我们已经开发了用于执行狗尾草 ( 狗尾草 )杂交的方法。该方法包括修剪穗前一个热水处理,以杀死可行的花粉。十字架执行下列一个良好控制的增长机制,通常导致1〜7异花授粉的种子/ s的每穗的恢复。
狗尾草是对C 4草一个新兴的模型系统。它是密切相关的生物能源原料柳枝稷和粮食作物谷子。近日,谷子,S的510 MB的基因组谷子,已被测序1,2和杂草相对S的25倍覆盖基因组序列贻贝正在进行中。S.贻贝有许多特点,使得它包括一个快速的生成时间,小身材,简单的生长要求,多产的种子生产3和开发系统瞬态和稳定转化4潜在的很好的模型遗传系统。然而,S的遗传学贻贝在很大程度上是未开发的,部分是由于缺乏详细的方法进行杂交。迄今为止,还没有标准的协议已被采纳,将允许快速生产的种子从控制的十字架。
该协议的压力ented这里是在S进行遗传杂交优化贻贝 ,加入A10.1。我们已经修剪穗保留20-30朵,花标识,以消除去雄后,新开发的花卉种子造成就业后用温水简单的热处理阉割。测试了一系列的热处理在许可的温度和浸泡不同的时间后,我们已经建立了一个最佳的温度和48℃的时间范围为3-6分钟。通过使用这种方法,至少15杂交可以通过每天单个工人进行和平均每穗3-5异型杂交的后代可以被回收。因此,平均45-75异型杂交后代可以由一个人在一天之内进行制造。广泛实施这一技术将有利于S的重组自交系群体的发展贻贝新时贻贝或S。贻贝新时谷子 ,通过批量映射本身的突变gregant分析和建立更高阶的突变体进行基因分析。
狗尾草是NADP-ME的C亚型4草密切相关的生物能源原料的柳枝稷(NAD-ME亚型),粮食作物谷子和农业杂草羊草5。的狗尾草,S的栽培形式的510 MB的基因组谷子,最近被测序1,2和杂草相对,S的25倍覆盖基因组序列贻贝 ,正在进行中(未发表)。S。贻贝有许多特点,使得它包括一个快速的生成时间,小身材,简单的生长要求,而且多产的种子生产3潜在的很好的模型遗传系统。重要的是,方法最近已被开发用于S的瞬态和稳定转化贻贝 ,提供了机会,创造转基因植物4。然而,在遗传工具为S的发展的一个主要瓶颈贻贝是其重新计算itrance到异交。迄今为止,还没有标准的协议已经公布,将允许快速生产的种子从控制的十字架。
在S遗传杂交谷子通常由阉割通过去除花药从花6,7,8或通过母本9-11鲜花热处理进行。下面的这些治疗,花药或未经处理的穗花/父本轻轻打磨柱头对花粉释放。在去雄,花药都用细镊子小花打开后,立即和花药也开始exsert删除,但仍未摆脱花粉6-8。其中后一种方法所面临的挑战是在花的开口和花粉脱落之间的窄的时间间隔进行去雄的难度。一花独放的开幕式和闭幕式的持续时间将视加入和环境条件而异,可以从7分钟<SUP> 6至2.5小时12 S。谷子 。自脱落花粉的发生是由于花药从小花exsert,花药需要仔细和迅速地除去,因此,很难以避免污染,由于自花授粉。此外,作为授粉被阉割后立即进行,也可以为每个人进行/每天杂交的数量是有限的。
作为一种替代方法,成熟的圆锥花序,可蘸温水加热,杀死发展花粉粒9,10,13,14与大量圆锥花序开展杂交的优势。然而,热处理的温度和持续时间从不同的实验( 例如,47℃,10分钟14至 42℃下进行20分钟10)广泛变化。此外,没有对热介导的emasculations疗效系统的分析已经出版。因此,对于在S进行遗传杂交的标准和简单的方法viridis将大大加快遗传资源的开发S.和建立贻贝作为研究界的一个模型系统。
我们报告的标准协议的开发和优化的S中进行遗传杂交贻贝 。植物在可控环境中进行同步花的发育和增加的程序的再现性生长。十字架使用的是转基因学执行贻贝线作为含有GUS报告基因4,以促进成功控制遗传杂交鉴定父本。 GUS的转基因是通过水稻泛素启动子使F1种子的收获进球后,立即,从而提供了一种简单的定性分析,以确定去雄和授粉的效率驱动。我们采用用温水简单的热处理去雄伴随着已emascula花卉标签特德以消除去雄后新开发的花产生种子。测试了一系列的热处理在许可的温度和不同浸在温水的时间之后,我们已经建立了48℃的最佳温度和持续时间3-6分钟。黎明前冷处理,发现以促进父母双方同步开花,以便于交叉授粉。我们还讨论了协议,这种方法的未来应用到其它狗尾草种质的关键步骤。
黎明前的治疗的重要性
要获得异交后代的高频,必须有男性和女性家长的高度同步开花。最初,我们循环温度和光照强度(31°C/22°C,日/夜)和使用的S。贻贝加入A10.1所有授粉。在这种情况下,最开放的花朵在清晨前的温度上升到31℃,虽然少数花开放之间随机8:00 AM-8:00 PM。以往的研究在酿酒谷子表明一天的时间,地点和季节的贡献开花7,15,16会有变化。锡莱斯等 6指出,花期用的温度和湿度的迅速变化相关联,但不与低温和高湿度,本身作为总结在以往的研究7,15。因此,我们采用了黎明前的冷处理的15℃30分钟(上午8:30 – 9:上午12时),以模仿自然黎明前的条件。这黎明前的冷处理辅助在父母的同步开花。我们观察到,尽管设置了腔室的相对湿度50%的水平,该腔室内部的相对湿度提高到一个电平在70%以上,随着温度从22℃降温至15℃,并继续留在70%以上,直到温度逐渐上升到31℃,之后9:30 AM。在上午9:00,阉割母本和父本植物被带到实验室(T:24.06°C±0.13°C,相对湿度:21.79%±1.15%)。父本花开始四处上午10:10开放,和授粉可以在10:30 AM-11来进行:上午00点。在表2中提供的所有试剂和设备的详细清单。
穗准备阉割的重要性
下腔室条件,在此研究中( 图1)中,初级圆锥花序开花时间介于2-3天。典型地,位于花序的远端中间( 图2A)开放的第一开放之前向近侧和远侧的花朵。鲜花被保留在穗理想的数字是20-30。应注意去除不成熟的鲜花时要采取这样只有发达的花朵(上小穗17最上面的花或最大)被保留。标签上的花朵两侧红色标记可以帮助去雄后,能够有效地辨别公认的异型杂交后代来自新开发的花卉种子。此外,重要的是要离开的圆锥花序刷毛去雄前保护小花从广泛的热损伤,但是,作为一种选择,它们可以被阉割后使用弹簧剪刀,以促进授粉除去,特别是当一个穗结合技术时( 图2C和2D)。
优化的温度D处理时间为温水处理
的基础上,通过温水浸泡去雄是花粉热比柱头表面更加敏感。然而,持续时间和热处理温度可能狗尾草物种和种质各不相同。在一般情况下,较高的温度下用较短的处理时间或较低的温度下具有较长的处理时间将不会对去雄相同的效果。已经报道了42℃的热处理20分钟,10或47℃下进行10分钟14呈现S.谷子花粉不存活,但是这些治疗的效率并没有确定。我们已经开发了协议后的假设,即优化处理温度和持续时间下,所有花朵的花粉保留在母本将为非可行的,而柱头仍将接受。然而,比较和分析不同温度的影响后治疗周期( 表1),我们发现,对热处理的敏感性之间留存在每个圆锥花序的花而变化,因而难以完全消除从自花授粉产生的种子。我们的结论是生产异型杂交后代的效率是最大的,当治疗是在48℃下在S进行3-6分钟贻贝加入A10.1。
花和异花授粉的高峰时间
