Vi har utviklet en metode for å utføre kors i Setaria viridis (S. viridis). Fremgangsmåten omfatter beskjæring av panicle forut for varmtvannsbehandling for å drepe levedyktig pollen. Kors blir utført ved å følge en vel-kontrollert vekst regime og typisk resultere i utvinning av 1-7 kryssbestøvet frø / s per panicle.
Setaria viridis er en ny modellsystem for C 4 gress. Det er nært knyttet til bioenergi råstoff switchgrass og kornavlinga revehale hirse. Nylig, den 510 Mb genomet av revehale hirse, S. italica, har blitt sekvensert 1,2 og 25x dekning genomsekvens av den slankere slektning S. viridis pågår. S. viridis har en rekke egenskaper som gjør det til et potensielt utmerket modell genetisk system inkludert en rask generasjonstid, liten av vekst, enkle vekst krav, produktive frøproduksjon tre og utviklet systemer for både forbigående og stabil transformasjon fire. Imidlertid genetikk av S. viridis er lite utforsket, delvis på grunn av mangel av detaljerte metoder for å utføre kors. Til dags dato har ingen standard protokoll er vedtatt som vil tillate rask produksjon av frø fra kontrollerte krysninger.
Protokollen presoppdelt i avdelinger her er optimalisert for å utføre genetiske krysninger i S. viridis, tiltredelse A10.1. Vi har ansatt en enkel varmebehandling med varmt vann for emasculation etter beskjæring panicle å beholde 20-30 buketter og merking av blomster for å fjerne frøene som følge av nyutviklede blomster etter emasculation. Etter testing av en serie med varmebehandlinger ved temperaturer ettergivende og variere varigheten av dypping, er det etablert en optimal temperatur og tidsområde på 48 ° C i 3-6 min. Ved å bruke denne metoden, kan et minimum av 15 kors utføres av en enkelt arbeidstaker per dag og et gjennomsnitt på 3-5 utkrysning avkom per panicle kan utvinnes. Derfor kan et gjennomsnitt på 45-75 outcross avkom blir produsert av en person på en enkelt dag. Bred implementering av denne teknikken vil lette utviklingen av rekombinante innavlede linjer bestander av S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. italica, kartlegging mutasjoner gjennom bulk segregant analyse og skape høyere ordens mutanter for genetisk analyse.
S. viridis er en NADP-ME subtype C 4 gress nært knyttet til bioenergi råstoff switch (NAD-ME subtype), korn avling revehale hirse, og landbruket luke guinea gress fem. Den 510 Mb genomet av dyrket form av Setaria, S. italica, har nylig blitt sekvensert 1,2 og 25x dekning genomsekvens av den slankere slektning, S. viridis, pågår (upublisert). S. viridis har en rekke egenskaper som gjør det til et potensielt utmerket modell genetisk system inkludert en rask generasjonstid, liten av vekst, enkle vekst krav, og produktive frøproduksjon tre. Viktigere, har metoder nylig blitt utviklet for både forbigående og stabil transformasjon av S. viridis, som gir mulighet for å skape transgene planter 4.. Imidlertid er en stor flaskehalsen for utviklingen av genetiske verktøy for S. viridis er dens Recalcitrance til outcrossing. Til dags dato har ingen standard protokoll blitt publisert som vil tillate rask produksjon av frø fra kontrollerte krysninger.
Genetiske kors i S. italica er vanligvis utføres av emasculation gjennom fjerning av pollenknapper fra blomster 6,7,8 eller gjennom varmebehandling av blomster av kvinnelige foreldre 9-11. Etter disse behandlingene, pollenknapper eller panicles fra ikke-behandlede blomster / er mannlige foreldre forsiktig slipes mot arr slippe pollen. I emasculation, er pollenknapper fjernes med fin pinsett umiddelbart etter floret åpner og anther begynner å exsert, men har ennå ikke felle pollen 6-8. Blant utfordringene ved denne sistnevnte metode er vanskeligheten med å utføre emasculation i et smalt tidsintervall mellom åpningen og pollen skur av blomsten. Varigheten av åpning og lukking av en enkelt blomster vil variere avhengig av den inntreden-og miljømessig tilstand, og kan variere fra 7 min <sup> 6 til 2,5 hr 12 i S. italica. Siden Shedding av pollen oppstår som pollenknapper exsert fra floret, pollenknapper må fjernes nøye og raskt, og derfor er det vanskelig å unngå forurensning som skyldes selv-pollinering. I tillegg, som polli utføres umiddelbart etter emasculation, er antall krysninger som kan utføres per person / per dag begrenset.
Som en alternativ metode, kan moden panicles dyppes i varmt vann for å varme-drepe utvikle pollenkorn 9,10,13,14 med fordelen av å utføre kors på et stort antall panicles. Imidlertid, temperaturen og varigheten av varmebehandlingen varierer mye fra forskjellige eksperimenter (f. eks 47 ° C i 10 min 14 og 42 ° C i 20 min 10). Videre har ingen systematisk analyse av effekten av varme-mediert emasculations blitt publisert. Således, en standard og enkel metode for utførelse av genetiske krysninger i S. viridis ville sterkt akselerere genetisk ressurs utvikling og etablering av S. viridis som modellsystem innen forskersamfunnet.
