Vi har utvecklat en metod för att utföra kors i Setaria viridis (S. viridis). Metoden involverar beskärning vippans före en varmvattenbehandling för att döda viabelt pollen. Crosses utförs efter en väl kontrollerad tillväxt regimen och vanligtvis leda till återvinning av 1-7 korspollinerade frön / s per vippans.
Setaria viridis är en framväxande modellsystem för C 4 gräs. Den är nära besläktad med den bioenergi råvara switchgrass och spannmålsskörden rävsvans hirs. Nyligen, den 510 Mb genomet av rävsvans hirs, S. italica har sekvenserats 1,2 och 25x täckning genomsekvens av luftig släkting S. viridis pågår. S. viridis har ett antal egenskaper som gör den till ett potentiellt utmärkt modell genetiskt system inklusive en snabb generationstid, liten kroppsbyggnad, enkla krav tillväxt, produktiv fröproduktion 3 och utvecklat system för både övergående och stabil transformation 4. Men genetiken av S. viridis är till stor del outforskat, delvis på grund av bristen på detaljerade metoder för kors. Hittills har ingen standardprotokoll antagits som möjliggör snabb produktion av frön från kontrollerade korsningar.
Protokollet presterade här är optimerad för att utföra genetiska korsningar i S. viridis, A10.1 anslutningen. Vi har anställt en enkel värmebehandling med varmt vatten för kastrering efter beskärning av panicle att behålla 20-30 buketter och märkning av blommor för att eliminera utsäde från nyutvecklade blommor efter kastrering. Efter att ha testat ett antal värmebehandlingar vid permissiva temperaturer och genom att variera varaktigheten av doppning, har vi etablerat en optimal temperatur och tidsintervall av 48 ° C under 3-6 min. Genom att använda denna metod kan utföras i minst 15 korsningar av en enda arbetare per dag och ett genomsnitt av 3-5 utparning avkomma per panicle kan återvinnas. Därför kan produceras i genomsnitt 45-75 utparning avkomma av en person under en enda dag. Bred tillämpning av denna teknik kommer att underlätta utvecklingen av rekombinanta inavlade linjer populationer av S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. italica, kartlägga mutationer genom bulk SEgregant analys och skapa högre mutanter order för genetisk analys.
S. viridis är ett NADP-ME subtyp C 4 gräs nära relaterad till bioenergi råvara switchgrass (NAD-ME-subtyp), spannmålsgrödor foxtail hirs, och jordbruks ogräs guinea gräs 5. Den 510 Mb genomet av odlad form av Setaria, S. italica, har nyligen sekvens 1,2 och 25x täckning genomsekvens av luftig släkting, S. viridis, pågår (opublicerad). S. viridis har ett antal egenskaper som gör den till ett potentiellt utmärkt modell genetiskt system inklusive en snabb generationstid, liten kroppsbyggnad, enkla krav tillväxt och produktiv utsädesproduktion 3. Huvudsakligen har metoder nyligen utvecklats för både övergående och stabil transformation av S. viridis, som ger möjlighet till att skapa transgena växter 4. Men en stor flaskhals i utvecklingen av genetiska verktyg för S. viridis är dess räkna omitrance att utkorsning. Hittills har ingen standardprotokoll publicerats som möjliggör snabb produktion av frö från kontrollerade korsningar.
Genetiska kors i S. italica vanligen utförs av kastrering genom borttagande av ståndarknappar från blommor 6,7,8 eller genom värmebehandling av blommor kvinnliga föräldrar 9-11. Efter dessa behandlingar, ståndarknappar eller vippor från icke-behandlade blommor / är manliga föräldrar försiktigt slipas mot pistillmärken släppa pollen. I kastrering är ståndarknappar bort med fin pincett direkt efter floret öppnas och anther börjar exsert, men har ännu inte gett ifrån sig pollen 6-8. Bland de utmaningar som denna senare metod är svårigheten att utföra kastrering i ett smalt tidsintervall mellan öppningen och pollen skjul av blomman. Varaktigheten för öppning och stängning av en enda blomma varierar beroende på anslutningen och miljöförhållanden, och kan variera från 7 min <sup> 6-2,5 tim 12 i S. italica. Sedan sprider pollen förekommer som ståndarknappar exsert från floret, ståndarknappar måste noga och snabbt tas bort, och därför är det svårt att undvika kontaminering på grund av självpollinering. Dessutom, som pollinations utförs omedelbart efter kastrering, är antalet korsningar som kan utföras per person / per dag begränsad.
Som en alternativ metod kan mogna panicles doppas i varmt vatten för att värma-kill utveckla pollenkorn 9,10,13,14 med fördelen av att utföra kors på ett stort antal vippor. Men temperaturen och varaktigheten av värmebehandlingen varierar stort mellan olika experiment (t.ex. 47 ° C under 10 min 14 och 42 ° C under 20 min 10). Dessutom har några systematiska analyser om effekten av värme-medierad emasculations publicerats. Sålunda kan en standard och enkelt förfarande för att utföra genetiska korsningar i S. viridis skulle kraftigt påskynda utvecklingen genetiska resurser och inrättandet av S. viridis som modellsystem inom forskarvärlden.
Vi rapporterar utveckling och optimering av ett standardprotokoll för att utföra genetiska korsningar i S. viridis. Växter odlas under kontrollerade miljöer för att synkronisera blomutveckling och öka reproducerbarheten av förfarandet. Crosses utförs med hjälp av en transgen S. viridis linje som den manliga föräldern som innehåller GUS reportergenen 4 för att underlätta identifieringen av framgångsrika kontrollerade genetiska korsningar. GUS transgen drivs av en ris ubikitinpromotor som gör det möjligt att göra poäng i F1 frön direkt efter skörd och därmed ger en enkel kvalitativ analys för att bestämma effektiviteten av kastrering och pollinering. Vi har anställt en enkel värmebehandling med varmt vatten för kastrering åtföljd av märkning av blommor som har emasculated att eliminera utsäde från nyutvecklade blommor efter kastrering. Efter att ha testat ett antal värmebehandlingar vid tillåtande temperaturer och variera längden på att doppa i varmt vatten, har vi etablerat en optimal temperatur och tid löptider på 48 ° C 3-6 min. En före gryningen kylbehandling befanns främja synkron anthesis i båda föräldrarna för att underlätta korsbefruktning. Vi har också diskuterat de viktigaste stegen i protokollet och den framtida tillämpningen av denna metod till andra Setaria anslutningar.
Vikten av före gryningen behandling
För att få en hög frekvens av utparning avkomma är det viktigt att ha högt synkron anthesis av manliga och kvinnliga föräldrar. Till en början cyklade vi temperatur och ljusregimer (31 ° C/22 ° C, dag / natt) och använde S. viridis anslutningen A10.1 för alla pollinations. Under dessa förhållanden, de flesta blommorna öppnar tidigt på morgonen innan temperaturen stiger till 31 ° C, även om några blommor öppna slumpvis mellan 08:00-8: 12:00. Tidigare studier i S. italica indikera att tiden på dygnet, plats och årstid bidrar till variation i blomning 7,15,16. Siles et al. 6 noterade att antes var associerad med snabba förändringar i temperatur och luftfuktighet, men inte med låg temperatur och hög luftfuktighet, i sig, som avslutades i tidigare studier 7,15. Därför använde vi en pre-dawn kylbehandling av 15 ° C i 30 minuter (från 8:30-9: 12:00) för att efterliknaden naturliga före gryningen tillstånd. Denna före gryningen kylbehandling hjälp att synkronisera anthesis i föräldrarnas. Vi observerade att trots att sätta kammaren för relativa fuktighetsnivåer av 50%, den relativa fuktigheten inuti kammaren ökas till en nivå över 70% när temperaturen sjönk från 22 ° C till 15 ° C och fortsatte att ligga över 70% till dess att temperaturen gradvis steg till 31 ° C efter 09:30. Vid 09:00, kastrerad kvinnliga föräldrar och växter av manliga föräldern kommer till labbet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%). Blommor av de manliga föräldrar börjar öppna runt 10:10, och pollinering kan utföras vid 10:30-11: 12:00. En detaljerad lista på alla reagenser och utrustning som finns i tabell 2.
Betydelsen av vippans förberedelse för kastrering
Enligt kammarförhållandena i denna studie (figur 1), hur länge primär panicle blommande varierade från2-3 dagar. Typiskt blommor placerade på den distala mitten av blomställning (figur 2A) öppna första och öppning föregår proximalt och distalt. Det ideala antalet blommor som ska behållas på panicle är 20-30. Försiktighet bör iakttas vid avlägsnandet av omogna blommor så att endast välutvecklade blommor (den översta blomman eller största på Småax 17) behålls. Märkning med röd markering på båda sidor av blommor hjälper att effektivt skilja förmodade outcross avkomma från frön från nyutvecklade blommor efter kastrering. Dessutom är det viktigt att lämna borsten på vippor innan kastrering för att skydda buketter från omfattande värmeskador, men som ett alternativ, de kan tas bort efter kastrering med hjälp av fjäder sax för att underlätta pollinering, speciellt när en vippans bindande Tekniken används (figur 2C och 2D).
Optimerad temperatur end behandlingstid för varmvattenbehandling
Grunden för kastrering genom varmt vatten doppning är att pollen är mer känsliga för värme än stigmatiserad yta. Dock får varaktigheten och temperaturen för värmebehandlingar varierar bland Setaria arter och anslutningar. I allmänhet kommer en högre temperatur med en kortare behandlingstid eller en lägre temperatur med en längre behandlingstid ha samma effekt på kastrering. Det har rapporterats att en värmebehandling vid 42 ° C under 20 min 10 eller 47 ° C under 10 min 14 renderade S. italica pollen icke-livskraftiga, men effektiviteten av dessa behandlingar var inte bestämd. Vi har utvecklat våra protokoll efter hypotesen att det enligt en optimerad temperatur och behandlingstid, pollen av alla blommor kvar på den kvinnliga föräldern kommer att vara icke-hållbara och samtidigt pistillmärken förblir mottaglig. Men efter att ha jämfört och analysera effekterna av olika temperaturer ochbehandlingsperioder (tabell 1), fann vi att känsligheten för värmebehandlingen varierar bland blommorna som behålls varje panicle, därför är det svårt att helt eliminera utsäde från självpollinering. Vi drar slutsatsen att effektiviteten vid produktionen utparning avkomma är störst när behandlingar utförs vid 48 ° C under 3-6 min i S. viridis anslutningen A10.1.
Peak tiden för blomningen och korspollinering
När blommorna nå mognad och är på väg att öppna, ståndarknappar är gulvit i färgen och pollen är skjulet så snart ståndarknappar exsert från blommorna 8. Ståndarknappar småningom bli brun efter pollen är skjulet som blommorna börjar stänga. När släpps, är livskraft pollen okänd. Därför är det viktigt att använda pollen från att öppnas eller nyöppnade blommor på den manliga föräldern så snart som möjligt. Under våra kammar förhållanden (Figur 1), majoriteten av flowers av de manliga föräldrar börjar öppna vid 10:10 och de öppnade blommorna skjul pollen vid 10:30. Således är det önskvärt fönstret för att utföra pollinering från 10:30 till 11:00. Pistillmärken förblir utanför glumes efter blommor nära och kan vara mottaglig för pollen. Detta har tidigare observerats och bekräftats i S. italica att pistillmärken är mottagliga för ca 48 h efter blomma öppning genom Siles et al. 6, så det är viktigt att väskan vippor efter värmebehandling och efter att ha utfört kontrollerade korsningar. Såsom diskuterats ovan, rekommenderar vi att prestanda pollinations på både dag 2 och dag 3 efter kastrering.
Metoder för pollinering
Vi jämförde effektiviteten hos tre pollinering tekniker. Om blommande blommor inte är begränsande, är vippans till vippans pollinering den mest effektiva tekniken och kommer att generera ett högre antal utparning avkomma. Om blommande vippor är begränsande, en högre frekvens av outcross avkomma kommer att produceras när den anther-till-stigma metod används. Vi har fått utparning avkomma från båda metoderna framgångsrikt. Den "bindande vippor" Metoden har använts i korsning S. italica 6 men vi hittade den här metoden för att vara den minst effektiva metoden som tidsfönster för pollen utsöndring av den manliga föräldern är kort. Dessutom finns det mindre kontroll över pollinering och borsten på S. viridis vippor kan också hindra förflyttning av pollen på stigmatiserad ytan.
Seed skörd, torkning och lagring
Efter skörden skall frön torkas vid 30-33 ° C under 2 dagar. Anthecium bör avlägsnas för GUS-färgning, om nödvändigt. Frön ska förvaras på en torr, sval plats (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) för korttidsförvaring (mindre än två år) eller i ett frö kammare (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) för långtidsförvaring.Dåliga lagringsförhållanden kan leda till låga lönsamhets priser 8. Vi har observerat att grobarheten av S. viridis A10.1 är cirka 5%, när sått 4 dagar efter skörden, men kan ökas till 90 till 96% efter lagring i laboratoriet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) för 110 dagar efter skörd, följt av en tre-dagars skiktning vid -80 ° C för att bryta frö dvala. För stratifieringen vid -80 ° C, kan torra frön placeras i en lufttät behållare (t.ex. mikro-centrifugrör eller mynt kuvert i en förseglad plastpåse) och hölls vid -80 ° C under 3 dagar före plantering. Efter 16 månaders lagring i laboratoriet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%), kan grobarhet procentsatser av 90-95% fortfarande erhållas. Dessutom, för att bryta den dvala, frön kan torkas vid 30-33 ° C under 2 dagar efter skörd, och sedan ges tre dagars skiktning vid -80 ° C följt av avlägsnande avanthecium före plantering. Efter dessa behandlingar, kan frögroning hastigheter på upp till 33% kan uppnås.
Fördelar, begränsningar och eventuella ändringar
Här ger vi den första standardprotokoll för att utföra kors i S. viridis A10.1 genom användning av en värmebehandling för kastrering. I motsats till fysisk kastrering, är detta protokoll mindre invasiv och relativt lätt att etablera sig i ett labb. Det brukar ta ungefär 15 minuter att trimma en Vippa och ca 15 vippor kan trimmas och korsade / person / dag. Om man antar ett genomsnitt av 3-5 utparning avkomma / vippans kan återvinnas under optimerade förhållanden, kan produceras totalt 45-75 utparning avkomma av en person på en enda dag. Dessutom kan denna teknik appliceras på kors i andra Setaria arter, även om ytterligare optimeringar kommer att vara sannolik. Om tillväxten kammarutrymme är begränsat, kan växterna odlas i växthus eller odlingsrum utan en före gryningen treatment tills panicle framträder innan de flyttas till de optimerade kammarförhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Sankalpi Warnasooriya och Amy Humboldt för kritisk läsning och redigering av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från Department of Energy (DE-SC0008769) och National Science Foundation (IOS-1.127.017).
Name | Company | Cat. Number | |
Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
Kimwipes | VWR International | 34120 | |
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |