हम Setaria viridis (एस viridis) में पार के प्रदर्शन के लिए एक पद्धति को विकसित किया है. विधि व्यवहार्य पराग को मारने के लिए पहले एक गर्म पानी के उपचार के लिए पुष्पगुच्छ छंटाई शामिल है. क्रॉस एक अच्छी तरह से नियंत्रित विकास के शासन के बाद किया जाता है और आम तौर पर 1 बीज / एस पुष्पगुच्छ प्रति पार परागण से 7 की वसूली में परिणाम हैं.
Setaria viridis सी 4 घास के लिए एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है. यह निकटता bioenergy फीड स्टॉक switchgrass और अनाज फसल लोमड़ी की पूंछ बाजरा से संबंधित है. हाल ही में, लोमड़ी की पूंछ बाजरा, एस के 510 एमबी जीनोम Italica, 1,2 अनुक्रम और पतला रिश्तेदार एस के एक 25x कवरेज जीनोम अनुक्रम की गई है viridis कार्य प्रगति पर है. एस viridis यह एक तेजी पीढ़ी समय, छोटे कद, साधारण विकास आवश्यकताओं, विपुल बीज उत्पादन 3 और क्षणिक और स्थिर दोनों परिवर्तन 4 के लिए विकसित प्रणालियों सहित एक संभावित उत्कृष्ट मॉडल आनुवंशिक प्रणाली बनाने कि विशेषताओं का एक नंबर है. हालांकि, एस के आनुवंशिकी viridis वजह पार प्रदर्शन के लिए विस्तृत तरीकों की कमी के कारण, भाग में, बड़े पैमाने पर बेरोज़गार है. तिथि करने के लिए, कोई मानक प्रोटोकॉल नियंत्रित पार से बीज का तेजी से उत्पादन की अनुमति होगी कि अपनाया गया है.
प्रोटोकॉल दबावented यहाँ एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए अनुकूलित है viridis, परिग्रहण A10.1. हम निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए 20-30 फ्लोरेट्स और फूलों की लेबलिंग बनाए रखने के लिए पुष्पगुच्छ छंटाई के बाद निर्बलता के लिए गर्म पानी के साथ एक सरल गर्मी उपचार कार्यरत है. अनुमोदक तापमान पर गर्मी उपचार की एक श्रृंखला के परीक्षण और सूई से अलग अवधि के बाद, हम 3-6 मिनट के लिए एक अधिकतम तापमान और 48 डिग्री सेल्सियस के समय सीमा की स्थापना की है. इस पद्धति का उपयोग करके, 15 पार की एक न्यूनतम प्रति दिन एक भी कार्यकर्ता द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है और पुष्पगुच्छ प्रति 3-5 outcross संतान के एक औसत बरामद किया जा सकता है. इसलिए, 45-75 outcross संतान के एक औसत एक ही दिन में एक व्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इस तकनीक का व्यापक कार्यान्वयन एस के पुनः संयोजक जन्मजात लाइन आबादी के विकास की सुविधा होगी viridis एक्स एस viridis या एस viridis एक्स एस Italica, एसई थोक के माध्यम से म्यूटेशन मानचित्रणgregant विश्लेषण और आनुवांशिक विश्लेषण के लिए उच्च आदेश म्यूटेंट बनाने.
एस viridis बारीकी bioenergy फीड स्टॉक switchgrass (NAD-ME उप प्रकार), अनाज फसल लोमड़ी की पूंछ बाजरा, और कृषि घास गिनी घास 5 से संबंधित एक NADP-ME उप प्रकार सी 4 घास है. Setaria, एस की खेती के फार्म का 510 एमबी जीनोम Italica, हाल ही में 1,2 अनुक्रम और पतला रिश्तेदार, एस के एक 25x कवरेज जीनोम अनुक्रम की गई है viridis, कार्य प्रगति पर है (अप्रकाशित). एस viridis यह एक तेजी पीढ़ी समय, छोटे कद, साधारण विकास की आवश्यकताओं, और विपुल बीज उत्पादन 3 सहित एक संभावित उत्कृष्ट मॉडल आनुवंशिक प्रणाली बनाने कि विशेषताओं का एक नंबर है. महत्वपूर्ण बात है, तरीकों हाल ही में एस के दोनों क्षणिक और स्थिर परिवर्तन के लिए विकसित किया गया है ट्रांसजेनिक पौधों 4 बनाने के लिए अवसर प्रदान करते हैं जो viridis. हालांकि, एस के लिए आनुवंशिक उपकरणों के विकास में एक बड़ी अड़चन viridis अपने recalc हैoutcrossing को itrance. तिथि करने के लिए, कोई मानक प्रोटोकॉल नियंत्रित पार से बीज का तेजी से उत्पादन की अनुमति होगी कि प्रकाशित किया गया है.
एस में जेनेटिक पार Italica आमतौर पर फूलों 6,7,8 से anthers को हटाने के माध्यम से या महिला के माता पिता 9-11 के फूलों की गर्मी उपचार के माध्यम से निर्बलता से प्रदर्शन कर रहे हैं. इन उपचार, anthers या गैर इलाज फूलों से panicles के बाद / पुरुष माता पिता धीरे पराग रिहा कलंक के खिलाफ abraded रहे हैं. निर्बलता में, anthers पुष्पक खोलता है और परागपिटक exsert शुरुआत है तुरंत बाद ठीक संदंश का उपयोग कर हटा रहे हैं, लेकिन अभी तक पराग 6-8 शेड नहीं किया गया है. इस बाद विधि की चुनौतियों के अलावा फूल के उद्घाटन और पराग शेड के बीच एक संकीर्ण समय के अंतराल में निर्बलता प्रदर्शन में कठिनाई है. एक फूल के उद्घाटन और समापन की अवधि के परिग्रहण और पर्यावरणीय स्थिति के आधार पर अलग अलग होंगे, और 7 मिनट से लेकर कर सकते हैं <समर्थन> 6 एस में घंटा 12 2.5 Italica. Anthers पुष्पक से exsert के रूप में पराग का छप्पर होता है, anthers ध्यान से और जल्दी से हटा दिया जाना चाहिए, और इसलिए, यह कारण आत्म – परागण के लिए संक्रमण से बचने के लिए मुश्किल है. Pollinations निर्बलता के तुरंत बाद प्रदर्शन कर रहे हैं इसके अलावा, प्रति दिन प्रति व्यक्ति / किया जा सकता है कि पार की संख्या सीमित है.
एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, परिपक्व panicles गर्मी मार panicles की एक बड़ी संख्या पर पार प्रदर्शन के लाभ के साथ पराग अनाज 9,10,13,14 विकसित करने के लिए गर्म पानी में डूबा जा सकता है. हालांकि, गर्मी उपचार के तापमान और अवधि विभिन्न प्रयोगों (20 मिनट 10 के लिए 10 मिनट 14 और 42 डिग्री सेल्सियस के लिए जैसे 47 डिग्री सेल्सियस) से व्यापक रूप से भिन्न होता है. इसके अलावा, गर्मी की मध्यस्थता emasculations की प्रभावकारिता पर कोई व्यवस्थित विश्लेषण प्रकाशित किया गया है. एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए इस प्रकार, एक मानक और सरल विधि वीiridis बहुत एस के आनुवंशिक संसाधन विकास और स्थापना को तेज करेगा अनुसंधान समुदाय के भीतर एक मॉडल प्रणाली के रूप viridis.
हम एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन रिपोर्ट viridis. पौधे फूल विकास सिंक्रनाइज़ और प्रक्रिया के reproducibility बढ़ाने के लिए नियंत्रित वातावरण में उगाया जाता है. क्रॉस एक ट्रांसजेनिक एस का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं सफल नियंत्रित आनुवंशिक पार की पहचान की सुविधा के लिए गस रिपोर्टर जीन 4 युक्त पुरुष अभिभावक के रूप में viridis लाइन. गस transgene तुरंत कटाई के बाद F1 बीज की स्कोरिंग में सक्षम बनाता है और इस प्रकार निर्बलता और परागण की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक आसान गुणात्मक परख प्रदान करता है जो एक चावल Ubiquitin प्रमोटर द्वारा संचालित है. हम emascula किया गया है कि फूलों की लेबलिंग के साथ निर्बलता के लिए गर्म पानी के साथ एक सरल गर्मी उपचार कार्यरत हैटेड निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए. अनुमोदक तापमान पर गर्मी उपचार की एक श्रृंखला के परीक्षण और गर्म पानी में सूई से अलग अवधि के बाद, हम 3-6 मिनट से 48 डिग्री सेल्सियस के एक अधिकतम तापमान और समय durations की स्थापना की है. एक पूर्व सुबह ठंड उपचार पार परागण की सुविधा के क्रम में दोनों के माता पिता में तुल्यकालिक anthesis को बढ़ावा देने के लिए मिला था. हम भी अन्य Setaria accessions के लिए प्रोटोकॉल और इस विधि का भविष्य आवेदन में महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा की है.
तड़के उपचार के महत्व
Outcross संतान की एक उच्च आवृत्ति प्राप्त करने के लिए यह पुरुष और महिला माता – पिता का अत्यधिक तुल्यकालिक anthesis है करने के लिए आवश्यक है. प्रारंभ में, हम तापमान और प्रकाश व्यवस्थाओं साइकिल (31 ° C/22 डिग्री सेल्सियस, दिन / रात) और एस इस्तेमाल किया सभी pollinations के लिए viridis परिग्रहण A10.1. 12:00: तापमान 31 डिग्री सेल्सियस के लिए निकलने से पहले इन शर्तों के तहत, सबसे फूल कुछ फूल खुला हालांकि बेतरतीब ढंग से 8:00-8 के बीच, सुबह जल्दी खुला. एस में पिछले अध्ययनों Italica कि दिन के समय का संकेत मिलता है, स्थान और मौसम anthesis 7,15,16 में बदलाव के लिए योगदान करते हैं. Siles एट अल. 6 पिछले अध्ययनों 7,15 में निष्कर्ष निकाला रूप anthesis, तापमान और आर्द्रता में तेजी से बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन नहीं कम तापमान और उच्च नमी के साथ, दर असल गया था उल्लेख किया. नकल करने के लिए: इसलिए, हम (12:00 08:30 -9 से) 30 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस के पूर्व भोर ठंड उपचार कार्यरतप्राकृतिक पूर्व भोर हालत. इस पूर्व सुबह ठंड उपचार माता – पिता में anthesis सिंक्रनाइज़ करने में सहायता प्राप्त. हम 50% के सापेक्ष आर्द्रता के स्तर के लिए कक्ष की स्थापना के बावजूद, कक्ष के अंदर सापेक्ष आर्द्रता तापमान 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 22 डिग्री सेल्सियस से गिरा दिया के रूप में 70% से ऊपर एक स्तर तक वृद्धि हुई है और तापमान तक 70% से ऊपर रहने के लिए जारी रखा है कि मनाया धीरे – धीरे 9:30 के बाद 31 डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया. 9:00 पर, महिला माता पिता नपुंसक बना दी जाती है और पुरुष माता पिता के पौधों प्रयोगशाला में लाया जाता है (टी: 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±). पुरुष माता पिता के फूल 10:10 के आसपास खोलने शुरू, और परागण 10:30 -11 में प्रदर्शन किया जा सकता है: 00:00. सभी अभिकर्मकों और उपकरणों की एक विस्तृत सूची तालिका 2 में प्रदान की जाती है.
निर्बलता के लिए पुष्पगुच्छ तैयारी का महत्व
इस अध्ययन (चित्रा 1) में चैम्बर शर्तों के तहत, प्राथमिक पुष्पगुच्छ खिलने की अवधि को लेकर से2-3 दिन. आमतौर पर, (2A चित्रा) खुला पहला और खोलने पछाड़ proximally और distally पुष्पक्रम के बाहर का बीच पर स्थित फूल. पुष्पगुच्छ पर बनाए रखा जाएगा फूलों की आदर्श संख्या 20-30 है. केवल अच्छी तरह से विकसित फूल (छोटी बाल 17 पर सर्वोच्च फूल या सबसे बड़ा) को रखा जाता है कि इसलिए सावधानी अपरिपक्व फूलों के हटाने के दौरान लिया जाना चाहिए. फूलों के दोनों किनारों पर लाल मार्कर के साथ लेबल कुशलतापूर्वक निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से बीज से ख्यात outcross संतान भेद करने में मदद करता है. इसके अलावा, यह व्यापक गर्मी नुकसान से फ्लोरेट्स की रक्षा के लिए निर्बलता से पहले panicles पर बाल छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन, एक विकल्प के रूप में, वे एक पुष्पगुच्छ बाध्यकारी है, खासकर जब परागण की सुविधा के क्रम में वसंत कैंची का उपयोग निर्बलता के बाद हटाया जा सकता है तकनीक (आंकड़े -2 सी और 2 डी) कार्यरत है.
अनुकूलित तापमान एकगर्म पानी के उपचार के लिए घ उपचार की अवधि
गर्म पानी की सूई के माध्यम से निर्बलता के आधार पराग स्टिगमैटिक सतह से गर्मी के प्रति संवेदनशील है. हालांकि, अवधि और गर्मी उपचार के तापमान Setaria प्रजातियों और accessions के बीच भिन्न हो सकते हैं. सामान्य तौर पर, एक कम उपचार समय या एक लंबे समय तक इलाज समय के साथ कम तापमान के साथ एक उच्च तापमान निर्बलता पर वही असर होगा. यह बताया गया है कि 20 मिनट 10 या 10 मिनट के लिए 47 डिग्री सेल्सियस 14 गाया एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस के गर्मी उपचार Italica पराग अलाभकारी, लेकिन इन उपचार की दक्षता निर्धारित नहीं किया गया था. हम उपचार के एक अनुकूलित तापमान और अवधि के तहत, सभी फूलों के पराग कलंक ग्रहणशील रहेगा जबकि महिला अभिभावक अलाभकारी हो जाएगा पर बरकरार रखा कि परिकल्पना के बाद हमारे प्रोटोकॉल विकसित किया है. हालांकि, कई तापमान के प्रभाव की तुलना और विश्लेषण करने के बाद औरउपचार की अवधि (1 टेबल), हम इस तरह यह पूरी तरह से आत्म – परागण से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए कठिन है, गर्मी उपचार के लिए संवेदनशीलता प्रत्येक पुष्पगुच्छ पर बनाए रखा फूलों के बीच बदलता है कि पाया. हम उपचार एस में 3-6 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब outcross संतान उत्पादन की दक्षता सबसे बड़ा निष्कर्ष है कि viridis परिग्रहण A10.1.
Anthesis और पार परागण की पीक समय
फूलों परिपक्वता तक पहुँचने और खोलने जा रहे हैं, anthers पीले रंग में सफेद होते हैं और पराग जैसे ही anthers फूल 8 से exsert के रूप में बहाया जाता है. फूलों को बंद करने के लिए शुरू के रूप में पराग बहाया है के बाद anthers धीरे – धीरे भूरे रंग बदल जाते हैं. एक बार जारी किया, पराग की व्यवहार्यता अज्ञात है. इसलिए, यह जितनी जल्दी हो सके पुरुष माता पिता पर खोलने या हौसले से खोला फूलों से पराग का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे चैम्बर शर्तों (चित्रा 1), flowe के बहुमत के तहतपुरुष माता पिता के रुपये को 10:10 बजे खोलने के लिए शुरू और खोला फूल को 10:30 बजे पराग बहाया. इस प्रकार, परागण के प्रदर्शन के लिए वांछनीय खिड़की 10:30-11:00 है. कलंक करीब फूलों के बाद glumes बाहर रहते हैं और पराग के लिए ग्रहणशील हो सकता है. यह पहले से मनाया जाता है और एस में पुष्टि की गई है Italica कलंक Siles एट अल. 6 से के बारे में 48 घंटे के बाद फूल खोलने के लिए स्वीकार कर रहे हैं, तो यह गर्मी उपचार के बाद बैग panicles के लिए महत्वपूर्ण है और नियंत्रित पार करने के बाद है. ऊपर चर्चा की, हम दिन 2 और 3 दिन बाद निर्बलता दोनों पर प्रदर्शन pollinations की सलाह देते हैं.
परागण के लिए तरीके
हम तीन परागण तकनीक की दक्षता की तुलना में. खिल फूल सीमित नहीं रहे हैं, पुष्पगुच्छ को पुष्पगुच्छ परागण सबसे कारगर तकनीक है और outcross संतान के एक उच्च संख्या निकलेगा. खिल panicles, ओ के एक उच्च आवृत्ति को सीमित कर रहे हैंपरागपिटक करने वाली कलंक विधि का इस्तेमाल किया जाता है जब utcross संतान का उत्पादन किया जाएगा. हम सफलतापूर्वक दोनों तरीकों से outcross संतान प्राप्त किया है. "बंधन panicles" विधि एस पार करने में इस्तेमाल किया गया है Italica 6 लेकिन हम पुरुष माता पिता के पराग बहा के लिए समय खिड़की कम है के रूप में इस विधि से कम कारगर तरीका हो पाया. इसके अलावा, कम परागण पर नियंत्रण और एस पर बाल नहीं है viridis panicles भी स्टिगमैटिक सतह पर पराग की आवाजाही में बाधा हो सकती है.
बीजों को एकत्रित करने, सुखाने और भंडारण
कटाई के बाद बीज 2 दिनों के लिए 30-33 डिग्री सेल्सियस पर सूखे की जानी चाहिए. यदि आवश्यक हो तो Anthecium, गस धुंधला के लिए हटा दिया जाना चाहिए. बीज एक सूखी, शांत स्थान में संग्रहित किया जाना चाहिए (टी: 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±) टी (अल्पकालिक भंडारण (कम से कम दो वर्ष) के लिए या एक बीज चैम्बर में: 4.0- लंबी अवधि के भंडारण के लिए 20% ± 1%): 10 डिग्री सेल्सियस 1.0 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±.गरीब भंडारण की स्थिति कम व्यवहार्यता दरें 8 में हो सकता है. हमने देखा है कि एस के अंकुरण दर viridis A10.1 4 दिनों फसल कटाई के बाद बोया जब लगभग 5% है, लेकिन प्रयोगशाला (टी 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±) में भंडारण के बाद 90-96% तक बढ़ाया जा सकता है 110 के लिए दिनों के बाद कटाई बीज निद्रा को तोड़ने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक तीन दिवसीय स्तरीकरण द्वारा पीछा किया. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्तरीकरण के लिए, सूखे बीज एक कंटेनर (जैसे सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब या एक मोहरबंद प्लास्टिक की थैली में सिक्का लिफाफा) में रखा जा सकता है और बोने से पहले 3 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा. प्रयोगशाला में भंडारण के 16 महीनों के बाद (टी: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±: 1.15% ± 21.79%), 90-95% की अंकुरण प्रतिशत अभी भी प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, निद्रा को तोड़ने के लिए, बीज कटाई के बाद 2 दिनों के लिए 30-33 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया जा सकता है, और तब से हटाने के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिवसीय स्तरीकरण दीanthecium पहले रोपण. इन उपचार के बाद, ऊपर से 33% के बीज अंकुरण दर हासिल की जा सकती है.
लाभ, सीमाओं और संभव संशोधनों
यहाँ हम एस में पार के प्रदर्शन के लिए पहले मानक प्रोटोकॉल प्रदान निर्बलता के लिए एक गर्मी उपचार का उपयोग करके viridis A10.1. शारीरिक निर्बलता के विपरीत, इस प्रोटोकॉल कम आक्रामक और एक प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. यह आमतौर पर एक पुष्पगुच्छ ट्रिम करने के बारे में 15 मिनट लगते हैं और लगभग 15 panicles छंटनी और / व्यक्ति / दिन पार किया जा सकता. 3-5 outcross संतान / पुष्पगुच्छ के एक औसत मानते हुए अनुकूलित की शर्तों के तहत बरामद किया जा सकता है, 45-75 outcross संतान की कुल एक ही दिन में एक व्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक के अतिरिक्त अनुकूलन की संभावना हो जाएगा, हालांकि, अन्य Setaria प्रजातियों में पार करने के लिए लागू किया जा सकता है. विकास कक्ष स्थान सीमित है, पौधों एक पूर्व भोर trea बिना ग्रीन हाउस या विकास कक्षों में उगाया जा सकता हैवे अनुकूलित कक्ष की स्थिति में चले जाते हैं पहले पुष्पगुच्छ उभर तक tment.
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए Sankalpi Warnasooriya और एमी हम्बोल्ट धन्यवाद. इस काम के ऊर्जा विभाग (डी SC0008769) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS-1127017) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Name | Company | Cat. Number | |
Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
Kimwipes | VWR International | 34120 | |
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |