Summary
誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。
Abstract
患者由来のiPSCは、将来の自家細胞療法プロトコルにとって非常に貴重な細胞源となる可能性があります。iPSC由来の筋芽幹細胞/前駆細胞は、ペリサイト由来のメソアンジオ芽細胞(iPSC由来のメソアンジオ芽細胞様幹細胞/前駆細胞:IDEMs)と同様に、異なる形態の筋ジストロフィーの影響を受ける患者から生成されたiPSCから確立することができる。患者固有のIDEMは、異なる戦略(レン チウイルスベクター、ヒト人工染色体など)で遺伝的に補正され、筋形成調節因子MyoDの過剰発現時に筋形成分化の可能性を高めることができる。この筋形成電位は、特異的分化アッセイを用いて インビトロで 評価され、免疫蛍光によって分析される。IDEMの再生電位は、急性および慢性の筋肉再生を示す2つの代表的なマウスモデルにおける筋肉内および動脈内移植時に 、生体内でさらに評価される。宿主骨格筋へのIDEMの寄与は、移植されたマウスにおける異なる機能検査によって確認される。特に、動物の運動能力の改善はトレッドミル試験で研究される。細胞の生着と分化は、移植された筋肉に関する多くの組織学的および免疫蛍光アッセイによって評価される。全体として、この論文では、細胞移植の有効性を分析するための移植方法とその後の結果尺度に焦点を当てて、IDEMの分化能力を評価するために現在利用されているアッセイとツールについて説明する。
Introduction
メソアンジオ芽細胞(MAB)は、血管関連筋前駆腫が1〜3の球のサブセットに由来する。衛星細胞4 のような正規筋前駆体に対するMABsの主な利点は、動脈内に送達されたときに血管壁を横切る能力に存在し、したがって細胞療法プロトコルにおける骨格筋再生に寄与する。この特徴は、筋ジストロフィー1,5,6のマウスとイヌの両方のモデルで評価され、確認されている。これらの前臨床試験は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(EudraCT no.2011-000176-33;現在イタリアのミラノのサンラファエレ病院に行っている)のドナーHLA同一のMABの動脈移植に基づく第一次相I/II臨床試験の基礎を構築しました。体全体の筋肉を治療するために何十億もの細胞が必要な細胞療法アプローチの主なハードルの1つは、「薬効製品」(細胞)の限られた増殖性です。さらに、それは四肢ガードル型筋ジストロフィー2D(LGMD2D;で発生するので、筋ジストロフィーのいくつかの形態の影響を受ける患者からMABを得ることは不可能であることを最近実証されています;OMIM #608099)7.
これらの制限を克服するために、MAB様の幹細胞をヒトおよびマウスiPSCから導出するためのプロトコルが最近確立されている。この手順は、成人の筋肉由来のMABsに非常に類似した血管遺伝子シグネチャおよび免疫フェノタイプを有する容易に拡張可能な細胞集団を生成する。筋原性調節因子MyoDの発現に際して、マウスとヒトのIM(それぞれMidEMおよびHIDEM)の両方が末期骨格筋分化を受ける。この目的を達成するために、IDEMは、構成的にまたは誘導可能な方法で、MyoD発現を駆動することができるベクトルを用いてトランスミズムすることができる8-10。エストロゲン受容体と融合したMyoD cDNA(MyoD-ER)を含むレンチウイルスベクターが使用され、タモキシフェン(エストロゲン類似体)投与11で核転位が可能となる。この戦略は、高効率7で肥厚多核筋管の形成をもたらす。特に、IDEMは非腫瘍性であり、移植時に宿主筋肉の中で生着および分化することができ、異なるベクター(レンチウイルスまたはヒト人工染色体) を使用して遺伝的に矯正することができ、将来の自己治療戦略への道を開く。上記の出版物7に、IDEMの導出、特性評価および移植について説明した。本プロトコル論文では、筋肉再生のマウスモデルにおける移植の有効性をテストするために、IDEMの インビトロ 筋原性分化とそれに続く結果測定を評価するために実施されたアッセイについて詳述する。
