우리는 강아지풀 트리아 비리 디스 (S. 트리아 비리 디스)에있는 십자가를 수행하기위한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 가능한 화분을 죽일 전에 뜨거운 물 처리에 원추 꽃차례를 치기 포함한다. 십자가는 잘 통제 성장 정권 다음을 수행하며 일반적으로 1 종 / s의 이삭 당 교차 수분 7의 회복이 발생할 수 있습니다.
강아지풀은 C 4 잔디에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 그것은 밀접 바이오 에너지 공급 원료의 스위치 그래스와 곡식 작물 아와 관련이 있습니다. 최근, 아와, S.의 510 메가 게놈 italica, 1,2 염기 서열과 잡초 상대 S.의 25 배 범위 게놈 서열되었습니다 트리아 비리 디스가 진행 중입니다. S. 트리아 비리 디스는 빠른 세대 시간, 작은 키, 간단한 성장 요구 사항, 다산 종자 생산 3 과도 안정 모두 변환 4 용으로 개발 된 시스템을 포함하는 잠재적으로 훌륭한 모델 유전 시스템을 만드는 특성을 가지고 있습니다. 그러나, S.의 유전학 트리아 비리 디스 인해 교차를 수행하기위한 상세한 방법의 부족 때문에, 부분적으로 큰폭 비경이다. 현재까지 표준 프로토콜은 제어 십자가에서 씨앗의 신속한 생산을 허용하는 것이다 채택되지 않았다.
프로토콜 압력ented 여기 S. 유전 십자가를 수행하기에 최적화되어 있습니다 트리아 비리 디스, 기탁 A10.1. 우리는 거세 후 새로 개발 된 꽃으로 인해 발생하는 씨앗을 제거하기 위해 20 ~ 30 작은 꽃과 꽃의 라벨을 유지하기 위해 원추 꽃차례를 가지 치기 후 거세를위한 따뜻한 물과 함께 간단한 열 처리를 사용했다. 관대 한 온도에서 열처리하는 일련의 테스트와 침지 시간을 변화 한 후, 우리는 3-6 분 동안 최적의 온도와 48 ° C의 시간 범위를 설립했다. 이 방법을 사용함으로써, 15 십자가의 최소 하루 단일 작업자에 의해 수행 될 수 있으며, 이삭 당 3-5 교배 자손의 평균 회수 할 수있다. 따라서, 45-75 교배 자손은 보통 하루에 한 사람에 의해 제조 할 수있다. 이 기술의 광범위한 구현은 S.의 재조합 근친 라인 인구의 개발을 촉진 할 것 트리아 비리 디스 X S. 트리아 비리 디스 또는 S. 트리아 비리 디스 X S. italica, 자체 대량을 통해 돌연변이를 매핑gregant 분석과 유전자 분석을위한 높은 순서 돌연변이를 생성.
S. 트리아 비리 디스 밀접 바이오 에너지 공급 원료의 스위치 그래스 (NAD-ME 하위 유형), 곡물 작물의 아와, 및 농업 잡초 기니 잔디 5에 관련된 NADP-ME 서브 타입 C 4 잔디입니다. 강아지풀, S.의 재배 형태의 510 메가 게놈 italica, 최근 1, 2 염기 서열과 잡초 상대, S.의 25 배 범위 게놈 서열되었습니다 트리아 비리 디스가 진행 중입니다 (미 출판). S. 트리아 비리 디스는 빠른 세대 시간, 작은 키, 간단한 성장 요구 사항, 다산 종자 생산 3를 포함하여 잠재적으로 훌륭한 모델 유전 시스템을 만드는 특성을 가지고 있습니다. 중요한 방법은 최근에 S. 모두 일시적이고 안정적인 전환을 위해 개발 된 형질 전환 식물체 4를 만들기위한 기회를 제공 트리아 비리 디스. 그러나, S. 유전 도구의 개발에서 주요 병목 트리아 비리 디스는 다시 계산합니다교배에 itrance. 현재까지 표준 프로토콜은 제어 십자가에서 씨앗의 신속한 생산을 허용하는 것이다 게시하지 않았습니다.
S. 유전 십자가 italica는 일반적으로 꽃 6,7,8에서 꽃밥의 제거를 통해 또는 여성 부모 9-11의 꽃의 열처리를 통해 거세에 의해 수행된다. 이러한 치료, 꽃밥 또는 처리하지 않은 꽃에서 원추 화서 다음 / 남성 부모 부드럽게 화분을 발표 낙인에 마모된다. 거세에, 꽃밥은 작은 꽃이 열리고 꽃밥이 exsert 시작 직후 미세 집게를 사용하여 제거하고 있지만 아직 꽃가루 6-8을 흘렸다 않았습니다. 이 후자의 도전 중 꽃의 개방과 꽃가루 창고 사이의 좁은 시간 간격에 거세를 수행하기에 어려움이있다. 하나의 꽃의 개폐 시간은 기탁 및 환경 조건에 따라 달라질 수 있습니다, 그리고 7 분에 이르기까지 다양 <SUP> 6 S.의 시간 12 2.5 italica. 꽃밥은 작은 꽃에서 exsert로 꽃가루 흘리는 것은 발생하기 때문에, 꽃밥은 신중하고 신속하게 제거 할 필요가 있고, 따라서 인해 자기 수분에 오염을 방지하기 어렵다. pollinations이 거세 직후에 수행되는 또, 하루 / 개인당 행할 수 크로스의 수는 제한된다.
다른 방법으로, 성숙한 원추 화서는 열 죽일 원추 화서의 많은 수의 십자가를 수행하는 이점 꽃가루에게 9,10,13,14을 개발하기 위해 따뜻한 물에 담근 수 있습니다. 그러나, 열처리 온도와 시간은 다른 실험 (20 분 10 10 분 (14)와 42 ° C에 대한 예를 들어, 47 ° C)에서 크게 다릅니다. 또한, 열 매개 emasculations의 효능에 대한 체계적인 분석은 발표되지 않았다. S. 유전 십자가를 수행 따라서, 표준 및 간단한 방법 Viridis 크게 S.의 유전자 자원 개발 및 구축을 가속화 할 연구 공동체 내에서 모델 시스템으로 트리아 비리 디스.
우리는 S. 유전 교배를 수행하기위한 표준 프로토콜의 개발 및 최적화를보고 트리아 비리 디스. 식물은 꽃 개발을 동기화 및 절차의 재현성을 높이기 위해 제어 환경에서 재배되고 있습니다. 십자가는 형질 전환 S를 사용하여 수행됩니다 성공적인 제어 유전 교배의 식별을 용이하게하기 GUS 리포터 유전자를 함유하는 4 수형 부모로 트리아 비리 디스 라인. GUS 형질 전환 유전자는 즉시 수확 후 F1 종자의 점수를 가능하게하고, 따라서 거세과 수분의 효율성을 결정하는 쉬운 질적 분석을 제공하는 쌀 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동된다. 우리는 emascula왔다 꽃의 표시와 함께 거세 따뜻한 물에 간단한 열 처리를 사용했다테드는 거세 후 새로 개발 된 꽃으로 인해 발생하는 씨앗을 제거한다. 관대 한 온도에서 열처리하는 일련의 테스트를 따뜻한 물에 담그는 시간을 변화 한 후, 우리는 3-6 분에서 48 ° C의 최적의 온도 및 시간 기간을 설립했다. 새벽 찬 치료는 간 수분을 용이하게하기 위해 부모의 동기 개화를 촉진하는 것으로 확인되었다. 우리는 또한 다른 강아지풀의 accessions의 프로토콜과이 방법의 미래 응용 프로그램의 주요 단계를 설명했다.
새벽 치료의 중요성
교배 자손의 높은 주파수를 얻을 수는 남성과 여성의 부모의 높은 동기 개화를하는 것이 필수적입니다. 처음에, 우리는 온도와 빛 정권을 순환 (31 ° C/22 ° C, 일 / 1 박) 및 S를 사용 모든 pollinations에 대한 트리아 비리 디스의 기탁 A10.1. 정오 : 온도가 31 ° C로 상승하기 전에 이러한 조건에서, 대부분의 꽃은 몇 가지 꽃 개방하지만 무작위로 오전 8시 – 8 사이에 아침 일찍 엽니 다. S.의 이전 연구 italica 하루의 시간을 표시, 위치, 계절 개화 7,15,16의 변화에 기여한다. 실 레스 등. 6은 이전의 연구 7,15 체결로 개화는, 온도와 습도의 급격한 변화와 관련된, 그러나 낮은 온도와 높은 습도, 자체되었음을 지적했다. 모방 : 따라서, 우리는 (자정 오전 8시 30 분 9에서) 30 분 동안 15 ° C의 새벽 감기 치료를 고용자연 새벽 상태. 이 새벽 감기 치료는 부모의 개화를 동기화하는 원조. 우리는 50 %의 상대 습도 수준의 챔버를 설정에도 불구하고, 챔버 내부의 상대 습도는 온도가 15 ° C에 22 ° C에서 떨어 70 % 이상 수준으로 증가하고, 온도까지 70 % 이상으로 유지하는 것을 계속 관찰 점차 오전 9시 반 후 31 ° C로 상승했다. 오전 9시, 여성 부모를 거세한 수컷 부모의 식물은 실험실로 이동됩니다 (T : 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH를 ±). 남성 부모의 꽃 오전 10:10 주위에 개방을 시작하고, 수분 10:30 AM-11에서 수행 할 수 있습니다 자정. 모든 시약 및 기기의 자세한 목록은 표 2에 제공된다.
거세에 대한 이삭 준비의 중요성
이 연구 결과 (그림 1)의 챔버 조건에서 기본 이삭 피는 기간은 원거리에서2~3일. 일반적으로 (그림 2A) 열린 응급 개방이 선행 근위 및 원위 꽃차례의 원심 중간에있는 꽃. 휘어 유지하는 꽃의 이상적인 수는 20 ~ 30이다. 만 잘 발달 된 꽃 (이삭 17 최상위 꽃 또는 큰)이 유지되도록주의 미성숙 한 꽃의 제거시주의해야한다. 꽃의 양쪽에 빨간색 마커와 라벨을 효율적으로 거세 후 새로 개발 된 꽃에서 씨앗에서 추정 교배 자손을 구별하는 데 도움이됩니다. 또, 광범위한 열 손상으로부터 작은 꽃을 보호하기 거세 전에 원추 화서에 강모를 남길 중요하지만, 옵션으로, 그들은 휘어 바인딩 특히, 수분을 용이하게하기 위하여 스프링 가위를 사용 거세 후에 제거 될 수있다 기술은 (그림 2C와 2D) 사용된다.
최적화 된 온도따뜻한 물 처리를위한 D의 치료 기간
따뜻한 물에 담그고을 통해 거세의 기본은 꽃가루 성흔 표면보다 열에 더 민감하다는 것이다. 그러나, 기간 및 열처리의 온도는 강아지풀 종 및 가입에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로, 더 짧은 처리 시간 또는 더 긴 처리 시간에 따라 더 낮은 온도와 높은 온도는 거세에 동일한 효과를 가질 것이다. 이보고되고있다 그 20 분 10 10 분 동안 47 ° C 14 렌더링 S. 42 ° C의 열 처리 italica 화분이 아닌 생존하지만, 이러한 치료의 효율은 결정되지 않았습니다. 우리는 치료의 최적화 된 온도와 기간에 따라, 모든 꽃의 꽃가루가 암술 머리가 수용 남아있는 동안 여성의 부모가 아닌 실행 가능한 것입니다에 유지 가설 다음과 같은 우리의 프로토콜을 개발했습니다. 그러나, 여러 가지 온도의 효과를 비교하고 분석 한 후와치료 기간 (표 1), 우리는 따라서 완전히 자화 수분으로 인해 종자를 제거하기 어렵고, 열처리에 대한 감도가 각각 휘어 유지 꽃 중 달라하였습니다. 우리는 치료가 S.에 3-6 분 동안 48 ° C에서 수행 할 때 교배 자손을 생산의 효율성이이 이상없는 결론 트리아 비리 디스의 기탁 A10.1.
개화와 교차 수분의 피크 시간
꽃은 성숙에 도달하고 열려고 할 때, 꽃밥 컬러로 황백색이며 화분은 즉시 꽃밥은 꽃 8에서 exsert로 흘렸다. 꽃이 닫 시작으로 꽃가루가 흘려 후 꽃밥은 점차 갈색십시오. 일단 출시, 꽃가루의 생존은 알 수 없습니다. 따라서, 가능한 빨리 수컷 부모에 개구 또는 갓 열린 꽃에서 꽃가루를 사용하는 것이 중요하다. 우리의 챔버 조건 (그림 1), 꽃 펜던트의 대부분에서남성 부모의 RS 오전 10:10에 열 시작하고 열린 꽃은 오전 10시 30 분 꽃가루를 흘렸다. 따라서, 수분을 수행하는 것이 바람직 창 오전 10시 반에서 오전 11시까지입니다. 낙인은 가까운 꽃 후 포영 밖에 남아 화분을 받아 들일 수있다. 이것은 이전에 관찰 S.에서 확인되었다 italica 낙인이 실 레스 등. 6 약 48 시간 후 꽃 개방 수용, 그래서 그것은 열처리 다음 가방 원추 화서에 중요하고 제어 십자가를 수행 한 후입니다. 전술 한 바와 같이, 우리는 2 일 및 3 일 후 거세 모두에서 실적이 pollinations을 추천합니다.
수분 방법
우리는 3 수분 기법의 효율을 비교 하였다. 피 꽃이 제한되지 않으면, 휘어 투 휘어 수분이 가장 효율적인 기술이며 교배 자손의 수를 높게 얻을 것이다. 피 원추 화서는 O의 높은 주파수를 제한하는 경우꽃밥 투 낙인 방법이 사용될 때 utcross 자손이 생산 될 것이다. 우리는 성공적으로 두 가지 방법에서 교배 자손을 얻었다. "바인딩 원추 화서"방법은 S.을 건너에서 사용되었다 italica 6 그러나 우리는 남성 상위의 화분 흘리기에 대한 시간 창이 부족이 방법이 가장 효율적인 방법이 발견. 또한, 적은 수분 제어 및 S.의 강모가있다 트리아 비리 디스의 원추 화서는 성흔 표면에 꽃가루의 이동을 방해 할 수 있습니다.
종자 수확, 건조, 저장
수확 후 씨는 2 일 동안 30 ~ 33 ° C에서 건조해야한다. 필요한 경우 Anthecium는 GUS 염색을 위해 제거해야합니다. 씨앗은 건조하고 서늘한 장소에 보관해야합니다 (T : 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH를 ±) T (단기 기억 (2 년 미만) 또는 시드 챔버 : 4.0 장기 저장을 위해 20 % ± 1 %) : 10 ° C 1.0 ° C, RH를 ±.별로 보관 조건은 낮은 생존 비율 8 발생할 수 있습니다. 우리는 관찰하는 S.의 발아율 트리아 비리 디스의 A10.1는 사일 수확 후 파종하면 약 5 %이지만, 실험실 (T 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C가 0.13 ° C, RH를 ±)에 저장 한 후 90-96%로 증가 할 수있다 (110) 일 후 수확 종자 휴면 휴식 -80 ° C에서 사흘 층화 하였다. -80 ° C에서의 계층화를 들어, 건조 씨앗 밀폐 용기 (예를 들어, 마이크로 원심 분리기 튜브 또는 봉인 된 비닐 봉투에 동전 봉투)에 배치 될 수 있으며, 심기 전에 3 일 동안 -80 ° C로 유지. 실험실에서 저장 16 개월 후 (T : 24.06 ° C가 0.13 ° C, RH ± 1.15 % ± 21.79 %)을, 90 % -95 %의 발아 비율은 여전히 얻을 수있다. 또한, 수면을 깰, 종자 수확 후 2 일 동안 30 ~ 33 ℃에서 건조 할 수 있으며, 다음의 제거 다음에 -80 ° C에서 사흘 층화 제공anthecium 전에 심기. 이 처리 후, 33 %까지의 종자 발아 속도가 달성 될 수있다.
장점, 한계와 가능성 수정
여기에서 우리는 S.에서 십자가를 수행하기위한 최초의 표준 프로토콜을 제공 거세위한 열처리를 사용하여 트리아 비리 디스의 A10.1. 물리적 거세는 대조적으로,이 프로토콜은 적게 침략과 실험실에서 확립 상대적으로 쉽습니다. 그것은 일반적으로 하나의 원추 꽃차례를 트림 약 15 분 소요되며 약 15 원추 화서 트리밍 및 / 인 / 일 교차 할 수있다. 3-5 교배 자손 / 휘어의 평균을 가정하면 최적 조건에서 회수 할 수있다, 45-75 교배 자손의 전체는 하루에 한 사람에 의해 제조 할 수있다. 또한,이 기술은 추가적인 최적화가 가능성이있을 것이지만, 다른 강아지풀 종에 교차하도록 적용될 수있다. 성장 챔버 공간이 제한되어있는 경우, 식물은 새벽 누없이 그린 하우스 또는 성장 챔버에서 재배 할 수있다그들은 최적화 된 챔버 상태로 이동하기 전에 이삭이 나올 때까지 tment.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 Sankalpi Warnasooriya 에이미 훔볼트 감사합니다. 이 작품은 에너지 부 (DE-SC0008769)과 국립 과학 재단 (IOS-1127017)에서 교부금에 의해 지원되었다.
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