Summary
Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.
Abstract
Patienten-abgeleitete iPSCs könnten eine unschätzbare Quelle von Zellen für zukünftige autologe Zelltherapieprotokolle sein. iPSC-abgeleitete myogene Stamm-/Vorläuferzellen, ähnlich wie pericyt-abgeleitete Mesoangioblasten (iPSC-abgeleitete Mesoangioblast-ähnliche Stamm-/Vorläuferzellen: IDEMs) können aus iPSCs hergestellt werden, die von Patienten generiert werden, die von verschiedenen Formen der Muskeldystrophie betroffen sind. Patientenspezifische IDEMs können mit unterschiedlichen Strategien(z.B. lentivirale Vektoren, menschliche künstliche Chromosomen) genetisch korrigiert und in ihrem myogenen Differenzierungspotenzial bei Überexpression des Myogenese-Reglers MyoD verbessert werden. Dieses myogene Potenzial wird dann in vitro mit spezifischen Differenzierungstests bewertet und durch Immunfluoreszenz analysiert. Das regenerative Potenzial von IDEMs wird in vivo,bei intramuskulärer und intraarterieller Transplantation in zwei repräsentativen Mausmodellen mit akuter und chronischer Muskelregeneration weiter evaluiert. Der Beitrag von IDEMs zum Wirtsskelettmuskel wird dann durch verschiedene Funktionstests an transplantierten Mäusen bestätigt. Insbesondere wird die Verbesserung der Motorkapazität der Tiere mit Laufbandtests untersucht. Die Zelltransplantation und -differenzierung wird dann durch eine Reihe von histologischen und immunfluoreszenz-Assays auf transplantierte Muskeln bewertet. Insgesamt beschreibt dieses Papier die Assays und Werkzeuge, die derzeit zur Bewertung der Differenzierungsfähigkeit von IDEMs eingesetzt werden, wobei der Schwerpunkt auf den Transplantationsmethoden und anschließenden Ergebnismaßnahmen zur Analyse der Wirksamkeit von Zelltransplantationen liegt.
Introduction
Mesoangioblasten (MABs) sind gefäßassoziierte Muskelvorläufer, die aus einer Teilmenge von Pericyten1-3abgeleitet sind. Der Hauptvorteil von MABs gegenüber kanonischen Muskelvorläufern wie Satellitenzellen4 liegt in ihrer Fähigkeit, die Gefäßwand zu überqueren, wenn sie intraarteriell geliefert werden, und trägt somit zur Skelettmuskelregeneration in Zelltherapieprotokollen bei. Diese Funktion wurde sowohl in murinen als auch in Canine Modellen der Muskeldystrophie1,5,6bewertet und bestätigt. Diese präklinischen Studien haben die Grundlagen für eine klinische Erstphase-I/II-Studie auf der Grundlage einer intraarteriellen Transplantation von Spender-HLA-identischen MABs bei Kindern mit Duchenne-Muskeldystrophie (EudraCT-Nr. 2011-000176-33; derzeit im San Raffaele Hospital in Mailand, Italien) aufgebaut. Eine der Haupthürden der Zelltherapie-Ansätze, bei denen Milliarden von Zellen benötigt werden, um den Muskel eines ganzen Körpers zu behandeln, ist das begrenzte proliferative Potenzial des "Arzneimittels" (die Zellen). Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass es nicht möglich ist, MABs von Patienten zu erhalten, die von einigen Formen von Muskeldystrophien betroffen sind, da es bei Muskeldystrophie 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde vor kurzem ein Protokoll zur Ableitung von MAB-ähnlichen Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen und murinen iPSCs eingerichtet7. Dieses Verfahren erzeugt leicht erweiterbare Zellpopulationen mit einer vaskulären Gensignatur und einem Immunphenotyp, der erwachsenen, von Muskel-abgeleiteten MABs sehr ähnlich ist. Nach Expression des myogenen Regulatorischen Faktors MyoD werden sowohl murine als auch menschliche IDEMs (bzw. MIDEMs und HIDEMs) terminaler Skelettmuskeldifferenzierung unterzogen. Um dieses Ziel zu erreichen, können IDEMs mit Vektoren transduziert werden, die myoD-Expression antreiben können, entweder konstitutiv oder in duetzbarer Weise8-10. Es wird ein lentiviraler Vektor verwendet, der MyoD cDNA enthält, der mit dem Östrogenrezeptor (MyoD-ER) verschmolzen ist, wodurch seine kernnukleare Translokation auf Tamoxifen (ein Östrogen-Analog-)Verabreichungermöglicht wird 11. Diese Strategie führt zur Bildung von hypertrophen mehrkernigen Myotuben mit hoher Effizienz7. Insbesondere IDEMs sind nichttumorigen, können bei der Transplantation die Wirtsmuskulatur ein- und differenzieren und können mit verschiedenen Vektoren(z. B. Lentiviren oder menschlichen künstlichen Chromosomen) genetisch korrigiert werden, was den Weg für zukünftige autologe therapeutische Strategien ebnet. Die Ableitung, Charakterisierung und Transplantation von IDEMs wurde in der obigen Publikation7beschrieben. Dieses Protokollpapier beschreibt die Assays, die durchgeführt wurden, um die in vitro myogene Differenzierung von IDEMs und die anschließenden Ergebnismessungen zu bewerten, um die Wirksamkeit ihrer Transplantation in Mausmodellen der Muskelregeneration zu testen.