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Protocol
1. 筋原性及び生着ポテンシャルの評価
-
インビトロ: MyoDによる分化
- タモキシフェン誘導性MyoD-ERレンチウイルスベクターを用いて導入された安定した細胞株を生成し、感染の多重度を刺激する(MOI; 例えば1、5および50)手順の効率の結果として1.1.9(MyHC)に記載の染色を使用する。
- 3.5cmの皿に1%のマトリゲル1mlを塗り、37°Cで30分間インキュベートします。
- プレートを培地で2回洗浄し、3.5cm組織培養皿に1x5 MyoD-ERを導入し、37°Cで培養培地でインキュベートします。
- 細胞が1〜2日で合流しに達し、成長培地に1μM 4OHタモキシフェンを加えると期待してください(1回 の用量)。
- 24時間後、1 μM 4OHタモキシフェン(2nd および最後の用量)を添加した分化培地で成長培地を交換してください。
- 1日おきに新鮮な分化培地で培地の半分を交換してください。
- 毎日のミオチューブ形成のための培養を調べます。
- 1週間(分化培地で5日)後、PBSでプレートを軽く洗い、RTで5分間パラホルムアルデヒド4%で固定します。
- ミオシン重鎖(MyHC)に対する抗体による免疫蛍光染色を行い、ミオチューブの存在を確認します。核染料を用いたカウンターステイン(例えば、ホークスト)。
分化の効率は、MyHC陽性細胞内の核の割合として評価される:効率が>50%であれば次のステップに進む。
-
インビボ: 急性筋肉再生モデルにおける生着
筋再生に対するMyoD-ER IDEMの 生体内 寄与を評価するために、細胞は以前に緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするベクターコードで標識され、組織内部でそれらを追跡することを可能にする。その後、MyoD-ER GFP IDEMを成人マウスの筋肉に注入し、以前はミオトキシン(例えば 心筋毒)で負傷した。異種(HIDEMなど)または遺伝的に操作/補正された細胞に対する免疫拒絶反応を避けるためには、免疫不全または免疫抑制マウスのいずれかを使用することが必要です。- 10 mg/ml タモキシフェン(リポロジブ型)の腹腔内注射で動物を退行し、移植前に1 μM 4OH-タモキシフェン(水性形態)を成長培地に添加する退却細胞を24時間前に移植する。
- 動物施設の外科的処置を調節する具体的なガイドラインに従って、麻酔と鎮痛をマウスに投与する。
- 100 μM のカーディオトキシン (CTX; ナジャ モサムビカ モサムビサから 25 μl を注入します。;注意:潜在的に有害な物質) チガイアリス前筋肉 (TA)の筋肉。
- タモキシフェンとCTXで動物を治療した24時間後、トリプシン化とカウントによって細胞を取り外す。
- 232 x gで細胞を5分間遠心分離します。
- Ca2+およびMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用してCa2+の細胞ペレットを徐々に再中断し、Mg2+フリーPBSを最終濃度106 細胞/30μlに再中断します。
- 29または30G針の注射器を使用して、以前に負傷した筋肉に30μlの細胞懸濁液を注入します。筋肉から針を取り除きながら、特に注意を払ってください。針のトラックを通して細胞の懸濁液をこぼさないように、ゆっくりとそれを行います。対側TAを移植し、それをコントロールとして使用しないでください, Ca2+の30 μlを注入 - と Mg 2+- フリーPBS移植されたものの条件を複製します.
- タモキシフェンで6日間動物を治療し、鎮痛(例えばカルプロフェン)を2日間投与する。
- 移植後14日後から筋肉を外植する。プロトコル 4 および 5 で詳細に説明されているように、サンプルを処理して分析します。
2. 筋ジストロフィーのマウスモデルにおける移植
この移植アッセイは、筋ジストロフィーのマウスモデルにおけるIDEMの生着の程度を評価することを可能にする。動物は、以下のように扱い、この疾患表現型の機能的改善について評価することもできる。機能検査は移植後2週間から行うことができる。生着を強化するために、3x(すなわち合計3回の注射/筋肉)のために3週間ごとに移植前トレッドミル運動(プロトコル3に記載されている)および/または連続細胞注射を行うことを検討してください。
- 筋肉内移植
- 10 mg/ml タモキシフェン(リポロプリド製剤)の3.5 μl/gの腹腔内注射で動物を退行し、移植前の一晩に1 μM 4OH-タモキシフェン(水性製剤)を加えて細胞を1μM/mlのタモキシフェン(リポロ溶性製剤)する。
- トリプシン法で取り外し、細胞を232 x gで5分間遠心分離します。
- Ca2+およびMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用して、Ca2+およびMg2+フリーPBSのペレットを106細胞/30μlの濃度に再懸濁します。
- 鎮痛を投与し、ポビドネヨウ素またはクロレキシジン系消毒剤を用いて動物の皮膚(任意)を消毒する。これはまた、 脛骨前 (TA)、 胃腸 症(GC)、および 四頭筋フェムリス (QC;特に 広大な間接的な)筋肉を局所化するのに役立ちます。
- 29または30G針の注射器を使用して、30 μlの細胞懸濁液を筋肉に注入します。TAの場合、脛部に対して15°の傾斜を有する近位腱(頭蓋頭方向)の挿入部の下に針の5mmを挿入し、針を引っ込みながらゆっくりと細胞懸濁液を注入する(2mmの針を筋肉の内側に空にする)。GCおよびQCの場合、TAに関して詳述されているのと同じ手順を繰り返し、主な違いは、GCのアキレス腱のミオテンディナス接合部の上に2mm、QCの遠位腱の2mm上の針のコースラニア挿入である(大腿骨に対する15°の傾斜)。針のトラックを通して細胞の懸濁液をこぼさないようにするために、筋肉から針を取り除きながら注意してください。
トラブルシューティング:生着が低い場合は、3 x 105細胞/10 μlの若年性(1〜2週齢)マウス7を注射することを検討してください(この場合、タモキシフェンは皮下投与する必要があることに注意してください)。
- 動脈内移植
プロトコルのこの部分は、MidEMおよびHIDEMの能力の評価を動脈循環で送達し、血管壁を横切り、注射部位に下流の筋肉の骨格筋再生に寄与することを可能にする。- ステップ2.1.1で上述した動物および細胞を退却させる。
- トリプシン化によって取り外し、40 μmの細胞ストレーナーでフィルターを取り外す(タモキシフェンへの一晩の暴露が隣接する細胞からのミオチューブの融合および形成を促進する可能性がある場合に細胞懸濁液からクラスターを除去する)カウントし、5分間232 x gで細胞を遠心分離する
- Ca2+とMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用して、Ca2+のペレットを再中断し、Mg2+フリーPBSを0.2インターナショナルで再中断します。
ヘパリンナトリウム(任意)の単位は、106細胞/50μlの最終的な細胞濃度に。細胞懸濁液の分布を可視化するために、溶液に10%パテントブルー染料(最終濃度:通常の生理食物またはCa2+およびMg2+フリーPBSで1.25mg/ml)を加える。 - 特定の施設の動物施設での外科的処置を調節する指針に従って、麻酔と鎮痛をマウスに投与する。
- りんご領域(大腿骨またはスカルパの三角形とも知っている)を剃り、ポビドネまたはクロルヘキシジンベースの消毒剤で皮膚を消毒します。
- 5-7 mmの切開を行い、大腿骨束を局在化する:静脈、動脈および神経(神経は動脈および静脈の内側に横たわっている)。
- 束を鉗子で覆う結合性筋膜をそっと取り外します。
- その間に鉗子(または30G針)の先端を徐々に広げて、動脈から大腿静脈と神経を分離する。
トラブルシューティング:大腿静脈は壊れやすい:大腿動脈からの剥離中に鉗子でそれをつままないように注意してください。出血の場合は、滅菌ガーゼで血液を排出し、止血を容易にするためにマイクロコーテラーを使用してください。 - 鉗子の一方の先端で動脈を持ち上げ、もう一方の先端で動脈をクランプします。
