Summary
Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.
Abstract
Patiënt-afgeleide iPSC's kunnen een onschatbare bron van cellen zijn voor toekomstige autologe celtherapieprotocollen. iPSC-afgeleide myogene stam-/voorlopercellen die lijken op pericyt-afgeleide mesoangioblasten (iPSC-afgeleide mesoangioblast-achtige stam/voorlopercellen: IDEM's) kunnen worden vastgesteld op basis van iPSC's die worden gegenereerd door patiënten die getroffen zijn door verschillende vormen van spierdystrofie. Patiëntspecifieke IDEMs kunnen genetisch worden gecorrigeerd met verschillende strategieën(bijv. lentivirale vectoren, menselijke kunstmatige chromosomen) en worden versterkt in hun myogene differentiatiepotentieel bij overexpressie van de myogeneseregulator MyoD. Dit myogene potentieel wordt vervolgens in vitro beoordeeld met specifieke differentiatietesten en geanalyseerd door immunofluorescentie. Het regeneratieve potentieel van IDEM's wordt verder in vivogeëvalueerd , bij intramusculaire en intra-arteriële transplantatie in twee representatieve muismodellen met acute en chronische spierregeneratie. De bijdrage van IDEMs aan de gastheer skeletspier wordt vervolgens bevestigd door verschillende functionele tests bij getransplanteerde muizen. In het bijzonder wordt de verbetering van de motorische capaciteit van de dieren bestudeerd met loopbandtests. Celengraftatie en differentiatie worden vervolgens beoordeeld door een aantal histologische en immunofluorescentietesten op getransplanteerde spieren. Over het algemeen beschrijft dit artikel de assays en tools die momenteel worden gebruikt om de differentiatiecapaciteit van IDEM's te evalueren, met de nadruk op de transplantatiemethoden en daaropvolgende uitkomstmaten om de effectiviteit van celtransplantatie te analyseren.
Introduction
Mesoangioblasten (MABs) zijn met vaten geassocieerde spierfogenen afgeleid van een subset van pericyten1-3. Het belangrijkste voordeel van MABs ten opzichte van canonieke spiervoorlopers zoals satellietcellen4 ligt in hun vermogen om de vaatwand over te steken wanneer ze intra-arteriële worden geleverd en dragen dus bij aan skeletspierregeneratie in celtherapieprotocollen. Deze functie is geëvalueerd en bevestigd in zowel murine- als hondenmodellen van spierdystrofie1,5,6. Deze preklinische studies hebben de basis gelegd voor een first-in-man fase I/II klinische studie op basis van intra-arteriële transplantatie van donor HLA-identieke BLB's bij kinderen met Duchenne spierdystrofie (EudraCT nr. 2011-000176-33; momenteel in het San Raffaele Ziekenhuis in Milaan, Italië). Een van de belangrijkste hindernissen van celtherapiebenaderingen, waarbij miljarden cellen nodig zijn om de spier van een heel lichaam te behandelen, is het beperkte proliferatieve potentieel van het "geneesmiddel" (de cellen). Bovendien is onlangs aangetoond dat het niet mogelijk is om BBB's te verkrijgen van patiënten die getroffen zijn door sommige vormen van spierdystrofieën, omdat het voorkomt bij spierdystrofie 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Om deze beperkingen te overwinnen, is onlangs een protocol opgesteld voor het afleiden van MAB-achtige stam-/voorlopercellen uit menselijke en muriene iPSC's7. Deze procedure genereert gemakkelijk uitbreidbare celpopulaties met een vasculaire gensignatuur en immunofenotype dat sterk lijkt op volwassen spier-afgeleide MABs. Bij expressie van de myogene regulerende factor MyoD ondergaan zowel muriene als menselijke IDEMs (respectievelijk MIDEMs en HIDEMs) terminale skeletspierdifferentiatie. Om dit doel te bereiken kunnen IDEMs worden getransduceerd met vectoren die myoD-expressie kunnen stimuleren, constitutief of op een inductieve manier8-10. Er wordt een lentivirale vector gebruikt die MyoD cDNA bevat die is gefuseerd met de oestrogeenreceptor (MyoD-ER), waardoor de nucleaire translocatie op tamoxifen (een oestrogeenanaloog) toediening11mogelijk is. Deze strategie resulteert in de vorming van hypertrofische multinucleated myotubes, met een hoog rendement7. Met name IDEM's zijn niet-tumorigeen, kunnen bij transplantatie in gastheerspieren worden getransgrafteerd en onderscheiden en kunnen genetisch worden gecorrigeerd met behulp van verschillende vectoren(bijv. lentivirussen of menselijke kunstmatige chromosomen), waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor toekomstige autologe therapeutische strategieën. De afleiding, karakterisering en transplantatie van IDEM's zijn beschreven in de bovenstaande publicatie7. Dit protocoldocument beschrijft de tests die zijn uitgevoerd om de in vitro myogene differentiatie van IDEM's te evalueren en de daaropvolgende uitkomstmetingen om de werkzaamheid van hun transplantatie in muismodellen van spierregeneratie te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beoordeling van myogene en engraftmentpotentiaal
-
In vitro: MyoD-geïnduceerde differentiatie
- Genereer een stabiele cellijn van IDEM's die worden getransduceerd met de tamoxifen-inducerende MyoD-ER lentivirale vector, waarbij de multipliciteit van infectie (MOI; b.v. 1, 5 en 50) waarbij de in punt 1.1.9 (MyHC) beschreven kleuring wordt gebruikt als resultaat van de efficiëntie van de procedure.
- Bedek een schaal van 3,5 cm met 1 ml 1% Matrigel en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
- Was de plaat tweemaal met medium, zaai 1 x 105 MyoD-ER getransduceerde IDEMs in de 3,5 cm weefselkweekschaal en incubeer bij 37 °C in groeimedium.
- Verwacht dat cellen in één of twee dagen samenvloeiing bereiken en voeg vervolgens 1 μM 4OH-tamoxifen toe aan het groeimedium (1e dosis).
- Vervang na 24 uur het groeimedium door differentiatiemedium aangevuld met 1 μM 4OH-tamoxifen(2e en laatste dosis).
- Vervang om de dag de helft van het medium door een vers differentiatiemedium.
- Onderzoek dagelijks de culturen voor myotube-vorming.
- Was de platen na een week (5 dagen in differentiatiemedium) voorzichtig met PBS en bevestig ze met 4 % paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij RT.
- Voer een immunofluorescentiekleuring uit met antilichamen tegen myosine zware keten (MyHC) om de aanwezigheid van myotubes te bevestigen. Counterstain met een nucleaire kleurstof(bijv. Hoechst).
De efficiëntie van differentiatie wordt geëvalueerd als het percentage kernen in MyHC-positieve cellen: ga door naar de volgende stap als de efficiëntie >50% is.
-
In vivo: engraftment in een model van acute spierregeneratie
Om de in vivo bijdrage van MyoD-ER IDEMs aan spierregeneratie te evalueren, zijn de cellen eerder gelabeld met een vectorcodering voor het groene fluorescerende eiwit (GFP) waarmee ze in het weefsel kunnen worden getraceerd. MyoD-ER GFP IDEMs worden vervolgens geïnjecteerd in volwassen muriene spieren, die eerder gewond waren met een myotoxine(bijv. cardiotoxine). Om immuunafstoting tegen xenogeneïne (zoals HIDEMs) of genetisch gemanipuleerde/gecorrigeerde cellen te voorkomen, is het noodzakelijk om immunodeficiënte of immunosuppressieve muizen te gebruiken.- Voorbehandeling van de dieren met een intra-peritoneale injectie van 3,5 μl/g van 10 mg/ml tamoxifen (lipooplosbare vorm) 24 uur vóór de transplantatie en voorbehandeling van cellen die 1 μM 4OH-tamoxifen (waterige vorm) toevoegen aan het groeimedium 's nachts vóór de transplantatiedag.
- Anesthesie en analgesie toedienen aan de muis volgens de specifieke richtlijnen die chirurgische procedures in de dierenfaciliteit reguleren.
- Injecteer 25 μl 100 μM cardiotoxine (CTX; van Naja mossambica mossambica; LET OP: potentieel schadelijke stof) in de tibialis anterieure (TA) spieren.
- 24 uur na de behandeling van de dieren met tamoxifen en CTX, maak de cellen los door trypsinisatie en telling.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 232 x g.
- Was de celpellet in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS, centrifugeer en resuspendeer vervolgens voorzichtig de celpellet in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS tot een eindconcentratie van10 6 cellen/30 μl, wat het uiteindelijke volume van elke injectie zal zijn.
- Injecteer 30 μl celsuspensie in de eerder gewonde spieren met behulp van een spuit met een naald van 29 of 30 G. Let vooral op bij het verwijderen van de naald uit de spier. Doe het langzaam en vermijd het morsen van de celsuspensie door het spoor van de naald. Transplanteer de contralaterale TA niet en gebruik deze als controle, waarbij 30 μl Ca2+- en Mg2+-vrije PBS wordt geïnjecteerd om de omstandigheden van de getransplanteerde te repliceren.
- Behandel de dieren met tamoxifen gedurende zes extra dagen en dien analgesie(bijv. Carprofen) toe gedurende twee extra dagen.
- Explant de spieren vanaf 14 dagen na transplantatie. Verwerk en analyseer de monsters zoals beschreven in protocollen 4 en 5.
2. Transplantatie in muismodellen van spierdystrofie
Deze transplantatietest maakt het mogelijk om de mate van engraftatie van IDEMs in muismodellen van spierdystrofie te evalueren. De dieren, die als volgt worden behandeld, kunnen ook worden beoordeeld op functionele verbetering van het fenotype van de ziekte. Functionele tests kunnen worden uitgevoerd vanaf twee weken na transplantatie. Om de engraftment te verbeteren, kunt u overwegen om om de drie weken pretransplantatie loopbandoefeningen uit te voeren (zoals beschreven in Protocol 3) en/of seriële celinjecties gedurende 3x(d.w.z. voor een totaal van 3 injecties/spieren).
- Intramusculaire transplantatie
- Voorbehandel de dieren met een intra-peritoneale injectie van 3,5 μl/g van 10 mg/ml tamoxifen (lipooplosbare formulering) 24 uur voor de transplantatie en voorbehandeling van cellen die 's nachts vóór de transplantatiedag 1 μM 4OH-tamoxifen (waterige formulering) aan het groeimedium toevoegen.
- Maak los door trypsinisatie, tel en centrifugeer de cellen op 232 x g gedurende 5 min.
- Was de celkorrel in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS, centrifugeer en resuspend de pellet vervolgens in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS tot een concentratie van 106 cellen/30 μl.
- Beheer analgesie en desinfecteer de huid van het dier (optioneel) met een ontsmettingsmiddel op basis van povidonjodium of chloorexidine. Dit zal ook helpen om de tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) en quadriceps femoris (QC; specifiek de vastus intermedius) spieren te lokaliseren.
- Injecteer 30 μl celsuspensie in de spieren met een spuit met een naald van 29 of 30 G. Voor de TA, steek 5 mm van de naald 2 mm onder het inbrengen van de proximale pees (craniocaudale richting) met een helling van 15° ten opzichte van het scheenbeen en injecteer langzaam de celsuspensie terwijl u de naald intrekt (leeg de spuit met 2 mm van de naald nog steeds in de spier). Herhaal voor de GC en QC dezelfde procedure als beschreven voor de TA, met als belangrijkste verschil het caudocraniële inbrengen van de naald 2 mm boven de myotendinous junction van de achillespees voor de GC en 2 mm boven de distale pees voor de QC (15° helling ten opzichte van het dijbeen). Let op tijdens het verwijderen van de naald uit de spier om te voorkomen dat de celsuspensie door het spoor van de naald wordt gemorst.
PROBLEMEN OPLOSSEN: Overweeg in geval van lage engraftment het injecteren van juveniele (1-2 weken oude) muizen7 met 3 x10 5 cellen/10 μl (merk op dat tamoxifen in dit geval subcutaan moet worden toegediend).
- Intra-arteriële transplantatie
Dit deel van het protocol maakt het mogelijk om het vermogen van MIDEMs en HIDEMs te evalueren om in de arteriële circulatie te worden geleverd, de vaatwand over te steken en bij te dragen aan skeletspierregeneratie in de spieren stroomafwaarts naar de injectieplaats.- Voorbehandeling van dieren en cellen zoals hierboven beschreven in stap 2.1.1.
- Ontkoppel door trypsinisatie en filter met een 40 μm celzeef (om clusters uit de celsuspensie te verwijderen in het onwaarschijnlijke geval dat nachtelijke blootstelling aan tamoxifen fusie en vorming van myotubes uit aangrenzende cellen kan stimuleren) tel en centrifugeer de cellen op 232 x g gedurende 5 minuten
- Was de celpellet in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS, centrifugeer en resuspend de pellet in Ca2+- en Mg2+-vrije PBS met 0,2 Internationaal
Eenheden natrium heparine (facultatief) tot een uiteindelijke celconcentratie van 106 cellen/50 μl. Voeg 10% patentblauwe kleurstof (eindconcentratie: 1,25 mg/ml in normale zoutoplossing of Ca2+- en Mg2+-vrije PBS) toe aan de oplossing om de verdeling van de celsuspensie te visualiseren. - Anesthesie en analgesie toedienen aan de muis volgens de richtlijnen die chirurgische procedures in de specifieke institutionele dierenfaciliteit reguleren.
- Scheer het liesgebied (ook bekend als femur of Scarpa's driehoek) en desinfecteer de huid met een ontsmettingsmiddel op basis van povidonjodium of chloorhexidine.
- Maak een incisie van 5-7 mm en lokaliseer de femurbundel: ader, slagader en zenuw (de zenuw ligt lateraal op de slagader en de ader mediaal).
- Verwijder voorzichtig de verbindende fascia die de bundel bedekt met een tang.
- Scheid de dijbeenader en zenuw van de slagader door voorzichtig de punt van een tang (of een 30 G-naald) ertussen in te brengen en door het gat geleidelijk uit te vergroten.
PROBLEMEN OPLOSSEN: De femurader is fragiel: let erop dat u deze niet met de tang knijpt tijdens het losmaken van de femurslagader. In geval van bloeding, giet het bloed af met steriel gaas en gebruik een micro cauterizer om hemostase te vergemakkelijken. - Til de slagader op met één punt van de tang en klem de slagader vast met de andere punt.
- Prik de slagader door met een spuit uitgerust met een 30 G naald. Injecteer 50 μl celsuspensie stroomafwaarts van het geklemde gebied, met een infusiesnelheid van ongeveer 5 μl/sec.
PROBLEMEN OPLOSSEN: Resuspend de cellen in de spuit zorgvuldig vóór de injectie: het is van vitaal belang om neerslag van cellen en luchtbelvorming in de spuit te voorkomen. De diameter van de femurslagader is iets kleiner dan een naald van 30 G: zorg ervoor dat u de slagader niet afsnijdt tijdens het inbrengen van de naald. Patent blauwe kleurstof maakt het mogelijk om de effectiviteit van de injectie te herkennen: als het correct wordt geïnjecteerd, zal het hele ledemaat snel lichtblauw worden. - Verwijder langzaam de naald en de tang uit de slagader om de bloedbaan in het ledemaat te herstellen.
- Oefen druk uit met steriel gaas om bloedingen te voorkomen en/of cauteriseren indien nodig.
- Hecht de wond en controleer de dieren tot het herstel van de anesthesie.
- Dien analgesie gedurende 3 dagen toe en inspecteer de wond dagelijks (in geval van wondinfectie bespreek dit met het personeel van de dierenkliniek en dien antibiotica toe indien nodig).
3. Uitkomstmaten bij getransplanteerde dystrofische dieren: loopbandtest
Vanaf twee weken na celtransplantatie is het mogelijk om functionele verbetering van de motorische capaciteit van behandelde muizen te evalueren met de loopbandtests. Deze test maakt de evaluatie van inspanningstolerantie / uithoudingsvermogen van behandelde muizen mogelijk. Een muis wordt als vermoeid beschouwd wanneer hij langer dan 5 seconden in het rustgebied ligt, zonder te proberen de loopband opnieuw aan te houden na een reeks van 3 opeenvolgende mechanische stimuli (één om de 5 seconden). Nulmetingen beginnen ongeveer een maand voor de behandeling en worden gebruikt om de verbetering van elk getest dier te evalueren. Deze test kan worden gevolgd door aanvullende tests om de kwetsbaarheid van vezels, krachtverbetering, engraftment, differentiatie van getransplanteerde cellen en morfologische verbetering van de getransplanteerde spieren te controleren (zie Discussie).
- Acclimatiseer de dieren (meestal drie groepen: behandelde, onbehandelde en wilde type/niet-dystrofische controles) aan de oefening vóór de eerste meting: stel de loopband in op een snelheid van 6 m/min gedurende 10 min. Herhaal de procedure om de andere dag gedurende een week.
PROBLEMEN OPLOSSEN: Registreer alle metingen op hetzelfde uur van de dag om vooroordelen als gevolg van de circadiane cycli te voorkomen. - Plaats de dieren in de loopband, die eerder is opgezet met een helling van 10°.
- Zet de loopband aan, met een startsnelheid van 6 m/min (zorg voor een zachte mechanische stimulans voor het geval de dieren niet bereid zijn om met de oefening te beginnen).
- Start de timer en verhoog de snelheid elke 2 minuten met 2 m/min.
- Zodra een dier langer dan 5 seconden in het rustgebied ligt zonder te proberen de loopband opnieuw aan te sluiten, raakt u het voorzichtig aan met een stok om de herstart van de oefening te stimuleren (zie hierboven).
- Noteer de prestaties (tijd en of afstand) van elk dier.
- Herhaal de metingen wekelijks of om de 10 dagen gedurende ten minste 3x.
- Herhaal dezelfde procedure na transplantatie.
- Analyseer prestatiegegevens waarbij de meting van elk dier wordt vergeleken met de basisprestaties. We raden aan om de waarden in een grafiek te plotten als een percentage van de gemiddelde motorcapaciteit ten opzichte van de uitgangswaarde en deze te analyseren door middel van een een- of tweerichtings ANOVA-test, gevolgd door de juiste post-test om de groepen te vergelijken.
PROBLEEMOPLOSSING: gebruik minimaal 5 leeftijds-, genotype- en geslacht-gematchte dieren/groep en herhaal de metingen gedurende ten minste 3x na transplantatie.
4. Evaluatie van celtransplantatie en differentiatie in getransplanteerde spieren
Getransplanteerde en controlespieren worden op het juiste moment geoogst (<2 dagen voor kortetermijnengraftmentanalyse, 2-3 weken voor tussentijdse en >1 maand voor langetermijnanalyse). Als de getransplanteerde cellen zijn gelabeld met GFP, kan de engraftment in vers geïsoleerde spieren worden beoordeeld door directe fluorescentie onder een met UV uitgeruste stereomicroscoop.
- Leg en oriënteer langs de verticale as vers geïsoleerde spieren in tragachanthgom (6% w/v)
- Dehydrateer de monsters in voorgekauwde isopentane gedurende één minuut, vries ze minstens 2 minuten in vloeibare stikstof in en plaats ze onmiddellijk op -80 °C voor opslag.
- Verwerk de monsters met een cryostaat om 7 μm dikke secties op gepolariseerde dia's te verkrijgen. Bemonster het grootste deel van de spier op de dia's en verzamel ongeveer 8-10 dia's met 30-40 secties / dia. Het is raadzaam om een reeks secties in een buis van 1,5 ml te verzamelen om moleculaire biologie / biochemische assays uit te voeren.
- Evalueer celengraftment met verschillende immunofluorescente kleuring, afhankelijk van de experimentele opstelling. Bijvoorbeeld, in het geval van HIDEM-transplantatie bij Sgca-null/scid/bg muizen, vleksecties met: a) een antilichaam tegen Lamin A/C om geënte menselijke celkernen te detecteren; b) een antilichaam tegen Laminine om de algehele structuur van de spier te visualiseren; en c) een antilichaam tegen Sgca om donorgedefinieerd herstel van het eiwit dat afwezig is in het dystrofische dier op te sporen.
- Kwantificeer met behulp van een fluorescentiemicroscoop het aantal donorkernen per spiersectie binnen en buiten spiervezels en het aantal van donor afgeleide skelet myofibers per sectie.
5. Spier histopathologie
Histopathologische analyses maken de evaluatie van de morfologische structuur van de getransplanteerde spier mogelijk. Architectonische verbetering van de weefselstructuur wordt verwacht als resultaat van de celtherapiebenadering.
- Bevestig de vers geïsoleerde spieren met 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Dehydrateer de monsters met een stijgende sacharosegradiënt(bijv. 7,5-15-30% w/v).
- Laat de spieren een nacht in de hoogste sacharose-oplossing.
- Sluit de monsters in weefsel Tek OCT in, plaats ze in voorgekrompen isopentane totdat de LGO vast wordt (vermijd volledige onderdompeling van de monsters), vries ze minstens 2 minuten in vloeibare stikstof in en plaats ze onmiddellijk op -80 °C voor opslag.
- Verwerk de monsters met een cryostaat om 7 μm dikke secties te verkrijgen zoals hierboven beschreven.
- Bevlek de secties met hematoxyline en eosine of Masson's trichrome volgens de standaard protocollen van de fabrikant.
Hematoxyline- en eosinekleuring maakt het mogelijk om kenmerken van regenererende spieren te berekenen, zoals: a) het aantal myofiberen; b) dwarsdoorsnedegebied; c) het aantal myofiberen dat een centrale kern bevat. Masson's trichrome wordt gebruikt om de fibrotische index te berekenen, gedaan door het totale gebied dat door de skeletmyofibers wordt ingenomen, af te trekken van het totale gebied van het beeld: het resulterende gebied weerspiegelt voornamelijk het bindweefsel en het vetfiltreren van de spier. Alle analyses op de beelden konden worden uitgevoerd met behulp van ImageJ-software (NIH) met de meettool en celtellerplug-in.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gerapporteerde representatieve resultaten volgen de belangrijkste in vitro/in vivo-assays die in de workflow in figuur 1worden weergegeven . 48 uur na toediening van 4OH-tamoxifen MyoD-positieve kernen zijn identificeerbaar binnen MyoD-ER-getransduceerde IDEM's in cultuur (Figuur 2A). De cellen fuseren en differentiëren vervolgens in multinucleated myotubes (Figuur 2B). Wanneer IDEM's intramusculair worden getransplanteerd in een murien model van acuut spierletsel, dragen ze bij aan weefselregeneratie (figuur 3). De werkzaamheid van IDEMs in een gen- en celtherapie-setting voor muriene modellen van spierdystrofie werd beoordeeld door de loopband inspanningstolerantietest: Figuur 4 toont de resultaten verkregen na transplantatie van wilde MIDEM's in Sgca-null/scid/beige muizen, met een verbetering van de motorische capaciteit bij behandelde muizen7. Ex vivo analyses van getransplanteerde spieren tonen GFP-positieve gebieden die de mate van kolonisatie van IDEMs in het gastheerweefsel vertegenwoordigen (Figuren 5A-C), wat aantoont dat donorcellen in dystrofische spieren worden getransgrafeerd. Belangrijk is dat getransplanteerde cellen invivo kunnen differentiëren en nieuwe skelet myofibers kunnen vormen. Figuur 5 toont inderdaad sgca-expressie van genetisch gecorrigeerde HIDEMs in Sgca-null/scid/beige muizen (figuren 5D en 5E). Structurele verbetering in de architectuur van getransplanteerde spieren kan worden beoordeeld door masson's trichrome kleuring: Figuur 5F toont een afname van de hoeveelheid fibrotisch weefsel in behandelde spieren.
Figuur 1. Protocol stroomdiagram. De regeling geeft een overzicht van de op IDEM gebaseerde strategie, van voorlopige in vitro differentiatietesten (links) tot de verschillende stappen die nodig zijn om engraftment, myogene potentie en functionele verbetering in vivo en ex vivo (rechts) te beoordelen. Donkergrijze vakken bevatten de verschillende stappen die in het protocol worden beschreven; lichtgrijze dozen bevatten delen van de methode die niet in dit artikel zijn beschreven. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 2. Beoordeling van het myogene potentieel in vitro. (A) Immunofluorescentie met nucleaire MyoD-expressie in 4 van de 7 MyoD-ER getransduceerde MIDEM-kernen na 48 uur blootstelling aan 4OH-tamoxifen. (B) Immunofluorescentiekleuring voor myosine zware keten (MyHC) op 4OH-tamoxifen-geïnduceerde HIDEM-afgeleide myotubes na een week in differentiatiemedium (Schaalbalk, 200 μm). Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 3. In vivo beoordeling van celengraftment in een model van acute spierregeneratie. (A) Stereomicroscopische GFP-fluorescentiebeelden van vers geïsoleerde cardiotoxine-geblesseerde tibialis anterieure spieren die 2 weken na intramusculaire injectie van 106 GFP-HIDEMs (links) en GFP-MIDEMs (midden) zijn geëxplanteerd. Schaalbalk, 2 mm. (B) Lage (boven) en hoge (onderste) vergrotingsfoto's van de spier getransplanteerd met MIDEMs weergegeven in (A) met GFP-positieve myofibers. Schaalbalk, 200 μm. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 4. Loopband oefening tolerantie test. Representatieve loopbandtest voor getransplanteerd (IM = intramusculair; IA = intra-arteriële). Sgca-null/scid/beige muizen (106 cel/injectie) versus niet-getransplanteerde dystrofische en niet-dystrofische controle immunodeficiënte muizen. Het plot toont functionele verbetering van dystrofische muizen getransplanteerd met MIDEM's (12-22% meer dan niet-getransplanteerde dieren 35 dagen na transplantatie). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde motorische capaciteit ten opzichte van de uitgangsprestaties(d.w.z. 100% vertegenwoordigt de basisprestaties van elke groep en alleen behandelde muizen verbeteren deze aanzienlijk bij herhaalde metingen). *P < 0,05; **P < 0,005, enkele reis ANOVA. Uit eerder gepubliceerd werk van de auteurs7. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 5. In vivo beoordeling van engraftment en myogene potentie in muismodellen van spierdystrofie. (A) Stereomicroscopische GFP-fluorescentiebeelden van vers geïsoleerde tibialis-voorste spieren van Sgca-null/scid/beige muizen die 3-4 weken na intramusculaire injectie van 10 6 menselijke (HIDEM's, links;transplantatie bij jonge muizen) en murine (MIDEM's; rechts) GFP-IDEMs zijn uitgeplant. Schaalbalk, 2 mm. (B) Stereomicroscopisch GFP-fluorescentiebeeld van een vers geïsoleerde gastrocnemiusspier die 3 weken na intra-arteriële injectie van 106 GFP-MIDEM's is uitgeplant. Schaalbalk, 1 mm. (C) Vers bevroren dwarsgedeelte van de spier getransplanteerd met MIDEMs weergegeven in (A) met een cluster van GFP-positieve myofiberen. Schaalbalk, 200 μm. (D) Immunofluorescentiekleuring op delen van intra-gespierde getransplanteerde spieren (zoals in A) met clusters van genetisch gecorrigeerde vezels, afkomstig van geënt IDEM's. Schaalbalk, 150 μm. (E) Kwantificering van α-sarcoglycan (Sgca)-positieve myofibers één maand na intramusculaire transplantatie van genetisch gecorrigeerde IDEMs in Sgca-null/scid/beige muizen. (F) Masson trichrome kleuring van tibialis voorste spieren van getransplanteerde en controle Sgca-null/scid/beige muizen (rood: spiervezels; blauw: fibrose) benadrukken de vermindering van de fibrotische infiltreren in behandelde spier. Schaalbalk, 200 μm. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC 's kunnen voor onbepaalde tijd worden uitgebreid met behoud van hun zelfvernieuwingspotentieel en dus worden gericht op differentiering in een breed scala aan cellijnen12. Om deze en andere redenen worden iPSC-afgeleide stam-/voorlopercellen beschouwd als een veelbelovende bron voor autologe gen- en celtherapiebenaderingen13. Een eerder gepubliceerd werk van de auteurs rapporteerde de generatie van muis- en menselijke myogene voorlopers van iPSC's met een fenotype vergelijkbaar met dat van pericyt-afgeleide BLB's (IDEMs) en hun efficiënte bijdrage aan spierregeneratie in een muismodel van spierdystrofie7.
Een voorwaarde om het myogene potentieel van IDEM te maximaliseren, is de expressie van de myogene factor MyoD in de cellen. De transductie met een tamoxifen-inducerende MyoD-ER cassette maakte het mogelijk om een nauwkeurige temporele controle over de expressie ervan te hebben met het voordeel dat de activering ervan in de hele cultuur en vervolgens in vivowerd gesynchroniseerd . Een transplantatiestrategie op basis van één enkele toediening van cellen per spier (of per femurslagader) is beschreven in dit artikel. Het is echter aangetoond dat herhaalde celinjecties effectief zijn bij het verhogen van de MAB-engraftment in verschillende celtherapieprotocollen8. Daarom is het in het geval van suboptimale resultaten met IDEM's de moeite waard om herhaalde transplantaties uit te voeren om de celdosering te verhogen en dus een bijdrage aan de gastheerspier.
Uitkomstmetingen maken het mogelijk de bijdrage van donorcellen aan de functionele verbetering van het fenotype van behandelde dieren te evalueren. Naast de inspanningstolerantie/uithoudingstest die met de loopband wordt uitgevoerd, kunnen verdere tests om vrijwillige motorcapaciteit te analyseren(bijv. freewheeltest), vezel fragiliteit(bijv. Evans blue dye uptake assay) en specifieke kracht(bijv. enkele vezels of hele spiermechanica) worden beschouwd als8. Aanvullende methoden voor het testen van functionele fenotype-verbetering zijn standaard beschikbaar op de Treat-NMD-website (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Om significante informatie van de getransplanteerde dieren te verzamelen, moet de functionele verbetering worden gevolgd en gevalideerd door immunohistochemische en histologische analyses, om celengraftment en weefselarchitectuur / remodellering te evalueren. In het bijzonder is het belangrijk om de morfometrische structuur van de geënt spieren te evalueren op kenmerken van regeneratie en fibrose, zoals het beoordelen van het aantal vezels met een centrale kern, het myofibers-dwarsdoorsnedegebied en de fibrotische index. Deze laatste analyses geven samen met de functionele uitkomsten een uitputtend overzicht van de effectiviteit van de strategie. Bovendien is het monitoren van de afstamming die door getransplanteerde cellen wordt aangenomen in termen van bijdrage aan het weefsel(d.w.z. myofiberen) en het behoud van het stamcelcompartiment belangrijk voor de langetermijneffectiviteit van alle celtherapiestrategieën. In dit geval is reeds gemeld dat de donor-afgeleide bijdrage in vivo is geleverd aan het pericytcompartiment waaruit mesoangioblasten zijn afgeleid7; bovendien wijzen voorlopige resultaten op functionele bijdrage van IDEM's ook aan de satellietcelpool (Gerli en Tedesco, niet-gepubliceerde resultaten). Moleculaire analyses om engraftment en expressie van het gecorrigeerde gen aan te tonen(d.w.z. kwantitatieve PCR en western blot) zijn ook kritisch, maar vallen buiten het bereik van dit artikel en vereisen een speciaal artikel.
Hoewel dit protocol voornamelijk is ontwikkeld met behulp van Sgca-null / scid / beige muizen7 (een onlangs gepubliceerd immunodeficiënt model van LGMD2D), wordt verwacht dat het gemakkelijk van toepassing kan zijn op andere modellen van spierziekte. In het geval van Sgca-null/scid/beige, muizen gebruikten we geen cardiotoxine, omdat de spieren van deze dieren ernstig aangetast zijn en chronisch onderhevig zijn aan degeneratie- en regeneratiecycli (dus een extra schade door cardiotoxine is niet nodig). We konden echter niet uitsluiten dat een voorbehandeling met cardiotoxine engraftment in mildere modellen van spierdystrofie(bijv. mdx-muizen) zou kunnen vergemakkelijken. Ameliorations van onze strategie kunnen methoden omvatten om de immunodeficiëntie van de muisgastheer te verbeteren (die in de huidige modellen nog suboptimaal is) en de werkzaamheid van donorcelengraftment, met name bij intra-arteriële toediening van xenogenetische cellen. Hoewel meervoudige celtransplantatie en het gebruik van juveniele muizen bijdragen aan de toename van celengraftment7,8, kunnen de adhesiemoleculen van muizen die menselijke cellen tegenkomen tijdens extravasatie en/of migratie extra hindernissen vormen voor de beperkte immunodeficiëntie van de huidige modellen. Toekomstige aanwijzingen voor de vertaling van deze gen- en celtherapiebenadering in een klinische setting kunnen farmacologische strategieën omvatten om de celuitvasatie en het gebruik van niet-integrerende vectoren(bijv. plasmiden, mRNAs, menselijke kunstmatige chromosomen of niet-integrerende virale vectoren) te verbeteren om de cellen te herprogrammeren en genetisch te corrigeren, waardoor het risico van insertie mutagenese wordt vermeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. heeft een internationale octrooiaanvraag ingediend (nr. PCT/GB2013/050112) inclusief een deel van de strategie die in dit artikel wordt beschreven. Hij ontving financiering van Promimetic en DWC ltd. voor zijn onderzoek.
Acknowledgments
De auteurs danken Giulio Cossu, Martina Ragazzi en het hele laboratorium voor nuttige discussie en ondersteuning, en Jeff Chamberlain voor het vriendelijk leveren van MyoD-ER vector. Alle experimenten met levende dieren werden voltooid in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele instanties, voorschriften en richtsnoeren. Het werk in het auteurslaboratorium wordt ondersteund door de Uk Medical Research Council, de 7e kaderprojecten Optistem and Biodesign van de Europese Gemeenschap en het Italiaanse Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