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Protocol
1. Bewertung des myogenen und Engraftment-Potenzials
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In vitro: MyoD-induzierte Differenzierung
- Generieren Sie eine stabile Zelllinie von IDEMs, die mit dem tamoxifen-induzierbaren MyoD-ER lentiviralen Vektor transduziert werden und die Vielzahl der Infektionen titifizieren (MOI; z. B. 1, 5 und 50) unter Verwendung der in 1.1.9 (MyHC) beschriebenen Färbung als Ergebnis der Effizienz des Verfahrens.
- Eine 3,5 cm große Schale mit 1 ml 1% Matrigel beschichten und 30 min bei 37 °C bebrüten.
- Waschen Sie den Teller zweimal mit Medium, Samen 1 x 105 MyoD-ER transduzierte IDEMs in der 3,5 cm Gewebekulturschale und inkubieren bei 37 °C in Wachstumsmedium.
- Erwarten Sie, dass Zellen in ein oder zwei Tagen den Zusammenfluss erreichen, und fügen Sie dann 1 M 4OH-Tamoxifen in das Wachstumsmedium(1. Dosis) ein.
- Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Wachstumsmedium durch differenzierungsmittel, ergänzt durch 1 M 4OH-Tamoxifen(2. und letzte Dosis).
- Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag durch ein frisches Differenzierungsmedium.
- Untersuchen Sie täglich die Kulturen auf Myotube-Bildung.
- Nach einer Woche (5 Tage im Differenzierungsmedium) die Platten vorsichtig mit PBS waschen und mit 4 % Paraformaldehyd für 5 min bei RT fixieren.
- Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen Myosin-schwere Kette (MyHC) durch, um das Vorhandensein von Myotuben zu bestätigen. Gegenfleck mit einem Kernfarbstoff(z.B. Hoechst).
Die Effizienz der Differenzierung wird als Prozentsatz der Kerne in MyHC-positiven Zellen bewertet: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Effizienz >50% beträgt.
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In vivo: Engraftment in ein Modell der akuten Muskelregeneration
Um den In-vivo-Beitrag von MyoD-ER IDEMs zur Muskelregeneration zu bewerten, sind die Zellen zuvor mit einer Vektorkodierung für das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) gekennzeichnet, die es ermöglicht, sie im Gewebe zu verfolgen. MyoD-ER GFP IDEMs werden dann in erwachsene murinische Muskeln injiziert, die zuvor mit einem Myotoxin(z.B. Kardiotoxin) verletzt wurden. Um eine Immunabstoßung gegen xenogene (z. B. HIDEMs) oder genetisch manipulierte/korrigierte Zellen zu vermeiden, ist es erforderlich, entweder immundefizienten oder immunsuppressiven Mäusen zu verwenden.- Die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von 3,5 l/g 10 mg/ml Tamoxifen (lipolösliche Form) 24 Stunden vor der Transplantation und Pretreat-Zellen, die 1 M 4OH-Tamoxifen (wässrige Form) in das Wachstumsmedium über Nacht vor dem Transplantationstag hinzufügen, zurücknehmen.
- Verabreichen Sie der Maus Anästhesie und Analgesie gemäß den spezifischen Richtlinien, die chirurgische Eingriffe in der Tiereinrichtung regeln.
- Injizieren Sie 25 l von 100 m Kardiotoxin (CTX; von Naja mossambica mossambica; VORSICHT: potenziell schädliche Substanz) in den tibialis anterioren (TA) Muskeln.
- 24 Stunden nach der Behandlung der Tiere mit Tamoxifen und CTX, lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung und Zählen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 232 x g für 5 min.
- Waschen Sie das Zellpellet in Ca2+- und Mg2+- frei PBS, Zentrifuge und dann sanft das Zellpellet in Ca2+- und Mg2+-frei PBS auf eine Endkonzentration von 106 Zellen/30 l, die das endgültige Volumen jeder Injektion sein wird.
- Injizieren Sie 30 l Zellsuspension in die zuvor verletzten Muskeln mit einer Spritze mit 29 oder 30 G Nadel. Achten Sie besonders darauf, während Sie die Nadel aus dem Muskel entfernen. Tun Sie es langsam, um zu vermeiden, dass die Zellsuspension durch die Spur der Nadel verschüttet wird. Transplantieren Sie die kontralaterale TA nicht und verwenden Sie sie nicht als Kontrolle, indem Sie 30 l Ca2+- und Mg2+-freie PBS injizieren, um die Bedingungen des transplantierten ZU replizieren.
- Behandeln Sie die Tiere sechs weitere Tage mit Tamoxifen und verabreichen Sie analgesie(z.B. Carprofen) für zwei weitere Tage.
- Expflanzen Sie die Muskeln ab 14 Tagen nach der Transplantation. Verarbeiten und analysieren Sie die Proben gemäß den Protokollen 4 und 5.
2. Transplantation bei Mausmodellen der Muskeldystrophie
Dieser Transplantationstest ermöglicht die Bewertung des Ausmaßes der Transplantation von IDEMs in Mausmodellen der Muskeldystrophie. Die Tiere, die wie folgt behandelt werden, können auch auf funktionelle Verbesserung des Krankheitsphänotyps untersucht werden. Funktionelle Tests können ab zwei Wochen nach der Transplantation durchgeführt werden. Um die Engraftment zu verbessern, sollten Sie die Durchführung von VortransplantationLaufbandübungen (wie in Protokoll 3 beschrieben) und/oder serielleZellinjektionen alle drei Wochen für 3x(d. h. für insgesamt 3 Injektionen/Muskel) in Betracht ziehen.
- Intramuskuläre Transplantation
- Die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von 3,5 l/g 10 mg/ml Tamoxifen (lipolösliche Formulierung) 24 Stunden vor der Transplantation und Pretreat-Zellen, die 1 M 4OH-Tamoxifen (wässrige Formulierung) in das Wachstumsmedium über Nacht vor dem Transplantationstag hinzufügen, zurücknehmen.
- Lösen Sie die Zellen bei 232 x g für 5 min durch Trypsinisierung, zählen und zentrifugieren.
- Waschen Sie das Zellpellet in Ca2+- und Mg2+-frei PBS, Zentrifuge und setzen Sie dann das Pellet in Ca2+- und Mg2+-frei PBS auf eine Konzentration von 106 Zellen/30 l aus.
- Analgesie verabreichen und die Haut des Tieres (optional) mit einem Povidon-Jod- oder Chlorexidin-desin-basierten Desinfektionsmittel desinfizieren. Dies wird auch helfen, die Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GC) und Quadriceps femoris (QC; speziell die vastus intermedius) Muskeln zu lokalisieren.
- Injizieren Sie 30 l Zellsuspension in die Muskeln mit einer Spritze mit 29 oder 30 G Nadel. Legen Sie für die TA 5 mm der Nadel 2 mm unter die Einfügung der proximalen Sehne (Kraniokaalrichtung) mit einer Neigung von 15° relativ zur Tibia ein und injizieren Sie langsam die Zellsuspension beim Einziehen der Nadel (leeren Sie die Spritze mit 2 mm der Nadel noch im Muskel). Für die GC und QC, wiederholen Sie das gleiche Verfahren wie für die TA detailliert, mit dem Hauptunterschied ist die kaudokranielle Insertion der Nadel 2 mm über der myotendinösen Kreuzung der Achillessehne für die GC und 2 mm über der distalen Sehne für die QC (15° Neigung in Bezug auf den Oberschenkelknochen). Achten Sie beim Entfernen der Nadel aus dem Muskel, um zu vermeiden, dass die Zellsuspension durch die Nadelspur verschüttet wird.
TROUBLESHOOTING: Bei geringer Engraftment erwägen, juvenile (1-2 Wochen alt) Mäuse7 mit 3 x 105 Zellen/10 l zu injizieren (beachten Sie, dass in diesem Fall Tamoxifen subkutan verabreicht werden muss).
- Intraarterientransplantation
Dieser Teil des Protokolls ermöglicht die Bewertung der Fähigkeit von MIDEMs und HIDEMs, in der arteriellen Zirkulation geliefert zu werden, die Gefäßwand zu überqueren und zur Regeneration der Skelettmuskulatur in den Muskeln flussabwärts zur Injektionsstelle beizutragen.- Pretreat Tiere und Zellen wie oben in Schritt 2.1.1 beschrieben.
- Lösen Sie sich durch Trypsinisierung und Filter mit einem 40 m Zellsieb (um Cluster aus der Zellsuspension zu entfernen, falls die nächtliche Exposition gegenüber Tamoxifen die Fusion und Bildung von Myoröhren aus benachbarten Zellen antreiben könnte) die Zellen bei 232 x g für 5 min zählen und zentrifugieren
- Waschen Sie das Zellpellet in Ca2+- und Mg2+-frei PBS, Zentrifuge und setzen Sie dann das Pellet in Ca2+- und Mg2+-frei PBS mit 0.2 International
Einheiten von Natriumheparin (optional) bis zu einer endgültigen Zellkonzentration von 106 Zellen/50 l. Fügen Sie 10% Patent blauer Farbstoff (Endkonzentration: 1,25 mg/ml in normaler Saline oder Ca2+- und Mg2+-frei PBS) in die Lösung, um die Verteilung der Zellsuspension zu visualisieren. - Verabreichen Sie der Maus anästhesie und analgesie gemäß den Richtlinien, die chirurgische Eingriffe in der jeweiligen institutionellen Tiereinrichtung regeln.
- Rasieren Sie die Leistenregion (auch bekannt als Femoral oder Scarpas Dreieck) und desinfizieren Sie die Haut mit einem Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-basierten Desinfektionsmittel.
- Machen Sie einen 5-7 mm Schnitt und lokalisieren Sie das Oberschenkelbündel: Vene, Arterie und Nerven (der Nerv liegt seitlich auf der Arterie und die Vene medial).
- Entfernen Sie vorsichtig die Bindefaszien, die das Bündel mit Zangen bedeckt.
- Trennen Sie die Femoralvene und den Nerv von der Arterie, indem Sie sanft die Spitze einer Zange (oder einer 30 G Nadel) dazwischen einführen und das Loch schrittweise vergrößern.
TROUBLESHOOTING: Die femorale Vene ist zerbrechlich: Achten Sie darauf, sie während ihrer Ablösung von der Oberschenkelarterie nicht mit der Zange zu kneifen. Im Falle einer Blutung, abtropfen lassen Sie das Blut mit steriler Gaze und verwenden Sie einen Mikro-Kauteris, um Hämostase zu erleichtern. - Heben Sie die Arterie mit einer Spitze der Zange an und klemmen Sie die Arterie mit der anderen Spitze.
- Punktieren Sie die Arterie mit einer Spritze, die mit einer 30 G Nadel ausgestattet ist. Injizieren Sie 50 l Zellsuspension nach dem gespannten Bereich mit einer Infusionsgeschwindigkeit von ca. 5 l/sek.
TROUBLESHOOTING: Setzen Sie die Zellen in der Spritze vor der Injektion vorsichtig wieder auf: Es ist wichtig, die Ausfällung von Zellen und die Bildung von Luftblasen in der Spritze zu vermeiden. Der Durchmesser der Oberschenkelarterie ist etwas kleiner als eine 30 G Nadel: Achten Sie darauf, die Arterie nicht beim Einsetzen der Nadel zu fällen. Patent blauer Farbstoff ermöglicht die Erkennung der Wirksamkeit der Injektion: wenn richtig injiziert, wird die gesamte Gliedmaße schnell hellblau. - Entfernen Sie langsam die Nadel und die Zange aus der Arterie, um den Blutkreislauf in der Gliedmaße wiederherzustellen.
- Setzen Sie Druck mit steriler Gaze auf, um Blutungen zu vermeiden und/oder nach Bedarf zu kauterisieren.
- Die Wunde besonieren und die Tiere bis zur Genesung von der Anästhesie überwachen.
- Analgesie 3 Tage lang verabreichen und die Wunde täglich inspizieren (bei einer Wundinfektion besprechen Sie dies mit dem Personal der Tiereinrichtung und verabreichen Sie bei Bedarf Antibiotika).
3. Ergebnismaßnahmen an transplantierten dystrophischen Tieren: Laufbandtest
Ab zwei Wochen nach der Zelltransplantation ist es möglich, die funktionelle Verbesserung der motorischen Kapazität behandelter Mäuse mit den Laufbandtests zu bewerten. Dieser Test ermöglicht die Bewertung der Trainingstoleranz/Ausdauer behandelter Mäuse. Eine Maus gilt als ermüdet, wenn sie sich für mehr als 5 Sek. im Ruhebereich legt, ohne zu versuchen, das Laufband nach einer Reihe von 3 aufeinanderfolgenden mechanischen Reizen (eine alle 5 Sek.) wieder einzubinden. Die Basismessungen beginnen etwa einen Monat vor der Behandlung und werden verwendet, um die Verbesserung jedes einzelnen getesteten Tieres zu bewerten. Diesem Test können zusätzliche Tests zur Überwachung der Faserfragilität, Der Kraftverbesserung, der Engraftmentierung, der Differenzierung transplantierter Zellen und der morphologischen Verbesserung der transplantierten Muskeln folgen (siehe Diskussion).
- Akklimatisieren Sie die Tiere (in der Regel drei Gruppen: behandelt, unbehandelt und wilde Typ/nicht dystrophische Kontrollen) an die Übung vor der ersten Messung: Stellen Sie das Laufband auf eine Geschwindigkeit von 6 m/min für 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang jeden zweiten Tag für eine Woche.
TROUBLESHOOTING: Zeichnen Sie alle Messungen zur gleichen Tageszeit auf, um Verzerrungen aufgrund der zirkadianen Zyklen zu vermeiden. - Legen Sie die Tiere in das Laufband, das zuvor mit einer Neigung von 10° eingerichtet wurde.
- Schalten Sie das Laufband mit einer Startgeschwindigkeit von 6 m/min ein (sorgen Sie für einen sanften mechanischen Reiz, falls die Tiere nicht bereit sind, die Übung zu beginnen).
- Starten Sie den Timer und erhöhen Sie die Geschwindigkeit 2 m/min alle 2 min.
- Sobald ein Tier mehr als 5 Sek. im Ruhebereich liegt, ohne zu versuchen, das Laufband wieder einzubinden, berühren Sie es vorsichtig mit einem Stock, um den Neustart der Übung zu stimulieren (siehe oben).
- Zeichnen Sie die Leistung (Zeit und Entfernung) jedes Tieres auf.
- Wiederholen Sie die Messungen wöchentlich oder alle 10 Tage für mindestens 3x.
- Wiederholen Sie das gleiche Verfahren nach der Transplantation.
- Analysieren Sie Leistungsdaten, die die Messung jedes Tieres mit der Basisleistung vergleichen. Wir schlagen vor, die Werte in einem Diagramm als Prozentsatz der durchschnittlichen Motorkapazität relativ zum Ausgangswert darzustellen und sie durch einen ein- oder zweiseitigen ANOVA-Test zu analysieren, gefolgt von einem entsprechenden Post-Test, um die Gruppen zu vergleichen.
TROUBLESHOOTING: Mindestens 5 Alters-, Genotyp- und geschlechtsspezifische Tiere/Gruppen verwenden und die Messungen für mindestens das 3-fache nach der Transplantation wiederholen.
4. Bewertung der Zelltransplantation und Differenzierung in transplantierten Muskeln
Transplantierte und Kontrollmuskeln werden zum geeigneten Zeitpunkt geerntet (<2 Tage für die kurzfristige Transplantationsanalyse, 2-3 Wochen für die mittelfristige und >1 Monat für Langzeitanalysen). Wenn die transplantierten Zellen mit GFP gekennzeichnet sind, kann die Engraftmentierung in frisch isolierten Muskeln durch direkte Fluoreszenz unter einem UV-ausgestatteten Stereomikroskop beurteilt werden.
- Legen und orientieren Sie sich entlang der vertikalen Achse frisch isolierte Muskeln in tragachanth Kaugummi (6% w/v)
- Die Proben in vorgekühltem Isopentan für eine Minute dehydrieren, mindestens 2 min in flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort bei -80 °C zur Lagerung aufbewahren.
- Verarbeiten Sie die Proben mit einem Kryostat, um 7 m dicke Abschnitte auf polarisierten Dias zu erhalten. Probieren Sie den Großteil des Muskels auf den Dias und sammeln Sie ca. 8-10 Dias mit 30-40 Abschnitten/Dia. Es ist ratsam, eine Reihe von Abschnitten in eine 1,5 ml-Röhre zu sammeln, um molekularbiologische/biochemische Tests durchzuführen.
- Bewerten Sie die Zellengraftierung mit unterschiedlichen immunfluoreszierenden Färbungen, je nach Versuchsaufbau. Zum Beispiel, im Falle einer HIDEM-Transplantation bei Sgca-null/scid/bg-Mäusen, Fleckenabschnitte mit: a) einem Antikörper gegen Lamin A/C zum Nachweis von transplantierten menschlichen Zellkernen; b) einen Antikörper gegen Laminin, um die Gesamtstruktur des Muskels zu visualisieren; und c) einen Antikörper gegen Sgca, um eine von Spendern abgeleitete Wiederherstellung des Proteins zu erkennen, das bei dem dystrophischen Tier fehlt.
- Quantifizieren Sie mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Anzahl der Spenderkerne pro Muskelabschnitt innerhalb und außerhalb der Muskelfasern und die Anzahl der von Spendern abgeleiteten Skelettmyofiber pro Abschnitt.
5. Muskelhistopathologie
Histopathologische Analysen ermöglichen die Beurteilung der morphologischen Struktur des transplantierten Muskels. Als Ergebnis des Zelltherapieansatzes wird eine architektonische Verbesserung der Gewebestruktur erwartet.
- Fixieren Sie die frisch isolierten Muskeln mit 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde bei 4 °C.
- Dehydrieren Sie die Proben mit einem aufsteigenden Saccharosegradienten(z.B. 7.5-15-30% w/v).
- Lassen Sie die Muskeln über Nacht in der höchsten Saccharoselösung.
- Die Proben in Tissue Tek OCT einbetten, in vorgekühltes Isopentan einbetten, bis das OCT fest wird (vermeidung eines vollständigen Eintauchens der Proben), sie mindestens 2 min in flüssigen Stickstoff einfrieren und sofort bei -80 °C zur Lagerung platzieren.
- Verarbeiten Sie die Proben mit einem Kryostat, um 7 m dicke Abschnitte wie oben beschrieben zu erhalten.
- Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Massons Trichrom nach den Standard-Herstellerprotokollen.
Hämatoxylin und Eosin Färbung ermöglicht die Berechnung von Kennzeichen der regenerierenden Muskeln, wie: a) die Anzahl der Myofiber; b) Querschnittsfläche; c) die Anzahl der Myofiber, die einen zentralen Kern enthalten. Massons Trichrom wird verwendet, um den fibrotischen Index zu berechnen, indem die Gesamtfläche der Skelettmyofiber von der Gesamtfläche des Bildes subtrahiert wird: der resultierende Bereich spiegelt hauptsächlich das Bindemittel und das Fettinfiltrat des Muskels wider. Alle Analysen auf den Bildern konnten mit ImageJ Software (NIH) mit dem Messwerkzeug und dem Zellzähler-Plugin durchgeführt werden.
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Representative Results
Die gemeldeten repräsentativen Ergebnisse folgen den wichtigsten In-vitro/in-vivo-Assays, die im Workflow in Abbildung 1dargestellt sind. 48 Stunden nach 4OH-tamoxifen Verabreichung MyoD-positive Kerne sind innerhalb von MyoD-ER transduced IDEMs in Kultur identifizierbar (Abbildung 2A). Die Zellen verschmelzen dann und differenzieren sich in mehrkernige Myoröhren (Abbildung 2B). Bei der intramuskulären Transplantation in ein murines Modell akuter Muskelverletzungen tragen IDEMs zur Geweberegeneration bei (Abbildung 3). Die Wirksamkeit von IDEMs in einer Gen- und Zelltherapie einstellung für murine Modelle der Muskeldystrophie wurde durch den Laufband-Übungstoleranztest bewertet: Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse, die nach der Transplantation von Wildtyp-MIDEMs in Sgca-null/scid/beige Mäuse erzielt wurden, was eine Verbesserung der motorischen Kapazität bei behandelten Mäusen zeigt7. Ex-vivo-Analysen transplantierter Muskeln zeigen GFP-positive Bereiche, die das Ausmaß der Besiedlung von IDEMs in das Wirtsgewebe darstellen (Abbildungen 5A-C), was zeigt, dass Spenderzellen in dystrophische Muskeln eingraviert werden. Wichtig ist, dass transplantierte Zellen in vivounterscheiden können und neue Skelettmyofiber bilden. Abbildung 5 zeigt die Sgca-Expression von genetisch korrigierten HIDEMs in Sgca-null/scid/beige-Mäuse (Abbildungen 5D und 5E). Strukturelle Verbesserungen in der Architektur transplantierter Muskeln können durch Massons trichrome Färbung beurteilt werden: Abbildung 5F zeigt eine Abnahme der Menge an fibrotischem Gewebe in behandelten Muskeln.
Abbildung 1. Protokollflussdiagramm. Das Schema bietet einen Überblick über die IDEM-basierte Strategie, von vorläufigen In-vitro-Differenzierungstests (links) bis hin zu den verschiedenen Schritten, die zur Bewertung der Transplantation, des myogenen Potenzials und der funktionellen Verbesserung in vivo und ex vivo (rechts) erforderlich sind. Dunkelgraue Felder enthalten die verschiedenen im Protokoll beschriebenen Schritte; hellgraue Felder enthalten Teile der Methode, die in diesem Artikel nicht aufgeführt sind. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Bewertung des myogenen Potenzials in vitro. (A) Immunfluoreszenz, die die kernnukleare MyoD-Expression in 4 von 7 myoD-ER-transduzierten MIDEM-Kernen nach 48 hr Exposition gegenüber 4OH-Tamoxifen zeigt. (B) Immunfluoreszenzfärbung für Myosin-Schwerekette (MyHC) auf 4OH-tamoxifen-induzierten HIDEM-abgeleiteten Myoröhren nach einer Woche im Differenzierungsmedium (Scale bar, 200 m). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. In-vivo-Bewertung der Zellengraftierung in einem Modell der akuten Muskelregeneration. (A) Stereoskopische GFP-Fluoreszenzbilder von frisch isolierten, kardiotoxinverletzten Tibialis-Vordermuskulatur, die 2 Wochen nach intramuskulärer Injektion von 106 GFP-HIDEMs (links) und GFP-MIDEMs (Mitte) explantiert wurden. Skala bar, 2 mm. (B) Niedrige (oben) und hohe (unten) Vergrößerungsbilder des Muskels transplantiert mit MIDEMs gezeigt in (A) zeigt GFP-positive Myofiber. Schuppenstange, 200 m. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Laufband-Übungstoleranztest. Repräsentativer Laufbandtest für transplantierte (IM = intramuskulär; IA = intraarteriell). Sgca-null/scid/ beige Mäuse (106 Zellen/Injektion) im Vergleich zu nicht transplantierten dystrophischen und nichtdystrophen Kontrollimmundefizienten. Die Handlung zeigt eine funktionelle Verbesserung von dystrophischen Mäusen, die mit MIDEMs transplantiert wurden (12-22% mehr als nicht transplantierte Tiere 35 Tage nach der Transplantation). Die Daten werden als durchschnittliche Motorkapazität im Verhältnis zu den Ausgangsleistungen dargestellt(d. h. 100 % stellen die Ausgangsleistung jeder Gruppe dar, und nur behandelte Mäuse verbessern sie bei wiederholten Messungen signifikant). *P < 0,05; **P < 0.005, einweg ANOVA. Aus zuvor veröffentlichten Arbeiten der Autoren7. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. In vivo Bewertung der Engraftment und myogenen Potenzial in Mausmodelle der Muskeldystrophie. (A) Stereoskopische GFP-Fluoreszenzbilder von frisch isolierten tibialis vorderen Muskeln von Sgca-null/scid/beige-Mäusen, die 3-4 Wochen nach intramuskulärer Injektion von 106 Human (HIDEMs, links; Transplantation bei junggebliebenen Mäusen) und Murine (MIDEMs; rechts) GFP-IDEMs explantiert wurden. Scale bar, 2 mm. (B) Stereomikroskopisches GFP-Fluoreszenzbild eines frisch isolierten Gastrocnemius-Muskels, der 3 Wochen nach intraarterieller Injektion von 106 GFP-MIDEMs explantiert wurde. Scale bar, 1 mm. (C) Frischgefrorener Querteil des Muskels transplantiert mit MIDEMs, die in (A) gezeigt werden und einen Cluster von GFP-positiven Myofibianen anzeigen. Schuppenstange, 200 m. (D) Immunfluoreszenzfärbung an Abschnitten intramusulär transplantierter Muskeln (wie in A),die Cluster genetisch korrigierter Fasern zeigen, die aus transplantierten IDEMs stammen. Schuppenstange, 150 m. (E) Quantifizierung von α-Sarkoglycan (Sgca)-positiven Myofibianen einen Monat nach intramuskulärer Transplantation genetisch korrigierter IDEMs in Sgca-null/scid/beige Mäuse. (F) Masson trichrome Färbung der tibialis vorderen Muskeln von transplantierten und kontrollieren Sgca-null/scid/beige Mäuse (rot: Muskelfasern; blau: Fibrose), die die Verringerung der fibrotischen Infiltrat in behandelten Muskeln. Schuppenstange, 200 m. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
iPSCs können auf unbestimmte Zeit erweitert werden, wobei ihr Selbsterneuerungspotenzial erhalten bleibt und so in eine breite Palette von Zelllinien12differenziert werden. Aus diesem und anderen Gründen gelten iPSC-abgeleitete Stamm-/Vorläuferzellen als vielversprechende Quelle für autologe Gen- und Zelltherapieansätze13. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit der Autoren berichtete über die Erzeugung von Maus- und humanen myogenen Vorläufern aus iPSCs mit einem Phänotyp, der dem von Pericyt-abgeleiteten MABs (IDEMs) ähnelt, und deren effizienter Beitrag zur Muskelregeneration in einem Mausmodell der Muskeldystrophie7.
Eine Voraussetzung, um das myogene IDEM-Potenzial zu maximieren, ist die Expression des myogenen Faktors MyoD in den Zellen. Die Transduktion mit einer tamoxifen-induzierbaren MyoD-ER-Kassette ermöglichte eine präzise zeitliche Kontrolle über ihren Ausdruck mit dem Vorteil, dass ihre Aktivierung in der gesamten Kultur und anschließend in vivosynchronisiert werden konnte. Eine Transplantationsstrategie, die auf einer einzigen Verabreichung von Zellen pro Muskel (oder pro Femoralarterie) basiert, wurde in diesem Artikel beschrieben. Jedoch, wiederholte Zellinjektionen haben sich bei der Erhöhung der MAB-Engraftment in verschiedenen Zelltherapieprotokollen8als wirksam erwiesen. Daher lohnt es sich bei suboptimalen Ergebnissen mit IDEMs, wiederholte Transplantationen durchzuführen, um die Zelldosis zu erhöhen und damit einen Beitrag zum Wirtsmuskel zu leisten.
Ergebnismessungen ermöglichen die Bewertung des Beitrags von Spenderzellen zur funktionellen Verbesserung des Phänotyps behandelter Tiere. Neben dem mit dem Laufband durchgeführten Übungstoleranz-/Ausdauertest können weitere Tests zur Analyse der freiwilligen Motorleistung(z.B. Freilauftest), Faserfragilität(z.B. Evans Blue Dye Uptake Assay) und spezifischer Kraft(z.B. Einzelfasern oder ganze Muskelmechanik) als8betrachtet werden. Zusätzliche Methoden zur Prüfung der funktionellen Phänotyp-Verbesserung sind als Standard-Betriebsverfahren auf der Treat-NMD-Website (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/ )verfügbar.
Um signifikante Informationen von den transplantierten Tieren zu sammeln, muss die funktionelle Verbesserung durch immunhistochemische und histologische Analysen befolgt und validiert werden, um die Zellengraftierung und Gewebearchitektur/-umgestaltung zu bewerten. Insbesondere ist es wichtig, die morphometrische Struktur der transplantierten Muskeln auf Merkmale der Regeneration und Fibrose zu bewerten, wie z. B. die Beurteilung der Anzahl der Fasern mit einem zentralen Kern, des Myofiberquerschnittsbereichs und des Fibrotikerindex. Die letztgenannten Analysen geben zusammen mit den funktionalen Ergebnissen einen umfassenden Überblick über die Wirksamkeit der Strategie. Darüber hinaus ist die Überwachung der Von transplantierten Zellen angenommenen Abstammung in Bezug auf den Beitrag zum Gewebe(d.h. Myofiber) und die Aufrechterhaltung des Stammzellfachs wichtig für die langfristige Wirksamkeit aller Zelltherapiestrategien. In diesem Fall wurde bereits über den von den Spendern abgeleiteten Beitrag in vivo zum Pericytfach berichtet, aus dem Mesoangioblasten abgeleitet sind7; Darüber hinaus deuten vorläufige Ergebnisse auf einen funktionalen Beitrag von IDEMs auch zum Satellitenzellpool hin (Gerli und Tedesco, unveröffentlichte Ergebnisse). Molekulare Analysen zum Nachweis der Engraftment und Expression des korrigierten Gens(d. h. quantitative PCR und Western Blot) sind ebenfalls kritisch, liegen aber außerhalb des Rahmens dieses Papiers und würden einen speziellen Artikel erfordern.
Obwohl dieses Protokoll hauptsächlich unter Verwendung von Sgca-null/scid/beigeMäuse7 (ein kürzlich veröffentlichtes immundefizizidass Modell von LGMD2D) entwickelt wurde, wird erwartet, dass es leicht auf andere Modelle von Muskelerkrankungen anwendbar sein könnte. Im Falle von Sgca-null/scid/beige, Mäusen, die wir nicht verwenden, verwenden wir kein Kardiotoxin, da die Muskeln dieser Tiere stark beeinträchtigt sind und chronisch Degeneration und Regenerationszyklen ausgesetzt sind (daher ist eine zusätzliche Schädigung durch Kardiotoxin nicht erforderlich). Wir konnten jedoch nicht ausschließen, dass eine Vorbehandlung mit Kardiotoxin die Enpgraftmentierung in milderen Modellen der Muskeldystrophie(z. B. Mdx-Mäuse) erleichtern könnte. Zu den Verbesserungen unserer Strategie können Methoden zur Verbesserung der Immunschwäche des Mauswirts (die in den aktuellen Modellen noch suboptimal ist) und die Wirksamkeit der Spenderzellengraftierung, insbesondere bei intraarterieller Abgabe von xenogenen Zellen, umfassen. Obwohl die Mehrfachzelltransplantation und die Verwendung von jugendlichen Mäusen zur Zunahme der Zellentransplantation7,8beitragen, könnten die Mausadhäsionsmoleküle, die menschlichen Zellen während der Extravasation und/oder Migration begegnen, zusätzliche Hürden für die begrenzte Immunschwäche der aktuellen Modelle darstellen. Zukünftige Richtungen für die Übersetzung dieses Gen- und Zelltherapieansatzes in einem klinischen Umfeld können pharmakologische Strategien zur Verbesserung der Zellextravasation und die Verwendung nicht inintegrierender Vektoren(z. B. Plasmide, mRNAs, menschliche künstliche Chromosomen oder nicht integrierende virale Vektoren) zur Neuprogrammierung und genetischen Korrektur der Zellen umfassen, wodurch das Risiko einer Insertion von Mutagenese vermieden wird.
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Disclosures
F.S.T. hat eine internationale Patentanmeldung eingereicht (Nr. PCT/GB2013/050112) einschließlich eines Teils der in diesem Artikel beschriebenen Strategie. Er erhielt finanzielle Unterstützung von Promimetic und DWC ltd. für seine Forschung.
Acknowledgments
Die Autoren danken Giulio Cossu, Martina Ragazzi und dem gesamten Labor für die hilfreiche Diskussion und Unterstützung und Jeff Chamberlain für die freundliche Bereitstellung von MyoD-ER-Vektoren. Alle Versuche mit lebenden Tieren wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Behörden, Vorschriften und Richtlinien abgeschlossen. Die Arbeit im Autorenlabor wird vom UK Medical Research Council, den 7. Rahmenprogrammen der Europäischen Gemeinschaft Optistem und Biodesign und dem italienischen Duchenne-Elternprojekt unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
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