Summary
Indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede myogene forfedre er lovende kandidater for celleterapi strategier for å behandle muskeldystrofier. Denne protokollen beskriver transplantasjon og funksjonelle målinger som kreves for å evaluere engraftment og differensiering av iPSC-avledede mesoangioblaster (en type muskelforfedere) i musemodeller av akutt og kronisk muskelregenerering.
Abstract
Pasientavledede iPSCer kan være en uvurderlig kilde til celler for fremtidige autologe celleterapiprotokoller. iPSC-avledede myogene stamceller/stamceller som ligner pericytt-avledede mesoangioblaster (iPSC-avledede mesoangioblastlignende stamceller/stamceller: IDEMer) kan etableres fra iPSCer generert fra pasienter som er påvirket av ulike former for muskeldystrofi. Pasientspesifikke IDEMer kan korrigeres genetisk med forskjellige strategier(f.eks. lentivirale vektorer, humane kunstige kromosomer) og forbedres i deres myogene differensieringspotensial ved overekspressering av myogeneseregulatoren MyoD. Dette myogene potensialet blir deretter vurdert in vitro med spesifikke differensieringsanalyser og analysert av immunfluorescens. Det regenerative potensialet til IDEMs er ytterligere evaluert in vivo, ved intramuskulær og intraarteriell transplantasjon i to representative musemodeller som viser akutt og kronisk muskelregenerering. Bidraget fra IDEMs til vertsskjelettermuskelen bekreftes deretter av forskjellige funksjonelle tester hos transplanterte mus. Spesielt studeres ameliorasjonen av dyrenes motorkapasitet med tredemølletester. Celle engraftment og differensiering blir deretter vurdert av en rekke histologiske og immunfluorescence analyser på transplanterte muskler. Samlet sett beskriver dette dokumentet analysene og verktøyene som for tiden brukes til å evaluere differensieringskapasiteten til IDEMer, med fokus på transplantasjonsmetodene og påfølgende resultattiltak for å analysere effekten av celletransplantasjon.
Introduction
Mesoangioblaster (MAB) er kar-assosierte muskel forfedre avledet fra en undergruppe av pericytter1-3. Den største fordelen med MABs over kanoniske muskelgenitorer som satellittceller4 ligger i deres evne til å krysse karveggen når den leveres intraarteriell og dermed bidra til skjelettmuskulaturregenerering i celleterapiprotokoller. Denne funksjonen har blitt evaluert og bekreftet i både murin- og hundemodeller av muskeldystrofi1,5,6. Disse prekliniske studiene har bygget grunnlaget for en første-i-mann fase I / II klinisk studie basert på intraarteriell transplantasjon av donor HLA-identiske MAB hos barn med Duchenne muskeldystrofi (EudraCT nr. 2011-000176-33; for tiden på å gå på San Raffaele Hospital of Milan, Italia). En av de viktigste hindringene for celleterapi tilnærminger, hvor milliarder av celler er nødvendig for å behandle muskelen i en hel kropp, er det begrensede proliferative potensialet til "legemidlet" (cellene). Videre har det nylig blitt demonstrert at det ikke er mulig å få MAB fra pasienter som er berørt av noen former for muskeldystrofier, da det forekommer i lembelte muskeldystrofi 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
For å overvinne disse begrensningene, har en protokoll for å utlede MAB-lignende stamceller / stamceller fra menneskelige og murin iPSCer nylig blitt etablert7. Denne prosedyren genererer lett utvidbare cellepopulasjoner med en vaskulær gensignatur og immunofenotype som ligner på voksne muskelavledede MAB-er. Ved uttrykk for den myogene regulatoriske faktoren MyoD gjennomgår både murine og humane IDEMer (henholdsvis MIDEMs og HIDEMs) terminal skjelettmuskulaturdifferensiering. For å oppnå dette målet kan IDEMer transduseres med vektorer som kan drive MyoD-uttrykk, enten konstituert eller på en uduselig måte8-10. En lentiviral vektor som inneholder MyoD cDNA smeltet sammen med østrogenreseptoren (MyoD-ER) brukes, og tillater dermed sin kjernefysiske translokasjon ved tamoxifen (en østrogenanalog) administrasjon11. Denne strategien resulterer i dannelsen av hypertrofiske multinukleerte myotuber, med høy effektivitet7. Spesielt er IDEMs ikke-tumorigene, kan engraft og skille inne i vertsmuskulaturen ved transplantasjon og kan genetisk korrigeres ved hjelp av forskjellige vektorer(f.eks. lentivirus eller menneskelige kunstige kromosomer), og baner vei for fremtidige autologe terapeutiske strategier. Avledning, karakterisering og transplantasjon av IDEMer er beskrevet i publikasjonenovenfor 7. Dette protokollpapiret beskriver analysene som utføres for å evaluere in vitro myogen differensiering av IDEMer og de påfølgende resultatmålingene for å teste effekten av transplantasjonen i musemodeller av muskelregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurdering av myogent og engraftmentpotensial
-
In vitro: MyoD-indusert differensiering
- Generer en stabil cellelinje med IDEMer transdusert med den tamoxifen-induserbare MyoD-ER lentiviral vektoren, titrere mangfoldet av infeksjon (MOI; f.eks. 1, 5 og 50) ved bruk av fargingen beskrevet i 1.1.9 (MyHC) som et resultat av prosedyrens effektivitet.
- Strøk en 3,5 cm tallerken med 1 ml 1% matrigel og inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Vask platen to ganger med middels, frø 1 x 105 MyoD-ER transduserte IDEMer i 3,5 cm vevskulturfatet og inkuber ved 37 °C i vekstmedium.
- Forvent at cellene når samløp i en eller to dager og tilsett deretter 1 μM 4OH-tamoxifen i vekstmediet (1st dose).
- Etter 24 timer, erstatt vekstmediet med differensieringsmedium supplert med 1 μM 4OH-tamoxifen (2nd og siste dose).
- Bytt ut halvparten av mediet med frisk differensieringsmedium annenhver dag.
- Undersøk daglig kulturer for myotube formasjon.
- Etter en uke (5 dager i differensieringsmedium), vask platene forsiktig med PBS og fest med 4% paraformaldehyd i 5 min ved RT.
- Utfør en immunfluorescensfarging med antistoffer mot myosin tung kjede (MyHC) for å bekrefte tilstedeværelsen av myotubes. Motstain med kjernefysisk fargestoff(f.eks.
Effektiviteten av differensiering evalueres som prosentandelen av kjerner inne i MyHC-positive celler: Fortsett til neste trinn hvis effektiviteten er >50%.
-
In vivo: engraftment i en modell av akutt muskelregenerering
For å evaluere in vivo-bidraget fra MyoD-ER IDEMs til muskelregenerering, er cellene tidligere merket med en vektorkoding for det grønne fluorescerende proteinet (GFP) som vil gjøre det mulig å spore dem inne i vevet. MyoD-ER GFP IDEMs injiseres deretter i voksne murine muskler, tidligere skadet med et mytoksin (f.eks. kardiotoksin). For å unngå immunavvisning mot xenogene (som HIDEMs) eller genetisk manipulerte/korrigerte celler er det nødvendig å bruke enten immunodeficient eller immunsupprimerte mus.- Forbehandle dyrene med en intra-peritoneal injeksjon på 3,5 μl/g av 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble form) 24 timer før transplantasjon og forbehandling celler legge 1 μM 4OH-tamoxifen (vandig form) inn i vekstmediet over natten før transplantasjonsdagen.
- Administrer anestesi og analgesi til musen etter de spesifikke retningslinjene som regulerer kirurgiske prosedyrer i dyreanlegget.
- Injiser 25 μl 100 μM kardiotoksin (CTX; fra Naja mossambica mossambica; FORSIKTIG: potensielt skadelig stoff) i tibialis fremre (TA) muskler.
- 24 timer etter behandling av dyrene med tamoksifen og CTX, løsne cellene ved prøving og telling.
- Sentrifuger cellene ved 232 x g i 5 min.
- Vask cellepellet i Ca2+- og Mg2 +-fri PBS, sentrifuge og deretter forsiktig resuspend cellepellet i Ca2 +- og Mg2 +- gratis PBS til en endelig konsentrasjon på 106 celler / 30 μl, som vil være det endelige volumet av hver injeksjon.
- Injiser 30 μl cellefjæring i de tidligere skadede musklene ved hjelp av en sprøyte med 29 eller 30 G nål. Vær spesielt oppmerksom mens du fjerner nålen fra muskelen. Gjør det sakte, unngå å søle cellefjæringen gjennom nålens spor. Ikke transplanter den kontralaterale TA og bruk den som kontroll, injisere 30 μl av Ca2 +- og Mg2 +-fri PBS for å gjenskape forholdene til den transplanterte.
- Behandle dyrene med tamoksifen i seks ekstra dager og administrer analgesi(f.eks. Carprofen) i to ekstra dager.
- Utvis musklene fra 14 dager etter transplantasjon og utover. Behandle og analyser prøvene som beskrevet i protokoll 4 og 5.
2. Transplantasjon i musemodeller av muskeldystrofi
Denne transplantasjonsanalysen gjør det mulig å evaluere omfanget av engraftment av IDEM-er i musemodeller av muskeldystrofi. Dyrene, behandlet som følger, kan også vurderes for funksjonell ameliorasjon av sykdommen fenotype. Funksjonelle tester kan utføres fra to uker etter transplantasjon. For å forbedre engraftment vurdere å utføre pretransplantasjon tredemølle trening (som beskrevet i protokoll 3) og / eller seriecelle injeksjoner hver tredje uke for 3x (dvs. for totalt 3 injeksjoner / muskel).
- Intramuskulær transplantasjon
- Forbehandle dyrene med en intra-peritoneal injeksjon på 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble formulering) 24 timer før transplantasjon og forbehandling celler legge 1 μM 4OH-tamoxifen (vandig formulering) inn i vekstmediet over natten før transplantasjonsdagen.
- Løsne ved trypsinisering, telle og sentrifugere cellene ved 232 x g i 5 min.
- Vask cellepellet i Ca2+- og Mg2 +- gratis PBS, sentrifuger og deretter resuspend pellet i Ca2 +- og Mg2 +- gratis PBS til en konsentrasjon på 106 celler / 30 μl.
- Administrer analgesi og desinfiser dyrets hud (valgfritt) med et povidon jod- eller klorexidinbasert desinfeksjonsmiddel. Dette vil også bidra til å lokalisere tibialis fremre (TA), gastrocnemius (GC) og quadriceps femoris (QC; spesielt de enorme intermedius) musklene.
- Injiser 30 μl cellefjæring i musklene ved hjelp av en sprøyte med 29 eller 30 G nål. For TA, sett inn 5 mm av nålen 2 mm under innsetting av den proksimale senen (kraniocaudal retning) med en 15 ° helling i forhold til tibia og injiser sakte celleopphenget mens du trekker tilbake nålen (tøm sprøyten med 2 mm nålen fortsatt inne i muskelen). For GC og QC, gjenta samme prosedyre som beskrevet for TA, med hovedforskjellen er kaudocranial innsetting av nålen 2 mm over det myotendinøse krysset av akillessenen for GC og 2 mm over den distale senen for QC (15 ° tilbøyelighet med hensyn til lårbenet). Vær oppmerksom mens du fjerner nålen fra muskelen for å unngå å søle cellefjæringen gjennom nålens spor.
FEILSØKING: Ved lav engraftment bør du vurdere å injisere juvenile (1-2 uker gamle) mus7 med 3 x 105 celler / 10 μl (merk at tamoxifen i dette tilfellet må administreres subkutant).
- Intraarteriell transplantasjon
Denne delen av protokollen gjør det mulig å levere evaluering av MIDEMs og HIDEMs evne i arteriell sirkulasjon, krysse karveggen og bidra til skjelettmuskulaturregenerering i musklene nedstrøms til injeksjonsstedet.- Forbehandle dyr og celler som beskrevet ovenfor i trinn 2.1.1.
- Løsne ved prøving og filtrer med en 40 μm cellesil (for å fjerne klynger fra cellesuspensjonen i det usannsynlige tilfellet at eksponering for tamoksifen over natten kan drive fusjon og dannelse av myotuber fra tilstøtende celler) telle og sentrifugere cellene ved 232 x g i 5 minutter
- Vask cellepellet i Ca2+- og Mg2 +- gratis PBS, sentrifuge og deretter resuspend pellet i Ca2 +- og Mg2 +- gratis PBS med 0.2 International
Enheter av natrium heparin (valgfritt) til en endelig cellekonsentrasjon på 106 celler / 50 μl. Tilsett 10% patentblå fargestoff (sluttkonsentrasjon: 1,25 mg/ml i normal saltvann eller Ca2+- og Mg2+-fri PBS) til løsningen for å visualisere fordelingen av cellefjæringen. - Administrer anestesi og analgesi til musen i henhold til retningslinjene som regulerer kirurgiske prosedyrer i det spesifikke institusjonelle dyreanlegget.
- Barber inguinalområdet (også kjent som femoral eller Scarpa trekant) og desinfiser huden med et povidon jod- eller klorhexidinbasert desinfeksjonsmiddel.
- Lag et 5-7 mm snitt og lokaliser lårbunten: vene, arterie og nerve (nerven ligger lateralt til arterien og venen medialt).
- Fjern forsiktig den bindende fasciaen som dekker bunten med tang.
- Skill lårbenet og nerven fra arterien ved å forsiktig introdusere spissen av en tang (eller en 30 G nål) mellom dem og ved å gradvis forstørre hullet.
FEILSØKING: Lårvenen er skjør: Vær oppmerksom på at du ikke klemmer den med tangene under løsrivelsen fra lårarterien. Ved blødning, tøm blodet med steril gasbind og bruk en mikrokauterizer for å lette hemostase. - Løft arterien med den ene spissen av tangene og klem arterien med den andre spissen.
- Punkter arterien med en sprøyte utstyrt med en 30 G nål. Injiser 50 μl celleoppheng nedstrøms for det klemmede området, med en infusjonshastighet på ca. 5 μl/sek.
FEILSØKING: Resuspender cellene forsiktig i sprøyten før injeksjonen: det er viktig å unngå utfelling av celler og luftbobledannelse inne i sprøyten. Diameteren på lårarterien er litt mindre enn en 30 G nål: vær forsiktig så du ikke avkorter arterien mens du setter inn nålen. Patentblå fargestoff gjør det mulig å gjenkjenne injeksjonens effektivitet: Hvis det injiseres riktig, vil hele lemmen raskt bli lyseblå. - Fjern langsomt nålen og tangene fra arterien for å gjenopprette blodstrømmen i lemmen.
- Påfør trykk med steril gasbind for å unngå blødning og/eller cauterize etter behov.
- Suturer såret og overvåk dyrene til utvinning fra anestesi.
- Administrer analgesi i 3 dager og inspiser såret daglig (i tilfelle sårinfeksjon diskuterer dette med dyrets anleggspersonell og administrerer antibiotika etter behov).
3. Utfallstiltak på transplanterte dystrofiske dyr: Tredemølletest
Fra to uker etter celletransplantasjon er det mulig å evaluere funksjonell ameliorasjon av motorkapasiteten til behandlede mus med tredemølletestene. Denne testen tillater evaluering av treningstoleranse / utholdenhet av behandlede mus. En mus anses å være utmattet når den ligger i hvileområdet i mer enn 5 sek, uten å forsøke å reengage tredemøllen etter en serie på 3 påfølgende mekaniske stimuli (en hvert 5. sekund). Baseline målinger starter omtrent en måned før behandling og brukes til å evaluere forbedringen av hvert enkelt testet dyr. Denne testen kan etterfølges av ytterligere analyser for å overvåke fiberskjørhet, kraftforbedring, engraftment, differensiering av transplanterte celler og morfologisk ameliorasjon av de transplanterte musklene (se Diskusjon).
- Akklimatiser dyrene (vanligvis tre grupper: behandlet, ubehandlet og vill type / ikke-dystrofiske kontroller) til øvelsen før den første målingen: Sett tredemøllen med en hastighet på 6 m / min i 10 minutter. Gjenta prosedyren annenhver dag i en uke.
FEILSØKING: Registrer alle målingene på samme time på dagen for å unngå skjevheter på grunn av døgnsyklusene. - Plasser dyrene i tredemøllen, som tidligere er satt opp med en helling på 10°.
- Slå på tredemøllen, med en starthastighet på 6 m/min (gi en skånsom mekanisk stimulans i tilfelle dyrene ikke er villige til å starte øvelsen).
- Start timeren og øk hastigheten 2 m/min hvert 2.
- Så snart et dyr ligger i hvileområdet i mer enn 5 sekunder uten å forsøke å reengage tredemøllen, må du forsiktig berøre den med en pinne for å stimulere omstarten av øvelsen (se ovenfor).
- Registrer ytelsen (tid og eller avstand) til hvert dyr.
- Gjenta målingene ukentlig eller hver 10.
- Gjenta samme prosedyre etter transplantasjon.
- Analyser ytelsesdata som sammenligner målingen av hvert dyr med grunnlinjeytelsen. Vi foreslår at du tegner inn verdiene i en graf som en prosentandel av den gjennomsnittlige motorkapasiteten i forhold til baseline, og for å analysere dem med en en- eller toveis ANOVA-test etterfulgt av passende ettertest for å sammenligne gruppene.
FEILSØKING: Bruk minst 5 alder-, genotype- og sextilpassede dyr/gruppe og gjenta målingene for minst 3x etter transplantasjon.
4. Evaluering av celle engraftment og differensiering i transplanterte muskler
Transplanterte og kontrollmuskler høstes på riktig tidspunkt (<2 dager for kortsiktig engraftmentanalyse, 2-3 uker for midtveis og >1 måned for langsiktig analyse). Hvis de transplanterte cellene er merket med GFP, kan engraftmentet i nyisolerte muskler vurderes ved direkte fluorescens under et UV-utstyrt stereomikroskop.
- Legg og orienter langs den vertikale aksen nyisolerte muskler i tragachanth tyggegummi (6% m / v)
- Dehydrer prøvene i prechilled isopentan i ett minutt, frys dem i flytende nitrogen i minst 2 min og plasser dem umiddelbart ved -80 °C for lagring.
- Behandle prøvene med en kryostat for å oppnå 7 μm tykke seksjoner på polariserte lysbilder. Prøv mesteparten av muskelen på lysbildene, samle ca 8-10 lysbilder med 30-40 seksjoner / lysbilde. Det anbefales å samle en rekke seksjoner i et 1,5 ml rør for å utføre molekylærbiologi / biokjemianalyser.
- Evaluer celle engraftment med forskjellige immunfluorescerende flekker, avhengig av det eksperimentelle oppsettet. For eksempel, i tilfelle HIDEM transplantasjon i Sgca-null / scid / bg mus, flekk seksjoner med: a) et antistoff mot Lamin A / C for å oppdage podede menneskelige cellekjerner; b) et antistoff mot Laminin for å visualisere muskelens generelle struktur; og c) et antistoff mot Sgca for å oppdage donor-avledet restaurering av proteinet fraværende i det dystrofiske dyret.
- Kvantifisere, ved hjelp av et fluorescensmikroskop, antall donorkjerner per muskelseksjon i og utenfor muskelfibre og antall donor-avledede skjelett myofibers per seksjon.
5. Muskel histopatologi
Histopatologiske analyser tillater evaluering av den morfologiske strukturen til den transplanterte muskelen. Arkitektonisk forbedring i vevsstrukturen forventes som et resultat av celleterapitilnærmingen.
- Fest de nyisolerte musklene med 4% paraformaldehyd i 1 time ved 4 °C.
- Dehydrere prøvene med en stigende sukrosegradient (f.eks. 7,5-15-30 % m/v).
- La musklene ligge over natten i den høyeste sukroseløsningen.
- Bygg inn prøvene i Tissue Tek OCT, plasser dem i prechilled isopentan til OCT blir fast (unngå fullstendig nedsenking av prøvene), frys dem i flytende nitrogen i minst 2 minutter og plasser dem umiddelbart ved -80 °C for lagring.
- Behandle prøvene med en kryostat for å oppnå 7 μm tykke seksjoner som beskrevet ovenfor.
- Flekk seksjonene med hematoksylin og eosin eller Massons trichrome i henhold til standardprodusentens protokoller.
Hematoksylin og eosinfarging muliggjør beregning av kjennetegn for regenerering av muskler, for eksempel: a) antall myofibers; b) tverrsnittsområde; c) antall myofibers som inneholder en sentral kjerne. Massons trichrome brukes til å beregne den fibrotiske indeksen, gjort ved å trekke det totale arealet okkupert av skjelettmyofibers fra det totale området av bildet: det resulterende området gjenspeiler hovedsakelig muskelens bindende og fete infiltrat. Alle analysene på bildene kunne utføres ved hjelp av ImageJ-programvare (NIH) med måleverktøyet og celleteller-plugin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rapporterte representative resultatene følger hovedanalysene for in vitro/in vivo som er avbildet i arbeidsflyten i figur 1. 48 timer etter administrering av 4OH-tamoxifen MyoD-positive kjerner kan identifiseres i MyoD-ER-transinduserte IDEMer i kultur (figur 2A). Cellene smelter deretter sammen og differensieres i multinukleerte myotuber (Figur 2B). Når transplantert intramuskulært inn i en murin modell av akutt muskelskade, IDEMs bidra til vev regenerering (Figur 3). Effekten av IDEM-er i en gen- og celleterapiinnstilling for murinmodeller av muskeldystrofi ble vurdert av tredemøllens treningstoleransetest: Figur 4 viser resultatene oppnådd etter transplantasjon av villtype MIDEMer til Sgca-null/scid/beige mus, som viser en ameliorasjon av motorkapasiteten hos behandlede mus7. Ex vivo-analyser av transplanterte muskler viser GFP-positive områder som representerer omfanget av kolonisering av IDEM-er i vertsvevet (figur 5A-C), og viser dermed at donorceller engraft i dystrofisk muskel. Viktigst, transplanterte celler er i stand til å skille in vivo, danner nye skjelett myofibers. Faktisk viser figur 5 Sgca-uttrykk fra genetisk korrigerte HIDEM-er til Sgca-null/scid/beige mus ( Figur5D og 5E). Strukturell ameliorasjon i arkitekturen av transplanterte muskler kan vurderes gjennom Massons trichrome farging: Figur 5F viser en nedgang i mengden fibrotisk vev i behandlet muskel.
Figur 1. Protokollflytskjema. Ordningen gir en oversikt over den IDEM-baserte strategien, fra foreløpige in vitro differensieringsanalyser (venstre) til de ulike trinnene som er nødvendige for å vurdere engraftment, myogent potensial og funksjonell ameliorasjon in vivo og ex vivo (høyre). Mørkegrå bokser inneholder de forskjellige trinnene som er beskrevet i protokollen; lysegrå bokser inneholder deler av metoden som ikke er beskrevet i denne artikkelen. Klikk her for å vise større figur.
Figur 2. Vurdering av myogen potensiell in vitro. (A) Immunfluorescence viser kjernefysisk MyoD-uttrykk i 4 av 7 MyoD-ER transduced MIDEM kjerner etter 48 timers eksponering for 4OH-tamoxifen. (B) Immunfluorescence farging for myosin tung kjede (MyHC) på 4OH-tamoxifen-indusert HIDEM-avledede myotuber etter en uke i differensieringsmedium (Skala bar, 200 μm). Klikk her for å vise større figur.
Figur 3. In vivo vurdering av celle engraftment i en modell av akutt muskelregenerering. (A) Stereomikroskopiske GFP-fluorescensbilder av nyisolerte kardiotoksin-skadde tibialis fremre muskler eksplantet 2 uker etter intramuskulær injeksjon av 106 GFP-HIDEMs (venstre) og GFP-MIDEMs (midten). Skalastang, 2 mm. (B) Lav (topp) og høy (bunn) forstørrelse bilder av muskelen transplantert med MIDEMs vist i (A) viser GFP-positive myofibers. Skalastang, 200 μm. Klikk her for å vise større figur.
Figur 4. Tredemølle treningstoleranse test. Representativ tredemølletest for transplantert (IM = intramuskulær; IA = intraarteriell). Sgca-null/scid/ beige mus (106 celle/injeksjon) versus ikke-transplantede dystrofiske og ikke-trofiske kontrollimmunodeficientmus. Plottet viser funksjonell ameliorasjon av dystrofiske mus transplantert med MIDEMs (12-22% mer enn ikke-kartlagte dyr 35 dager etter transplantasjon). Data vises som gjennomsnittlig motorkapasitet i forhold til baseline-ytelser (det vil si 100% representerer baseline-ytelsen til hver gruppe og bare behandlede mus forbedrer den betydelig ved gjentatte målinger). *P < 0,05; **P < 0,005, enveis ANOVA. Fra tidligere publisert arbeid av forfatterne7. Klikk her for å vise større figur.
Figur 5. In vivo vurdering av engraftment og myogent potensial i musemodeller av muskeldystrofi. (A) Stereomikroskopiske GFP-fluorescensbilder av nyisolerte tibialis fremre muskler av Sgca-null/scid/beige mus eksplantet 3-4 uker etter intramuskulær injeksjon av 106 humane (HIDEMs, venstre; transplantasjon hos juvenile mus) og murine (MIDEMs; høyre) GFP-IDEMs. Skala bar, 2 mm. (B) Stereomikroskopisk GFP fluorescens bilde av en nyisolert gastrocnemius muskel utfelt 3 uker etter intra-arteriell injeksjon av 106 GFP-MIDEMs. Skalastang, 1 mm. (C) Fersk frossen tverrsnitt av muskelen transplantert med MIDEMer vist i (A) som viser en klynge av GFP-positive myofibers. Skalastang, 200 μm. (D) Immunfluorescence farging på deler av intramuskululært transplanterte muskler (som i A) som viser klynger av genetisk korrigerte fibre, stammer fra podede IDEMer. Skalastang, 150 μm. (E) Kvantifisering av α-sartoglykan (Sgca)-positive myofibers en måned etter intramuskulær transplantasjon av genetisk korrigerte IDEMer til Sgca-null/scid/beige mus. (F) Masson trichrome farging av tibialis fremre muskler fra transplantert og kontroll Sgca-null/scid/beige mus (rød: muskelfibre; blå: fibrose) fremhever reduksjonen av fibrotisk infiltrat i behandlet muskel. Skalastang, 200 μm. Klikk her for å vise større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCer kan utvides på ubestemt tid samtidig som de beholder sitt selvfornyelsespotensial og dermed blir bedt om å skille seg ut i et bredt spekter av celleavstamninger12. Av denne og andre grunner iPSC-avledede stamceller anses stamceller som en lovende kilde for autologe gen- og celleterapitilnærminger13. Et tidligere publisert arbeid fra forfatterne rapporterte genereringen av mus og menneskelige myogene forfedre fra iPSCer med en fenotype som ligner på pericyte-avledede MAB-er (IDEMer) og deres effektive bidrag til muskelregenerering i en musemodell av muskeldystrofi7.
En forutsetning for å maksimere IDEM myogent potensial er uttrykket av den myogene faktoren MyoD i cellene. Transduksjonen med en tamoxifen-induserbar MyoD-ER-kassett gjorde det mulig å ha en presis temporal kontroll over uttrykket med fordelen av å synkronisere aktiveringen i hele kulturen og deretter in vivo. En transplantasjonsstrategi basert på en enkelt administrering av celler per muskel (eller per lårarterie) er beskrevet i denne artikkelen. Imidlertid har gjentatte celleinjeksjoner vist seg å være effektive i å øke MAB-engraftment i forskjellige celleterapiprotokoller8. Derfor, i tilfelle suboptimale resultater med IDEMs, er det verdt å utføre gjentatte transplantasjoner for å øke celledoseringen og dermed bidra til å være vert for muskler.
Utfallsmålinger tillater evaluering av bidrag av donorceller i funksjonell ameliorasjon av fenotypen til behandlede dyr. I tillegg til treningstoleranse/utholdenhetstest utført med tredemøllen, kan ytterligere tester for å analysere frivillig motorkapasitet(f.eks. freewheel test), fiberskjørhet(f.eks Evans blå fargestoffopptaksanalyse) og spesifikk kraft(f.eks. enkeltfibre eller hele muskelmekanikk) betraktes som8. Ytterligere metoder for å teste funksjonell fenotype amelioration er tilgjengelige som standard driftsprosedyrer på Treat-NMD-nettstedet (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
For å samle inn betydelig informasjon fra de transplanterte dyrene, må den funksjonelle ameliorasjonen følges og valideres av immunhiistokjemiske og histologiske analyser, for å evaluere celleomforming og vevsarkitektur/ombygging. Spesielt er det viktig å evaluere den morfometriske strukturen til de podede musklene for kjennetegn på regenerering og fibrose, for eksempel å vurdere antall fibre med en sentral kjerne, myofibers tverrsnittsområde og den fibrotiske indeksen. De sistnevnte analysene, sammen med de funksjonelle resultatene, gir en uttømmende oversikt over strategiens effektivitet. Videre er overvåking av avstamning vedtatt av transplanterte celler når det gjelder bidrag til vevet(dvs. myofibers) og vedlikehold av stamcellerommet viktig for den langsiktige effekten av alle celleterapistrategier. I dette tilfellet har det allerede blitt rapportert det donor-avledede bidraget in vivo til pericyte-rommet som mesoangioblaster eravledet 7fra; I tillegg indikerer foreløpige resultater funksjonelle bidrag fra IDEM-er også til satellittcelleutvalget (Gerli og Tedesco, upubliserte resultater). Molekylære analyser for å demonstrere engraftment og uttrykk for det korrigerte genet (dvs. kvantitativ PCR og vestlig blot) er også kritiske, men er utenfor dette papirets omfang og vil kreve en dedikert artikkel.
Selv om denne protokollen hovedsakelig er utviklet ved hjelp av Sgca-null / scid / beige mus7 (en nylig publisert immunodeficient modell av LGMD2D), forventes det at den lett kan brukes på andre modeller av muskelsykdom. Når det gjelder Sgca-null / scid / beige, mus brukte vi ikke kardiotoksin, siden musklene til disse dyrene er alvorlig kompromittert og kronisk utsatt for degenerasjon og regenereringssykluser (dermed er det ikke nødvendig med en ekstra skade fra kardiotoksin). Vi kunne imidlertid ikke utelukke at en forbehandling med kardiotoksin kunne lette engraftment i mildere modeller av muskeldystrofi (f.eks. mdxmus). Ameliorasjoner av vår strategi kan omfatte metoder for å forbedre immunsvikten til museverten (som i dagens modeller fortsatt er suboptimal) og effekten av donorcelle engraftment, spesielt ved intraarteriell levering av xenogene celler. Selv om multippel celletransplantasjon og bruk av juvenile mus bidrar til økningen i celle engraftment7,8, musen adhesjon molekyler møtt av menneskelige celler under ekstravasasjon og / eller migrasjon kan utgjøre ytterligere hindringer for den begrensede immunodeficiency av dagens modeller. Fremtidige retninger for oversettelsen av denne gen- og celleterapitilnærmingen i en klinisk setting kan omfatte farmakologiske strategier for å forbedre celleoverslettelse og bruk av ikke-integrating vektorer(f.eks. plasmider, mRNAer, menneskelige kunstige kromosomer eller ikke-integrating virale vektorer) for å omprogrammere og genetisk korrigere cellene, og dermed unngå risikoen for innsetting av innsettingsmutagenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. har levert en internasjonal patentsøknad (nr. PCT/GB2013/050112) inkludert en del av strategien som er beskrevet i denne artikkelen. Han fikk støtte av Promimetic og DWC ltd. for sin forskning.
Acknowledgments
Forfatterne takker Giulio Cossu, Martina Ragazzi og hele laboratoriet for nyttig diskusjon og støtte, og Jeff Chamberlain for vennlig å gi MyoD-ER vektor. Alle forsøkene som involverte levende dyr ble fullført i samsvar med og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle etater, forskrifter og retningslinjer. Arbeidet i forfatterlaboratoriet støttes av UK Medical Research Council, European Community 7th Framework-prosjekter Optistem og Biodesign og det italienske Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