当鲜花达到成熟阶段,并即将开放,花药黄白色的颜色和花粉是尽快从花药花8 exsert棚。花药逐渐变成褐色后,花粉脱落的花朵开始关闭。一旦释放,花粉的生活力是未知的。因此,要尽快用花粉的父本打开或刚刚打开的花朵是至关重要的。根据我们的室内条件下( 图1),多数flowe的男性家长RS开始打开在上午10:10和花朵开在棚10:30花粉。因此,理想的窗口进行授粉10:30和11:00之间。柱头后保持密切花的颖片外,可能是接受花粉。这先前已经观察到的和在S证实谷子的柱头是接受约48小时后花开放了西莱斯等。6,所以它是下列热处理重要的包穗和执行控制杂交后。正如上面所讨论的,我们建议双方第2天与第3天后期去雄授粉表现。
方法授粉
我们比较了三种授粉技术的效率。如果花开不是限制性的,穗至穗授粉是最有效的技术,并且将产生一个数字异型杂交后代的更高。如果圆锥花序开花都限制,邻频率较高当采用花药到柱头方法utcross子代会产生。我们已获得异交后代的两种方法成功。在“绑定穗”的方法已经在穿越S.被使用谷子 6,但我们发现这种方法是最有效的方法为时间窗口父本散粉是短暂的。另外,有较少的控制授粉和S上的刷毛贻贝穗数也可能阻碍花粉的运动到柱头表面。
种子采收,干燥和储存
收获后,种子应在30-33℃下干燥2天。 Anthecium应为GUS染色被除去,如果需要的话。种子应存放在干燥,阴凉的位置(T:24.06°C±0.13°C,相对湿度:21.79%±1.15%),用于短期存储(不超过两年),或在种子室(T:4.0 10°C±1.0°C,相对湿度:20%±1%),用于长期存储。可怜的储存环境也可能导致低生存能力率8。我们观察到S的发芽率贻贝 A10.1约为5%时,收获后4天播种,但可提高到90-96%,保存后在实验室(T:24.06°C±0.13°C,相对湿度:21.79%±1.15%)为110天收获后接着进行为期三天的分层在-80°C至打破种子休眠。对于分层在-80℃,干燥的种子可以被放置在一个密闭的容器( 如微离心管中或硬币包络在一个密封的塑料袋),并保持在-80℃下在播种前3天。存储后在实验室16个月(T:24.06°C±0.13°C,相对湿度:21.79%±1.15%),90〜95%发芽率仍然可以得到。此外,打破休眠,种子可在30-33℃干燥收获后第2天,然后再给予3天的分层,在-80℃,接着除去anthecium前种植。这些处理后,高达33%的种子发芽率可以达到。
优势,局限性和可能的修改
在这里,我们提供了第一个标准协议在S进行杂交贻贝 A10.1采用的去雄热处理。相较于物理阉割,这个协议是创伤小,比较容易建立一个实验室。它通常需要大约15分钟,修整一穗约15穗可修剪和交叉/人/天。假设平均3-5异型杂交后代/穗可在优化条件下被回收,总共45-75异型杂交后代可以由一个人在一天之内产生的。此外,这种技术可应用于跨越在其他狗尾草物种,尽管额外的优化将是可能的。如果生长室空间有限,植物可以在温室或生长室中生长没有一个黎明前的珍稀tment直到穗出现他们被转移到优化室内环境之前。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Sankalpi Warnasooriya和艾米洪堡的手稿的批判性阅读和编辑。这项工作是由能源部(DE-SC0008769)和美国国家科学基金会(IOS-1127017)资助。
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