Vi rapporterer utvikling og optimalisering av en standard protokoll for å utføre genetiske kors i S. viridis. Planter dyrkes under kontrollerte forhold for å synkronisere blomsterutvikling og øker reproduserbarheten av prosedyren. Crosses er utført ved hjelp av en transgen S. viridis linje som den mannlige overordnede som inneholder GUS reporter genet 4 for å lette identifiseringen av vellykkede kontrollerte genetiske kors. Den GUS transgenet blir drevet av en ris Ubiquitin promoter som muliggjør scoring av F1 frø umiddelbart etter høsting og derved gir en lett kvalitativ analyse for å bestemme effektiviteten av emasculation og pollinering. Vi har ansatt en enkel varmebehandling med varmt vann for emasculation ledsaget av merking av blomster som har vært emasculated å fjerne frøene som følge av nyutviklede blomster etter emasculation. Etter å ha testet en rekke varmebehandling ved givende temperaturer og varierende varighet dyppe i varmt vann, har vi etablert en optimal temperatur og tid varigheten av 48 ° C 3-6 min. En pre-daggry kuldebehandling ble funnet å fremme synkron anthesis i begge foreldre for å lette krysspollinering. Vi har også diskutert de viktigste trinnene i protokollen og den fremtidige anvendelsen av denne metoden til andre Setaria tiltredelser.
Viktigheten av pre-daggry behandling
For å få en høy frekvens av utkrysning avkom er det viktig å ha høyt synkron anthesis av mannlige og kvinnelige foreldre. I første omgang, vi syklet temperatur og lys regimer (31 ° C/22 ° C, dag / natt) og brukte S. viridis tiltredelse A10.1 for alle polli. Under disse forholdene, de fleste blomstene åpner tidlig på morgenen før temperaturen stiger til 31 ° C, men noen blomster åpen tilfeldig mellom 08:00-8: 24:00. Tidligere studier i S. italica tyder på at tidspunktet på dagen, beliggenhet og sesong bidra til variasjon i anthesis 7,15,16. Siles et al. 6. bemerkes at anthesis var forbundet med hurtige endringer i temperatur og fuktighet, men ikke med lav temperatur og høy fuktighet, per se, som avsluttes i tidligere studier 7,15. Derfor har vi benyttet et forhånds dawn kuldebehandling på 15 ° C i 30 min (fra 08:30-9: 00 AM) for å etterligneden naturlige pre-daggry tilstand. Denne pre-daggry kaldt behandling hjulpet i synkronisering anthesis i foreldrene. Vi har observert at til tross for innstilling av kammeret for relativ luftfuktighet på 50%, den relative fuktighet inne i kammeret økes til et nivå over 70% som temperaturen falt fra 22 ° C til 15 ° C og fortsatte å holde seg over 70% til temperaturen gradvis steg til 31 ° C etter 09:30. Ved 09:00, emasculated kvinnelige foreldre og planter av mannlige overordnede er brakt til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%). Blomster av de mannlige foreldre begynne å åpne rundt 10:10, og pollinering kan utføres ved 10:30-11: 00 AM. En detaljert liste over alle reagenser og utstyr er gitt i tabell 2.
Viktigheten av panicle forberedelse for emasculation
Under kammerforhold i denne studien (figur 1), varigheten av primær panicle blomstringen varierte fra2-3 dager. Vanligvis blomster som ligger på den distale midten av blomsterstanden (figur 2A) åpne første og åpning forut proksimalt og distalt. Det ideelle antall blomster som skal beholdes på panicle er 20-30. Forsiktighet bør utvises ved fjerning av umodne blomster slik at bare velutviklede blomster (den øverste blomst eller største på spikelet 17) beholdes. Merking med rød markør på begge sider av blomstene hjelper å effektivt skille utlagde utkrysning avkom fra frø fra nyutviklede blomster etter emasculation. I tillegg er det viktig å la bustene på de panicles før emasculation å beskytte florets fra utstrakt varmeskader, men som et alternativ, kan de fjernes etter emasculation ved hjelp av fjær saks for å lette pollinering, spesielt når en panicle bindende Teknikken er ansatt (Tall 2C og 2D).
Optimalisert temperatur envarighet d behandling for varmt vann behandling
Grunnlaget for emasculation gjennom varmt vann dypping er at pollen er mer følsom for varme enn den stigmatic overflate. Imidlertid kan varigheten og temperaturen på varmebehandling varierer blant Setaria arter og tiltredelser. Generelt vil en høyere temperatur til å redusere behandlingstiden eller en lavere temperaturer med lengre behandlingstiden har den samme effekt på emasculation. Det har blitt rapportert at en varmebehandling på 42 ° C i 20 min 10 eller 47 ° C i 10 min 14 gjengitt S. italica pollen ikke-levedyktige, men effektiviteten av disse behandlingene ble ikke bestemt. Vi har utviklet protokollen etter hypotesen at under en optimal temperatur og varighet av behandlingen, pollen av alle blomstene beholdt på hunn foreldre vil være ikke-levedyktig, mens stigmas vil forbli mottakelig. Imidlertid, etter å sammenligne og å analysere virkningene av flere temperaturer ogbehandlingsperioder (Tabell 1), fant vi at følsomheten til varmebehandling varierer blant blomstene beholdt på hver panicle, og dermed er det vanskelig å helt eliminere frø som følge av selv-pollinering. Vi konkluderer med at effektiviteten av fremstilling outcross avkom er størst når behandling utføres ved 48 ° C i 3-6 min i S. viridis tiltredelse A10.1.