- 30G針を装着した注射器で動脈を穿刺する。クランプされた領域の下流に50 μlの細胞懸濁液を注入し、約5μl/secの注入速度で注入します。
トラブルシューティング:注射前に注射器の細胞を慎重に再中断する:細胞の沈殿やシリンジ内の気泡形成を避けるために不可欠です。大腿動脈の直径は30G針よりわずかに小さい:針を挿入しながら動脈を切り捨てないように注意してください。特許青色染料は、注射の有効性を認識することを可能にする:正しく注入されれば、四肢全体が急速に水色に変わる。 - ゆっくりと針と鉗子を動脈から取り除き、四肢の血流を回復させる。
- 必要に応じて出血や焼灼を避けるために、滅菌ガーゼで圧力を加えます。
- 創傷を縫合し、麻酔から回復するまで動物を監視する。
- 鎮痛を3日間投与し、創傷を毎日検査する(創傷感染の場合は、動物施設の職員とこれを議論し、必要に応じて抗生物質を投与する)。
3. 移植性ジストローフ動物の結果対策:トレッドミル試験
細胞移植後2週間から、トレッドミル試験で処置されたマウスの運動能力の機能的改善を評価することが可能である。このテストは処置されたマウスの運動の許容度/持久力の評価を可能にする。マウスは、一連の連続した機械的刺激(5秒に1回)の後にトレッドミルを再び係合しようとすることなく、5秒以上休憩領域に横たわると疲労していると考えられる。ベースライン測定は、治療の約1ヶ月前に開始し、各単一の試験動物の改善を評価するために使用されます。この検査の後に、繊維の脆弱性、力の改善、生着、移植された細胞の分化、および移植された筋肉の形態学的改善を監視するための追加のアッセイが続く(議論参照)。
- 最初の測定前の運動に動物(通常3つのグループ:治療、未処理、および野生のタイプ/非ジストロフィーコントロール)を順応する:トレッドミルを10分間6m/minの速度に設定する。1 日おきに 1 週間繰り返します。
トラブルシューティング: 概日サイクルによるバイアスを避けるために、すべての測定値を1日の同じ時間に記録します。 - 10°の傾斜で以前に設定されているトレッドミルに動物を配置します。
- 6 m/minの開始速度でトレッドミルをオンにします(動物が運動を開始する気がない場合に備えて、穏やかな機械的刺激を提供します)。
- タイマーを開始し、2分ごとに速度を2 m/minに上げます。
- 動物がトレッドミルを再び係合しようとせずに5秒以上休憩エリアに横たわるとすぐに、棒でそっと触れて運動の再開を刺激します(上記参照)。
- 各動物の性能(時間と距離)を記録します。
- 少なくとも 3 倍の週ごとまたは 10 日ごとに測定を繰り返します。
- 移植後も同じ手順を繰り返します。
- 各動物の測定値とベースライン性能を比較するパフォーマンスデータを分析します。ベースラインに対する平均モータ容量に対する割合としてグラフ内の値をプロットし、それらを一方向または双方向のANOVA検定で分析し、その後に適切な事後検定を行ってグループを比較することを提案します。
トラブルシューティング:最低5歳、遺伝子型、および性に一致する動物/群を使用し、移植後に少なくとも3倍の測定を繰り返します。
4. 移植筋肉における細胞の生着と分化の評価
移植および制御筋肉は適切な時点で収穫される(短期生着分析には<2日、中期では2~3週間、長期分析では>1ヶ月)。移植した細胞がGFPで標識されている場合、新たに単離された筋肉の生着は、UV装備の実体顕微鏡下で直接蛍光によって評価することができる。
- トラガチャントガムで、垂直軸に沿って配置し、新たに孤立した筋肉に沿って向きを与える(6%w/v)
- プレチルイセプアペンタンでサンプルを1分間脱水し、液体窒素で少なくとも2分間凍結し、すぐに-80°Cで保管してください。
- 偏光スライド上の7μmの厚いセクションを得るためにクライオスタットでサンプルを処理します。スライド上の筋肉の大部分をサンプリングし、約8~10枚のスライドを30~40のセクション/スライドで収集します。分子生物学/生化学のアッセイを行うために1.5 mlの管に一連のセクションを集めることが推奨される。
- 実験の設定に応じて、異なる免疫蛍光染色で細胞生着を評価する。例えば、Sgca-null/scid/bgマウスにおけるHIDEM移植の場合、染色切片:a)ラミンA/Cに対する抗体を用いて、移植されたヒト細胞核を検出する。b) 筋肉の全体的な構造を視覚化するラミニンに対する抗体;c)ジストロフィー動物に存在しないタンパク質のドナー由来復元を検出するSgcaに対する抗体。
- 定量は、蛍光顕微鏡を用いて、筋線維の内外の筋部あたりのドナー核数およびドナー由来骨格筋線維の数を1セクション当たりにする。
5. 筋組織病理学
組織病理学的解析は、移植された筋肉の形態構造の評価を可能にする。組織構造のアーキテクチャの改善は、細胞治療アプローチの結果として期待される。
- 4%パラホルムアルデヒドで4%の新しい筋肉を4°Cで1時間固定します。
- 上昇ショ糖勾配(例えば 7.5-15-30%w/v)でサンプルを脱水します。
- 最高のショ糖溶液で一晩筋肉を残します。
- サンプルをティッシュTek OCTに埋め込み、OCTが固体になるまでプレチルイコペンタンに入れ(サンプルの完全な浸漬を避ける)、少なくとも2分間液体窒素で凍結し、すぐに-80°Cで保管してください。
- 上記のように7μmの厚いセクションを得るためにクライオスタットでサンプルを処理します。
- 標準的な製造業者の議定書に従ってヘマトキシリンおよびエオシンまたはマッソンのトリクロームのセクションを汚す。
ヘマトキシリンとエオシン染色は、次のような再生筋肉の特徴を計算することを可能にする: a) ミオファイバーの数;b) 断面積;c)中心核を含む筋繊維の数。マッソンのトリクロームは、画像の全面積から骨格筋線維によって占める総面積を差し引くことによって行われる繊維指数を計算するために使用される:結果として得られた領域は、主に筋肉の結合および脂肪浸潤を反映する。画像上のすべての分析は、測定ツールとセルカウンタープラグインとのImageJソフトウェア(NIH)を使用して行うことができる。
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Representative Results
報告された代表的な結果は、図1のワークフローに示されている主なin vitro/in vivoアッセイに従います。48時間4OHタモキシフェン投与後のMyoD陽性核は、培養中のMyoD-ER導入IDEM内で識別可能である(図2A)。その後、細胞は融合し、多核化されたミオチューブに分化する(図2B)。急性筋肉損傷のマウスモデルに筋肉内移植を行うと、IDEMが組織再生に寄与する(図3)。筋ジストロフィーのマウスモデルに対する遺伝子および細胞治療設定におけるIDEMの有効性は、トレッドミル運動耐性試験によって評価された:図4は、野生型MIDPMをSgca-null/scid/ベージュマウスに移植した後に得られた結果を示し、治療されたマウスにおける運動能力の改善を示す7。移植された筋肉のエクスビボ分析は、宿主組織へのIDEMのコロニー形成の程度を表すGFP陽性領域を示し(図5A-C)、したがってドナー細胞がジストロフィー筋肉に移植することを示す。重要なことに、移植された細胞は生体内で分化し、新しい骨格筋線維を形成することができる。実際図5は、遺伝的に修正されたHIDEMからSgca-null/scid/ベージュマウスへのSgca発現を示しています(図5Dおよび5E)。移植された筋肉のアーキテクチャにおける構造的改善は、マッソンのトリクロム染色を通じて評価することができる:図5Fは、処置された筋肉における線維組織の量の減少を示す。
図 1.プロトコル のフローチャート。このスキームは、IDEMベースの戦略の概要を提供します, 予備的なインビトロ分化アッセイ (左) から生着を評価するために必要な様々 なステップまで,生体およびex vivoの内在性の筋因性および機能的改善(右)。ダークグレーのボックスには、プロトコルで説明されているさまざまな手順が含まれています。ライト グレーのボックスには、この記事で詳しく説明されていないメソッドの一部が含まれています。ここをクリックすると、より大きな図が表示されます。
図 2. インビトロにおける筋原性ポテンシャルの評価(A) 4OHタモキシフェンへの48時間の曝露後に、7個中4個のMyoD-ERで核MyoD発現を示す蛍光を用いたMIDEM核を導入した。 (B) 分化培地(スケールバー、200μm)で1週間後に4OHタモキシフェン誘発HIDEM由来ミオチューブ上のミオシン重鎖(MyHC)の免疫蛍光染色。 ここをクリックすると、より大きな図が表示されます。
図 3.急性筋肉再生モデルにおける細胞の生着の インビボ 評価(A) 106 GFP-HIDEM(左)およびGFP-MIDEM(中央)の筋肉内注射の2週間後に植え替えられた、新たに単離された心筋毒キシン負傷脛筋前筋肉のステレオ顕微鏡GFP蛍光画像。スケールバー、2 mm(B) 低(上)および高(下)GFP陽性筋繊維を表示する(A)に示すMidEMで移植された筋肉の拡大写真。スケールバー、200 μm。 ここをクリックすると、より大きな図が表示されます。
図 4.トレッドミル運動許容度試験。 移植のための代表的なトレッドミルテスト(IM =筋肉内;IA = 動脈内).Sgca-null/scid/ベージュマウス(106 細胞/注射)対非移植ジストロフィーおよび非ジストロフィー対照免疫不全マウス。このプロットは、MidEMを移植したジストロフィーマウスの機能的改善を示している(移植後35日後に非移植動物より12〜22%多い)。データは、ベースライン性能に対する平均運動能力として示されています(すなわち、100%は各群のベースライン性能を表し、測定を繰り返す際に治療されたマウスのみが大幅に改善されます)。*P < 0.05;**P < 0.005、一方の分散分析著者の以前に出版された作品から 7. ここをクリックすると、より大きな図が表示されます。
図 5.筋ジストロフィーのマウスモデルにおける生着および筋形成の可能性のインビボ評価(A)立体視GFPは、10人6人(HIDEM、左、若年マウス移植)とマウス(MIDEM;右)GFP-IDEMsの筋肉内注射後3~4週間後に、Sgca-null/scid/ベージュマウスの新たに単離された脛骨筋前筋肉の蛍光画像。スケールバー、2 mm(B)10 6 GFP-MidEMの動脈内注射の3週間後に剥離したばかりの単離された胃内膜筋の立体視GFP蛍光画像。スケールバー 、1mm(C)GFP陽性筋繊維のクラスターを表示する(A)に示すMidAMで移植した筋肉の新鮮な凍結横断面。スケールバー、200 μm。(D)筋肉内移植筋肉の一部に対する免疫蛍光染色(Aのように)は、移植されたIDEMsに由来する遺伝的に矯正された繊維のクラスターを示す。スケールバー、150 μm。(e)遺伝子的に補正したIDEMをsgca-null/scid/ベージュマウスに筋肉内移植した1ヶ月後にαサルコグリカン(Sgca)陽性筋線維を定量化する。(F)移植から脛骨前筋のマッソントリクローム染色および制御Sgca-null/scid/ベージュマウス(赤:筋線維;青:線維症)治療筋における線維浸潤の減少を強調する。スケールバー、200 μm。ここをクリックすると、より大きな図が表示されます。
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Discussion
iPSCは自己再生の可能性を保ちながら無期限に拡張できるため、広範囲の細胞系統12に分化するよう指示される。このため、iPSC由来のステム/前駆細胞は、自家遺伝子および細胞治療の有望な源と考えられる13.著者らからの以前に発表された研究は、iPSCからのマウスおよびヒト筋原性前駆体の生成を、近球由来のMAB(IDEM)と同様の表現型を有し、筋ジストロフィー7のマウスモデルにおける筋肉再生に対するその効率的な寄与を報告した。
IDEM筋原性ポテンシャルを最大にするための前提条件は、細胞内の筋形成因子MyoDの発現である。タモキシフェン誘導性MyoD-ERカセットを用いたトランスダクションは、その発現を正確に一時的に制御し、その活性化を全培養中およびその後 インビボで同期させる利点を有する。筋肉あたりの細胞の単一投与に基づく移植戦略(または大腿動脈あたり)は、この記事で説明されています。しかしながら、反復細胞注射は、異なる細胞療法プロトコル8におけるMABの生着を増加させるに効果的であることが示されている。したがって、IDEMで最適でない結果が得られる場合には、細胞投与量を増加させ、したがって宿主筋肉に寄与するために繰り返し移植を行う価値がある。
結果測定は処置された動物の表現型の機能改善におけるドナー細胞の寄与の評価を可能にする。トレッドミルで行われる運動耐性/耐久試験に加えて、自主的な運動能力(例えば 自由車輪試験)、繊維の脆弱さ(例えば エバンスブルー染料取り込みアッセイ)および比力(例えば 単繊維または筋肉力学全体)を分析するためのさらなる試験は8と考えることができる。機能表現型の改善をテストするための追加の方法は、Treat-NMDウェブサイト(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/)の標準的な操作手順として利用可能です。
移植された動物から重要な情報を収集するには、機能的改善に従い、免疫組織化学および組織学的解析によって検証され、細胞の生着および組織の構造/リモデリングを評価する必要があります。特に、再生および線維化の特徴のために移植された筋肉の形態学的構造を評価することが重要であり、例えば中心核を有する繊維の数、筋繊維の断面面積および線維化指数を評価する。後者の分析は、機能的な結果と共に、戦略の有効性に関する包括的な概要を示します。また、移植細胞が組織に寄与する観点から(すなわち筋繊維)と幹細胞コンパートメントの維持管理を行う系統をモニタリングすることは、全ての細胞治療戦略の長期的な有効性にとって重要である。この場合、メソアンジオ芽細胞が由来するペリサイトコンパートメントへの インビボで のドナー由来の寄与が既に報告されている。さらに、予備的な結果は、衛星セルプール(GerliとTedesco、未発表の結果)に対するIDEMからの機能的貢献を示しています。また、遺伝子の生着や発現を実証 する分子分析(定量PCRやウェスタンブロット)も重要ですが、本論文では範囲を超えており、専用の記事が必要です。
このプロトコルは、主にSgca-null/scid/ベージュマウス7(LGMD2Dの最近公表された免疫不全モデル)を利用して開発されたが、筋肉疾患の他のモデルにも容易に適用できると予想される。Sgca-null/scid/ベージュの場合、これらの動物の筋肉はひどく損なわれ、慢性的に退化および再生サイクルを受けるため、我々は心毒を使用しなかったマウス(したがって、カーディオトキシンによる追加の損傷は必要ない)。しかし、心毒による前処理が筋ジストロフィー(例えばmdxマウス)の軽度のモデルでの生着を促進できることを排除することはできませんでした。我々の戦略の改善は、マウス宿主の免疫不全(現在のモデルでは依然として最適ではない)およびドナー細胞の生着の有効性、特に異種細胞の動脈内送達時の有効性を増強する方法を含み得る。複数の細胞移植と若年マウスの使用は細胞の生着7,8の増加に寄与するが、外挿および/または移動中にヒト細胞が遭遇するマウス接着分子は、現在のモデルの限られた免疫不全にさらなるハードルをもたらす可能性がある。臨床環境におけるこの遺伝子および細胞治療アプローチの翻訳の今後の方向性には、細胞の外挿を強化するための薬理学的戦略および非インテグレーションベクター(例えば、プラスミド、mRNA、ヒト人工染色体、または非統合性ウイルスベクター)を再プログラムし、遺伝子的に細胞を改変し、挿入突然変異のリスクを回避することが含まれる。
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Disclosures
F.S.T.は国際特許出願(いいえ。PCT/GB2013/050112) この記事で説明されている戦略の一部を含む。彼は彼の研究のためにプロミメティックとDWC Ltd.によって資金を受け取りました。
Acknowledgments
著者らは、ジュリオ・コス、マルティナ・ラガッツィ、そして研究室全体に有益な議論と支援をしてくれたことに感謝し、ジェフ・チェンバレンがMyoD-ERベクターを親切に提供してくれたことに感謝している。生きた動物を含むすべての実験は、関連するすべての規制機関および機関機関、規制およびガイドラインに従って完了しました。著者の研究室での研究は、英国医学研究評議会、欧州共同体第7フレームワークプロジェクトオプティステムとバイオデザイン、イタリアのデュシェンヌ親プロジェクトによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
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- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
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- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
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- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
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