inhibitor) til pancreas sektioner. Ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette, overføre dem til en 25 cm ² kolbe. Inkuber det i 20-30 min ved 37 ° C. I løbet af denne tid (hver 5 min), udføre en mekanisk dissociering ved energisk flytte tilbage-og-tilbage bugspytkirtlen fragmenter omkring ti gange, i sterile pipetter faldende størrelse (25, 10, og 5 ml serologiske pipetter).

På dette trin er det vigtigt at ofte overvåge omfanget af den enzymatiske dissociation af pancreas sektioner.

4. Når pancreas væv synes at være godt dissocieres (ifølge forsvinden af pancreas-fragmenter og den øgede turbiditet af opløsningen) (figur 3B), stoppe den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 10 ml kold pufret vaskeopløsning (HBSS 1x indeholdende 5 % føtalt bovint serum (FBS) og 10 mM HEPES).
5. Overføre dem til en steril 50 ml polypropylenrør og centrifuge i 2 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Omhyggeligt aspirere og supernatanten at fjerne collagenase IA løsningen.
6. Resuspendere og vaske pelleten med 10 ml pufret vaskeopløsning. Centrifuger i 3 min ved 450 xg og 4 ° C. Omhyggeligt aspirere og supernatanten. Gentag dette trin to gange mere.

3.. Filtrering og såning af Spredt acini (dag 0)

1. Resuspender cellepelleten i 7 ml Waymouth medium indeholdende 2,5% FBS, 1% penicillin-streptomycin-blanding (PS), 0,25 mg / ml trypsininhibitor, og 25 ng / ml rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF).
2. Filtrat celleblandingen ved at lade den passere gennem en 100 um filter til at fastholde de ikke-nedbrudte fragmenter (kanaler, blodkar, og Langerhanske øer). Pancreas acinære strukturer (acinus på 10-15 celler) passere igennem.
3. Filteret skylles med 6 ml Waymouth medium indeholdende FBS, PS, trypsin inhibitor og Globaliseringsfonden.

Efter dette trin, har cellerne, der skal behandles meget omhyggeligt, for at undgå enhver acini dissociation.

4. Frø den isolerede acini i en 6-brønds dyrkningsplade (2 ml per brønd) (figur 3C). Kultur dem ved 37 ° C under 5% (v / v) _{CO2-atmosfære.}

Efter dette trin er acinuscellerne dyrket i suspension.

4.. Acinar Cell Culture (dag 1 til 10)

1. Fireogtyve timer efter, overføre acini (i suspension) i en ny 6-brønds kultur fad, at fjerne de kontaminerende celler og cellulære rester, der har klæbet natten over (figur 4).

Hvis cellen kulturen skal udvides i flere dage, eller hvis de eksperimentelle forhold kræver celler dyrket i monolag, anbefales det at overførsel og frø acini på matrix stillads.

2. Dagen før seding af matrix support (dag 0), frakke en 6-brønds dyrkningsplade med type I kollagen (5 ug / cm ^2). Tilsæt 1 ml type I collagen-opløsning (50 ug / ml i 0,02 M eddikesyre, 0,2 um-filtreret) til hver brønd, og lad det passivt adsorberes plast, i løbet af 1 time ved 37 ° C (eller natten over ved 4 ° C ).
3. Aspirer type I collagen og skyl det overtrukne godt to gange med phosphatpufret saltopløsning 1x.
4. Lad den coatede godt at tørre (under en mikrobiologisk sikkerhed kabinet) mindst 12 timer før brug.
5. Overfør isoleret primær acini (opnået i trin 4.1) i type I collagen-coatede 6-brønds dyrkningsplade og kultur dem under de samme betingelser som tidligere beskrevet (ved 37 ° C under 5% (v / v) _{CO2-atmosfære)} . Cellerne klæbe til type I collagen substrat for 2 dage.
6. På dag 3, ændre dyrkningsmediet at fjerne ikke-levedygtige celler, der ikke adhærerede. Med tiden i kultur, vil cellerne gradvist spaflæses på collagen-indeholdende support. Ændre dyrkningsmediet hver 3 dage (figur 5).

De isolerede acinar opnåede celler kan tælles, efter en fuldstændig mekanisk dissociering ved hjælp af en Thoma celletælling kammer. Bemærk, at isolerede acinuscellerne ikke kan opretholdes i kultur bagefter.

Kvaliteten af acinære opnåede kultur kan styres ved at kontrollere ekspressionen af acinar specifikke markører, såsom Trypsinogen, Pancreas transkriptionsfaktor 1 underenhed Alpha, eller carboxypeptidase A1 (ved immunocytokemi eller immunfluorescens eksperimenter).

Representative Results

Figur 1 skematiserer den "spredte" acini metode til primær acinarceller isolation. De kritiske trin, som skal være strengt overholdes under protokollen, er beskrevet i diskussionen del.

For at lette dens fjernelse, bugspytkirtlen skal indsamles fra maven sammen med den vedhæftede milt (Figur 2). Begge organer skal skæres fra hinanden, og den resterende fedtvæv, der kunne stadig fastgjort til bugspytkirtlen skal fjernes (trin 1.6).

Makro-og mikroskopiske billeder, der er vist i figur 3, repræsenterer resultatet efter hvert enkelt trin af de enzymatiske og mekaniske dissociationer i bugspytkirtlen. Efter udskæring, er bugspytkirtlen opdelt i små dele (fig. 3A, Trin 1.8). Den 3B viser det aspekt i bugspytkirtlen efter en vellykket enzymatisk dissociation bygger på en omhyggelig midlertial overvågning af den løbende fordøjelse (trin 2.4). Dette trin er et afgørende skridt for at fastslå den nøjagtige tid, der er nødvendig. Den Figur 3C viser det opnåede materiale efter filtreringen af pancreas blandingen (trin 3.4). Kun godt adskilt acini holdes efter dette trin.

Den figur 4 er en typisk dag 1 illustration af pancreas acini isoleret ved hjælp af vores protokol. Overførslen af ​​acinar celler i en ny dyrkningsskål tillader at fjerne de cellulære fragmenter og vedhængende forurenende celler (trin 4.1).

Som vist i figur 5, når den dyrkes på type I collagen, acinuscellerne sprede og miste deres acinar differentiering (morfologi og 3D organisation), giver anledning til et monolag af spindel-formede celler (trin 4.6).

Figur 1. Skematisk fremstilling af den protokol, som giver isolering af muse primær dispergeret acini.

Figur 2. Gross anatomi i bugspytkirtlen efter dissektionen. Røde og gule pile henholdsvis angiver de resterende anatomiske forbindelser med milten og mesenteriallymfeknuderne fedtvæv, der skal skæres for bugspytkirtlen samling.

Figur 3. Spredt acini isolation (dag 0) visualiseres ved makroskopisk observation (venstre panel) og fase-kontrast mikroskopi (højre panel, 40X forstørrelse). A) Efter dilaceration (vist i en 25 cm ² kolbe). B) Efter collagenase IA fordøjelse og energisk mekaniske dissociatipå. C) Efter filtrering og overførsel i en 6-brønds dyrkningsplade.

Figur 4.. Spredt acini kultur, 24 timer efter podning (dag 1), visualiseret ved fasekontrast mikroskopi (40X forstørrelse).

Figur 5. Spredt acini kultur på en type I collagen-belagt parabol på dag 2, 4 og 7 visualiseret ved fasekontrast mikroskopi (40X, 120X og 240X forstørrelse).

Discussion

I denne protokol, beskriver vi en procedure for at isolere bugspytkirtlen acinarceller. Denne metode gør det muligt at isolere mere end 20 x 10 ⁶ acinarceller pr dyr i mindre end 1 time. Takket være den hurtige og enkle gennemførelse (så mange som 10 pancreases kan være uafhængigt behandles per eksperiment i parallel), denne protokol vises som et godt kompromis mellem de eksisterende isoleringsmetoder ^3-5,9-12,17.

Kritiske trin / Trouble-shooting

Effektiviteten af ​​denne metode bygger på forholdsregler, der er truffet på et par kritiske punkter. Det første skridt i bugspytkirtlen dilaceration (Trin 1.8) er afgørende for efterfølgende bugspytkirtlen enzymatisk nedbrydning. Utilstrækkelig opskæring vil reducere udbyttet af enzymatisk dissociation og antallet af acinar opnåede celler. Dette gør det nødvendigt at forlænge inkubation med collagenase IA, uundgåeligt medfører et uforholdsmæssigt dissociation af acinar celler og konsekutivttivt stigende celledød.

Som advarede ovenfor, det andet kritiske trin er fordøjelsen af ​​collagenase IA (trin 2.3). For meget enzymatisk dissociation fører til en høj grad af celledød. Omfanget af bugspytkirtlen fordøjelse skal overvåges hyppigt i denne kritiske trin (figur 3B). Efter mekanisk og enzymatisk dissociationer, har brug for særlig opmærksomhed for at meget forsigtigt håndtere spredt acini for at bevare deres intercellulære strukturer.

Begrænsninger

Selv om tilsætning af epidermal vækstfaktor (EGF) til Waymouth kultur kan fremskynde den gradvise acinar-til-ductal transdifferentiation, er det vigtigt at opretholde cellerne i live.

Som beskrevet i protokollen, og hvis det er nødvendigt, kan in vitro kultur periode af acinusceller udvides til op til 10 dage ved podning af cellerne på matrix Maxiårige såsom type I collagen. Endnu vigtigere, og som vist af andre ^1, dyrkning af celler på type I collagen vil fremkalde en gradvis transdifferentiation af acinar celler til duktale celler. Denne proces begynder efter 4 dages dyrkning på kollagen og kan være fuldstændig efter 7 dage. Det kan derfor være nødvendigt at kontrollere for tilstedeværelse af en specifik ductal markør, såsom cystisk fibrose transmembrane Konduktans Regulator eller Cytokeratin-19 (ved immuncytokemi eller immunfluorescens eksperimenter) hvis acinært cellekultur skal udvides til 1 uge. Den alternative anvendelse af Matrigel som en matrix stillads, ved at reducere vedhæftningen af ​​dispergeret acini, gør det muligt at udvide vedligeholdelse af deres acinært fænotype i 2 dage.

Mulige modifikationer

Sektionering endetarmen under dissektion trin øger risikoen for bakteriel forurening. Vi har aldrig oplevet sådan en situation. Men hvis det er nødvendigt, der er en anden fremgangsmåde til at omgå denne mulige spørgsmål. Den består i at finde maven, milten og den første del af duodenum og sektionering vedhæftede bugspytkirtlen. Bemærk, at denne alternative fremgangsmåde skal perfekt beherskes. Ellers vil varigheden af ​​dissektion bliver længere, bringer derefter kvaliteten af ​​det fjernede biologisk materiale.

Den langsigtede monolagskultur af acinuscellerne kan optimeres, navnlig ved at ændre bærermatrixen. Hvis det kræves af de eksperimentelle betingelser, type I collagen kan erstattes med en anden stillads, såsom Matrigel. I dette tilfælde skal Matrigel være frisklavet ved 400 mg / ml koncentration i koldt phosphatpufret saltopløsning 1x. Derefter brønde inkuberet med Matrigel (40 ug / cm ²⁾ natten over ved 4 ° C. Dette punkt skal respekteres. Kulturen procedure forbliver den samme som beskrevet i trin 4.

Fremgangsmåden CAn optimeres yderligere empirisk. For eksempel kan mængden af aminosyrer i dyrkningsmediet af exokrine pancreasceller regulere proteinsyntesen ved disse celler ^18. Sphyris et al. ² og blauer et al. ¹⁹ har udarbejdet en komplet dyrkningsmedium indeholdende en større mængde af aminosyrer (essentielle og ikke-essentielle), fremme opretholdelsen af acinar celler i differentierede tilstand. Sådant medium kan være meget nyttigt, hvis man ønsker at dyrke acinar celler isoleret ved denne fremgangsmåde i mere end 10 dage.

En anden parameter, der kan ændres, hvis langsigtet kultur er nødvendig, er pH af dyrkningsmediet. Fysiologisk den apikale pol acinarceller er i permanent kontakt med en bikarbonat-rige, let basisk væske giver anledning til bugspyt. Det er fristende at spekulere, at pH af den acinært celle miljø kunne være vigtigt at opretholde acinar differentiation stat. Nogle protokoller tidligere rapporteret anvendelse af et dyrkningsmedium med en pH justeret til 7,8 til efterligne "indledende" fysiologi acinarceller ^19.

Betydningen af teknikken

Det er vigtigt at nævne, at der findes andre protokoller til dyrkning acinarceller, ved hjælp af pancreas eksplanteret og organotypiske kulturer ^19. Deres anvendelse, baseret på bugspytkirtlen cellemigrering fra eksplantatet til membranen, hvor de dyrkes, er mere vanskeligt. Isolering af disse pancreasceller kræver bl.a. en første uge af pancreas eksplantation kultur. Den største fordel ved denne metode er, at ingen enzymatisk dissociering er nødvendig, således at både cellemembranen integritet og celle-til-celle-interaktioner er bevaret. Under disse betingelser, kan acinuscellerne opretholdes in vitro i op til 14 dage. Alligevel acinar cellen opnåede kultur er ikke ren og forurenende fibroblaster duktale calen, og endotelceller er uundgåeligt til stede, som kunne være uforenelige med nogle former for eksperimenter. I modsætning hurtigt vores fremgangsmåde giver en ren population af acinarceller, bevare deres oprindelige arkitektur acini.

Dorrell et al. Beskrevet en anden metode for at isolere de forskellige muse pancreatiske celletyper (herunder acinar, kanalen, og endokrine celler) under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) ^17. Denne metode er meget effektiv til opnåelse af en ren (eller specifik) population af acinar celler. Men det kræver et fluorescerende mærkning med specifikke antistoffer, før sortering. Desuden denne procedure kræver også en ekspertise i FACS og et flowcytometer. Desuden er denne teknik ikke tillader en udvidet kultur acinarceller, på grund af tabet af deres oprindelige arkitektur acini. Vores hurtige metode giver en udvidet in vitro kultur af dispergerede acinarceller med en kvalitet og en renhed, at enre kompatibel med de fleste af de yderligere rutine applikationer.

Fremtidige anvendelser

Når mestrer, bør denne teknik til at isolere / dyrkning acinarceller vise sig meget nyttig i fat på en række spørgsmål og især for at undersøge de mekanismer, der er involveret i bugspytkirtlen plasticitet og transdifferentiation, der er velkendte, men dårligt forstået. Ved at bevare nogle inter-og intracellulære kommunikation, spredte denne acini model er mere fysiologisk relevant end udødelige cellelinjer.

Inden for pancreas tumorigenese, giver denne primære celle model et passende system til at studere acinar celle transdifferentiation, en af ​​de mekanismer, der foreslås for at generere aggressive pancreascancer. Selvom udødeliggjort humane eller murine cellelinjer (f.eks Colo357, Panc-1 eller BxPC3) kan være mere fleksible at bruge end primære acinarceller både deres oprindelse og complex genetiske status (som transformerede cellelinier oprindeligt isoleret fra pancreas tumorer eller endda pancreas metastaser) udgør store ulemper i at studere sådanne mekanismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank’s Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth’s medium	Gibco	31220-023