Peak tiden av anthesis og krysspollinering
Når blomstene modnes og er i ferd med å åpne, pollenknapper er gulaktig hvit i fargen og pollen er utgytt så snart pollenknapper exsert fra blomster åtte. Pollenknapper gradvis bli brun etter pollen er utgytt som blomstene begynner å lukke. Når frigjort, er levedyktigheten til pollen ukjent. Derfor er det viktig å bruke pollen fra å åpne eller ferskt åpnede blomster på hannmoder så snart som mulig. Under våre kammerforhold (figur 1), flertallet av blomstrs av de mannlige foreldrene begynner å åpne på 10:10 og de åpnede blomster skur pollen på 10:30. Dermed er det ønskelig vinduet for å utføre pollinering 10:30-11:00. De arr forbli utenfor glumes etter blomster nære og kan være mottakelige for pollen. Dette har tidligere blitt observert og bekreftet i S. italica at stigmas er mottakelig for omtrent 48-timers post-blomst åpning av Siles et al. 6., så er det viktig å pose panicles etter varmebehandling, og etter å utføre kontrollerte kors. Som omtalt ovenfor, anbefaler vi utfører polli på både Dag 2 og dag 3 post-emasculation.
Metoder for pollinering
Vi sammenlignet effektiviteten av tre pollinering teknikker. Hvis blomster ikke er begrensende, er panicle-til-panicle pollinering den mest effektive teknikken og vil gi et høyere antall outcross avkom. Hvis blomstrende panicles er begrensende, en høyere frekvens av outcross avkom vil bli produsert når anther-til-stigma metoden brukes. Vi har fått utkrysning avkom fra begge metodene hell. Den "bindende panicles" Metoden har vært brukt i krysset S. italica seks, men vi fant denne metoden for å være den minst effektive metoden som tidsvinduet for pollen Shedding av den mannlige overordnede er kort. Videre er det mindre kontroll over pollinering og busten på S. viridis panicles kan også hindre bevegelsen av pollen på stigmatic overflaten.
Seed høsting, tørking og lagring
Etter høsting, bør frøene tørkes ved 30-33 ° C i 2 dager. Anthecium bør fjernes for GUS farging, hvis det er nødvendig. Frø bør lagres på et tørt, kjølig sted (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) for kort tid (mindre enn to år) eller i et frø kammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) for langtidslagring.Dårlig lagringsforhold kan resultere i lave levedyktighet priser åtte. Vi har observert at spiring rate på S. viridis A10.1 er ca 5% når sådd fire dager etter høsting, men kan økes til 90-96% etter lagring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) for 110 dager etter høsting, etterfulgt av en tre-dagers stratifisering ved -80 ° C for å bryte frø dvalen. For lagdelingen ved -80 ° C, kan tørre frø plasseres i en lufttett beholder (for eksempel mikro-sentrifugerør eller mynt konvolutt i en forseglet plastpose) og holdt ved -80 ° C i 3 dager før planting. Etter 16 måneders lagring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%), kan spiring prosenter av 90-95% fortsatt oppnås. I tillegg til å bryte den uvirksom, frø kan tørkes ved 30-33 ° C i 2 dager etter høsting, og deretter gitt tre-dagers stratifisering ved -80 ° C, etterfulgt av fjerning avanthecium før planting. Etter disse behandlinger kan frøspiring hastigheter på opp til 33% kan oppnås.
Fordeler, begrensninger og mulige endringer
Her gir vi den første standardprotokoll for å utføre kors i S. viridis A10.1 ved hjelp av en varmebehandling for emasculation. I motsetning til fysisk emasculation, er denne protokollen mindre invasiv og relativt lett å etablere seg i et laboratorium. Det tar vanligvis ca 15 min å trimme en panicle og ca 15 panicles kan trimmes og krysset / person / dag. Forutsatt et gjennomsnitt på 3-5 utkrysning avkom / panicle kan gjenopprettes under optimaliserte forhold, kan totalt 45-75 utkrysning avkom bli produsert av en person på en enkelt dag. Videre kan denne teknikken bli anvendt for å passet i andre Setaria arter, skjønt andre optimaliseringer vil være sannsynlig. Dersom veksten kammer plassen er begrenset, kan plantene dyrkes i drivhus eller vekstkamrene uten en pre-daggry treatment inntil panicle framgår før de flyttes til de optimaliserte kammerforhold.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sankalpi Warnasooriya og Amy Humboldt for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Department of Energy (DE-SC0008769) og National Science Foundation (IOS-1127017).
Name | Company | Cat. Number | |
Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
Kimwipes | VWR International | 34120 | |
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |