筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植
Summary
誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。
Abstract
患者由来のiPSCは、将来の自家細胞療法プロトコルにとって非常に貴重な細胞源となる可能性があります。iPSC由来の筋芽幹細胞/前駆細胞は、ペリサイト由来のメソアンジオ芽細胞(iPSC由来のメソアンジオ芽細胞様幹細胞/前駆細胞:IDEMs)と同様に、異なる形態の筋ジストロフィーの影響を受ける患者から生成されたiPSCから確立することができる。患者固有のIDEMは、異なる戦略(レン チウイルスベクター、ヒト人工染色体など)で遺伝的に補正され、筋形成調節因子MyoDの過剰発現時に筋形成分化の可能性を高めることができる。この筋形成電位は、特異的分化アッセイを用いて インビトロで 評価され、免疫蛍光によって分析される。IDEMの再生電位は、急性および慢性の筋肉再生を示す2つの代表的なマウスモデルにおける筋肉内および動脈内移植時に 、生体内でさらに評価される。宿主骨格筋へのIDEMの寄与は、移植されたマウスにおける異なる機能検査によって確認される。特に、動物の運動能力の改善はトレッドミル試験で研究される。細胞の生着と分化は、移植された筋肉に関する多くの組織学的および免疫蛍光アッセイによって評価される。全体として、この論文では、細胞移植の有効性を分析するための移植方法とその後の結果尺度に焦点を当てて、IDEMの分化能力を評価するために現在利用されているアッセイとツールについて説明する。
Introduction
メソアンジオ芽細胞(MAB)は、血管関連筋前駆腫が1〜3の球のサブセットに由来する。衛星細胞4 のような正規筋前駆体に対するMABsの主な利点は、動脈内に送達されたときに血管壁を横切る能力に存在し、したがって細胞療法プロトコルにおける骨格筋再生に寄与する。この特徴は、筋ジストロフィー1,5,6のマウスとイヌの両方のモデルで評価され、確認されている。これらの前臨床試験は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(EudraCT no.2011-000176-33;現在イタリアのミラノのサンラファエレ病院に行っている)のドナーHLA同一のMABの動脈移植に基づく第一次相I/II臨床試験の基礎を構築しました。体全体の筋肉を治療するために何十億もの細胞が必要な細胞療法アプローチの主なハードルの1つは、「薬効製品」(細胞)の限られた増殖性です。さらに、それは四肢ガードル型筋ジストロフィー2D(LGMD2D;で発生するので、筋ジストロフィーのいくつかの形態の影響を受ける患者からMABを得ることは不可能であることを最近実証されています;OMIM #608099)7.
これらの制限を克服するために、MAB様の幹細胞をヒトおよびマウスiPSCから導出するためのプロトコルが最近確立されている。この手順は、成人の筋肉由来のMABsに非常に類似した血管遺伝子シグネチャおよび免疫フェノタイプを有する容易に拡張可能な細胞集団を生成する。筋原性調節因子MyoDの発現に際して、マウスとヒトのIM(それぞれMidEMおよびHIDEM)の両方が末期骨格筋分化を受ける。この目的を達成するために、IDEMは、構成的にまたは誘導可能な方法で、MyoD発現を駆動することができるベクトルを用いてトランスミズムすることができる8-10。エストロゲン受容体と融合したMyoD cDNA(MyoD-ER)を含むレンチウイルスベクターが使用され、タモキシフェン(エストロゲン類似体)投与11で核転位が可能となる。この戦略は、高効率7で肥厚多核筋管の形成をもたらす。特に、IDEMは非腫瘍性であり、移植時に宿主筋肉の中で生着および分化することができ、異なるベクター(レンチウイルスまたはヒト人工染色体) を使用して遺伝的に矯正することができ、将来の自己治療戦略への道を開く。上記の出版物7に、IDEMの導出、特性評価および移植について説明した。本プロトコル論文では、筋肉再生のマウスモデルにおける移植の有効性をテストするために、IDEMの インビトロ 筋原性分化とそれに続く結果測定を評価するために実施されたアッセイについて詳述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSCは自己再生の可能性を保ちながら無期限に拡張できるため、広範囲の細胞系統12に分化するよう指示される。このため、iPSC由来のステム/前駆細胞は、自家遺伝子および細胞治療の有望な源と考えられる13.著者らからの以前に発表された研究は、iPSCからのマウスおよびヒト筋原性前駆体の生成を、近球由来のMAB(IDEM)と同様の表現型を有し、筋ジストロフィー7のマウ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ジュリオ・コス、マルティナ・ラガッツィ、そして研究室全体に有益な議論と支援をしてくれたことに感謝し、ジェフ・チェンバレンがMyoD-ERベクターを親切に提供してくれたことに感謝している。生きた動物を含むすべての実験は、関連するすべての規制機関および機関機関、規制およびガイドラインに従って完了しました。著者の研究室での研究は、英国医学研究評議会、欧州共同体第7フレームワークプロジェクトオプティステムとバイオデザイン、イタリアのデュシェンヌ親プロジェクトによってサポートされています。
Materials
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| 4/11/13 | Cappel | 559762 | |
| Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30G needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
