Summary
Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.
Abstract
IPSCs derivados do paciente podem ser uma fonte inestimável de células para futuros protocolos de terapia celular autóloga. Células progenitoras miogênicas/progenitoras derivadas do iPSC semelhantes aos mesoangioblasts derivados de pericílito (células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC: IDEMs) podem ser estabelecidas a partir de iPSCs gerados a partir de pacientes afetados por diferentes formas de distrofia muscular. Os IDEMs específicos do paciente podem ser geneticamente corrigidos com diferentes estratégias (por exemplo, vetores lentivirais, cromossomos artificiais humanos) e aprimorados em seu potencial de diferenciação miogênica após a superexpressão do myogenesis regulator MyoD. Esse potencial miogênico é então avaliado in vitro com ensaios de diferenciação específicos e analisado por imunofluorescência. O potencial regenerativo dos IDEMs é ainda avaliado in vivo, notransplante intramuscular e intra-arterial em dois modelos representativos de camundongos que apresentam regeneração muscular aguda e crônica. A contribuição dos IDEMs para o músculo esquelético hospedeiro é então confirmada por diferentes testes funcionais em camundongos transplantados. Em particular, a amenização da capacidade motora dos animais é estudada com testes de esteira. O engrafamento celular e a diferenciação são então avaliados por uma série de ensaios histológicos e imunofluorescência em músculos transplantados. No geral, este artigo descreve os ensaios e ferramentas atualmente utilizados para avaliar a capacidade de diferenciação dos IDEMs, com foco nos métodos de transplante e medidas de desfecho subsequentes para analisar a eficácia do transplante celular.
Introduction
Mesoangioblasts (MABs) são progenitores musculares associados ao vaso derivados de um subconjunto de pericílitos1-3. A principal vantagem dos MABs sobre progenitores musculares canônicos, como as células satélites4, reside em sua capacidade de atravessar a parede do vaso quando entregue intra-arterial e, portanto, contribuir para a regeneração muscular esquelética nos protocolos de terapia celular. Este recurso foi avaliado e confirmado em modelos murinos e caninos de distrofia muscular1,5,6. Esses estudos pré-clínicos construíram as bases para um primeiro ensaio clínico de fase I/II baseado no transplante intra-arterial de MABs idênticos ao doador HLA em crianças com distrofia muscular de Duchenne (EudraCT nº 2011-000176-33; atualmente em andamento no Hospital San Raffaele de Milão, Itália). Um dos principais obstáculos das abordagens terapêuticas celulares, onde bilhões de células são necessárias para tratar o músculo de todo um corpo, é o limitado potencial proliferativo do "medicamento" (as células). Além disso, foi recentemente demonstrado que não é possível obter MABs de pacientes afetados por algumas formas de distrofias musculares, pois ocorre na distrofia muscular de cinta de membros 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Para superar essas limitações, foi recentementeestabelecidoum protocolo para a deriva de células-tronco/progenitoras semelhantes ao MAB de iPSCs humanos e murinos. Este procedimento gera populações celulares facilmente expansíveis com uma assinatura genética vascular e imunofenótipo altamente semelhante aos MABs derivados de músculos adultos. Após a expressão do fator regulatório miogênico MyoD, tanto os IDEMs murinos quanto humanos (respectivamente MIDEMs e HIDEMs) passam por diferenciação muscular esquelética terminal. Para atingir esse objetivo, os IDEMs podem ser transduzidos com vetores capazes de conduzir a expressão MyoD, seja constitutivamente ou de forma indutível8-10. É utilizado um vetor lentiviral contendo myoD cDNA fundido com o receptor de estrogênio (MyoD-ER), permitindo assim sua translocação nuclear sobre a administração de tamoxifen (análogo de estrogênio)11. Essa estratégia resulta na formação de miótubos multinucleados hipertróficos, com alta eficiência7. Notavelmente, os IDEMs não sãotumorgênicos, podem engrafar e diferenciar os músculos hospedeiros no momento do transplante e podem ser geneticamente corrigidos usando diferentes vetores (por exemplo, lentivírus ou cromossomos artificiais humanos), abrindo caminho para futuras estratégias terapêuticas autólogas. A derivação, caracterização e transplante de IDEMs foram descritas na publicação acima7. Este documento protocolar detalha os ensaios realizados para avaliar a diferenciação miogênica in vitro dos IDEMs e as medidas subsequentes de desfecho para testar a eficácia de seu transplante em modelos de regeneração muscular.
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Protocol
1. Avaliação do Potencial miogênico e engrafado
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In vitro: Diferenciação induzida pelo MYOD
- Gerar uma linha celular estável de IDEMs transduzidos com o vetor lentiviral myoxifen-ER indutível de tamoxifen, titulando a multiplicidade de infecção (MOI; por exemplo, 1, 5 e 50) utilizando a coloração descrita em 1.1.9 (MyHC) como resultado da eficiência do procedimento.
- Cubra um prato de 3,5 cm com 1 ml de 1% de Matrigel e incubar por 30 min a 37 °C.
- Lave a placa duas vezes com idem médios e semeados 1 x10 5 MyoD-ER transduzidos no prato de cultura tecidual de 3,5 cm e incubar a 37 °C em meio de crescimento.
- Espere que as células atinjam a confluência em um ou dois dias e, em seguida, adicionem 1 μM 4OH-tamoxifen no meio de crescimento(1ª dose).
- Após 24 horas, substitua o meio de crescimento por meio de diferenciação complementado com 1 μM 4OH-tamoxifen (2ª e última dose).
- Substitua metade do meio por um novo meio de diferenciação a cada dois dias.
- Examine diariamente as culturas para a formação do miotube.
- Após uma semana (5 dias em meio de diferenciação), lave as placas suavemente com PBS e fixe com 4 % de paraformaldeído por 5 min no RT.
- Realize uma mancha de imunofluorescência com anticorpos contra a cadeia pesada de minocina (MyHC) para confirmar a presença de moxutadores. Contra-mancha com um corante nuclear (por exemplo, Hoechst).
A eficiência da diferenciação é avaliada como o percentual de núcleos dentro das células myhc-positivas: proceda para o próximo passo se a eficiência for >50%.
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In vivo: engraftment em um modelo de regeneração muscular aguda
Para avaliar a contribuição in vivo dos IDEMs MyoD-ER para a regeneração muscular, as células são previamente rotuladas com uma codificação vetorial para a proteína fluorescente verde (GFP) que permitirá rastreá-las dentro do tecido. Os IDEMs myoD-ER GFP são então injetados em músculos murinos adultos, anteriormente feridos com uma miotoxina (por exemplo, cardiotoxina). Para evitar a rejeição imune contra células xenogênicas (como HIDEMs) ou geneticamente manipuladas/corrigidas, é necessário usar camundongos imunodeficientes ou imunossupressores.- Pré-trate os animais com uma injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (forma liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (forma aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.
- Administre anestesia e analgesia ao camundongo seguindo as diretrizes específicas que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação animal.
- Injetar 25 μl de cardiotoxina de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; ATENÇÃO: substância potencialmente prejudicial) nos músculos tibialis anteriores (TA).
- 24 horas após o tratamento dos animais com tamoxifen e CTX, desprendem as células por experimentação e contagem.
- Centrifugar as células a 232 x g por 5 min.
- Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+livre, centrífuga e, em seguida, reapridar suavemente a pelota celular em Ca2+- e MG2+- PBS livre para uma concentração final de 106 células/30 μl, que será o volume final de cada injeção.
- Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos anteriormente feridos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Preste atenção especial ao remover a agulha do músculo. Faça-o lentamente, evitando derramar a suspensão da célula através da pista da agulha. Não transplante o TA contralateral e use-o como controle, injetando 30 μl de Ca2+- e MG2+-PBS livre para replicar as condições do transplantado.
- Trate os animais com tamoxifeno por mais seis dias e administre analgesia (por exemplo, Carprofen) por mais dois dias.
- Explane os músculos a partir de 14 dias após o transplante em diante. Processe e analise as amostras conforme detalhado nos Protocolos 4 e 5.
2. Transplante em Modelos de Camundongos de Distrofia Muscular
Este ensaio de transplante permite avaliar a extensão do enxerto de IDEMs em modelos de camundongos de distrofia muscular. Os animais, tratados da seguinte forma, também podem ser avaliados para amenização funcional do fenótipo da doença. Os testes funcionais podem ser realizados a partir de duas semanas após o transplante. A fim de melhorar o enxerto considere realizar exercícios de esteira de pré-transplantação (como descrito no Protocolo 3) e/ou injeções de células seriais a cada três semanas para 3x (ou seja, para um total de 3 injeções/músculo).
- Transplante intramuscular
- Pré-trate os animais com injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (formulação liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (formulação aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.
- Despeça por trippsinização, conte e centrifuge as células a 232 x g por 5 min.
- Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+- livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e MG2+-livre PBS para uma concentração de 106 células/30 μl.
- Administre analgesia e desinfete a pele do animal (opcional) com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone. Isso também ajudará a localização dos músculos tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) e quadríceps femoris (QC; especificamente os músculos vastos intermedius).
- Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Para o TA, insira 5 mm da agulha 2 mm abaixo da inserção do tendão proximal (direção craniocaudal) com uma inclinação de 15° em relação à tíbia e injete lentamente a suspensão celular enquanto retrai a agulha (esvazie a seringa com 2 mm da agulha ainda dentro do músculo). Para o GC e QC, repita o mesmo procedimento detalhado para o TA, sendo a principal diferença a inserção caudocranista da agulha 2 mm acima da junção miotendinous do tendão de Aquiles para o tendão de Aquiles e 2 mm acima do tendão distal para o QC (inclinação de 15° em relação ao fêmur). Preste atenção ao remover a agulha do músculo, a fim de evitar derramar a suspensão celular através da pista da agulha.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Em caso de baixo enenxerto considere injetar camundongos juvenis (1-2 semanas de idade)com 3 x 105 células/10 μl (note que neste caso o tamoxifeno precisa ser administrado subcutâneamente).
- Transplante intra-arterial
Esta parte do protocolo permite que a avaliação da capacidade de MIDEMs e HIDEMs sejam entregues na circulação arterial, cruzem a parede do vaso e contribuam para a regeneração muscular esquelética nos músculos a jusante até o local da injeção.- Pré-tratamento de animais e células como descrito acima na etapa 2.1.1.
- Despeça-se por trippsinização e filtro com um coador de células de 40 μm (para remover clusters da suspensão celular no caso improvável de que a exposição noturna ao tamoxifen possa impulsionar a fusão e a formação de miotubes a partir de células adjacentes) contar e centrifugar as células a 232 x g por 5 minutos
- Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+sem livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e Mg2+-free PBS com 0.2 International
Unidades de heparina de sódio (opcional) a uma concentração celular final de 106 células/50 μl. Adicione 10% Corante azul patente (concentração final: 1,25 mg/ml em soro fisiológico normal ou Ca2+- e MG2+-livre PBS) à solução a fim de visualizar a distribuição da suspensão celular. - Administre anestesia e analgesia ao camundongo de acordo com as diretrizes que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação específica de animais institucionais.
- Raspe a região inguinal (também conhecida como triângulo femoral ou de Scarpa) e desinfete a pele com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone.
- Faça uma incisão de 5-7 mm e localize o feixe femoral: veia, artéria e nervo (o nervo coloca lateralmente na artéria e na veia medial).
- Remova suavemente a fáscia conectiva que cobre o feixe com fórceps.
- Separe a veia femoral e o nervo da artéria introduzindo suavemente a ponta de um fórceps (ou uma agulha de 30 G) entre eles e aumentando progressivamente o orifício.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: A veia femoral é frágil: preste atenção para não beliscá-la com os fórceps durante seu desprendimento da artéria femoral. Em caso de hemorragia, drene o sangue com gaze estéril e use um micro cauterizador para facilitar a hemostasia. - Levante a artéria com uma ponta dos fórceps e aperte a artéria com a outra ponta.
- Fure a artéria com uma seringa equipada com uma agulha de 30 G. Injete 50 μl de suspensão celular a jusante da área fixada, a uma velocidade de infusão de aproximadamente 5 μl/seg.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Ressuspenque cuidadosamente as células na seringa antes da injeção: é vital evitar a precipitação de células e a formação de bolhas de ar dentro da seringa. O diâmetro da artéria femoral é ligeiramente menor do que uma agulha de 30 G: tenha cuidado para não truncar a artéria ao inserir a agulha. O corante azul patente permite reconhecer a eficácia da injeção: se corretamente injetado, todo o membro rapidamente ficará azul claro. - Remova lentamente a agulha e as fórceps da artéria para restaurar a corrente sanguínea no membro.
- Aplique pressão com gaze estéril para evitar sangramento e/ou cauterização conforme necessário.
- Sutura a ferida e monitore os animais até a recuperação da anestesia.
- Administre a analgesia por 3 dias e inspecione a ferida diariamente (em caso de infecção por feridas, discuta isso com o pessoal da instalação animal e administre antibióticos conforme necessário).
3. Medidas de Resultado em Animais Distróficos Transplantados: Teste de esteira
A partir de duas semanas após o transplante celular, é possível avaliar a amenização funcional da capacidade motora dos camundongos tratados com os testes da esteira. Este teste permite a avaliação da tolerância ao exercício/resistência dos camundongos tratados. Um rato é considerado cansado quando se deita na área de descanso por mais de 5 segundos, sem tentar reengajar a esteira após uma série de 3 estímulos mecânicos consecutivos (um a cada 5 segundos). As medidas da linha de base começam aproximadamente um mês antes do tratamento e são usadas para avaliar a melhoria de cada animal testado. Este teste pode ser seguido por ensaios adicionais para monitorar a fragilidade das fibras, melhora da força, engrafia, diferenciação de células transplantadas e amelieração morfológica dos músculos transplantados (ver Discussão).
- Aclimatar os animais (geralmente três grupos: tratados, não tratados e controles tipo silvestre/não distrófico) ao exercício antes da primeira medição: coloque a esteira a uma velocidade de 6 m/min por 10 minutos. Repita o procedimento dia não por uma semana.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Registo todas as medições na mesma hora do dia para evitar vieses devido aos ciclos circadianos. - Coloque os animais na esteira, que já foi montada anteriormente com uma inclinação de 10°.
- Ligue a esteira, com uma velocidade inicial de 6 m/min (forneça um estímulo mecânico suave no caso de os animais não estiverem dispostos a iniciar o exercício).
- Inicie o temporizador e aumente a velocidade em 2 m/min a cada 2 minutos.
- Assim que um animal fica na área de descanso por mais de 5 segundos sem tentar reengajar a esteira, toque-a suavemente com uma vara para estimular o reinício do exercício (veja acima).
- Regisso desempenho (tempo e ou distância) de cada animal.
- Repita as medições semanalmente ou a cada 10 dias por pelo menos 3x.
- Repita o mesmo procedimento após o transplante.
- Analise os dados de desempenho comparando a medição de cada animal com o desempenho da linha de base. Sugerimos traçar os valores em um gráfico como uma porcentagem da capacidade média do motor em relação à linha de base e analisá-los por um teste ANOVA de uma ou duas vias seguido de pós-teste apropriado para comparar os grupos.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: use um mínimo de 5 animais/grupo com correspondência de idade, genótipo e sexo e repita as medidas por pelo menos 3x após o transplante.
4. Avaliação do Engrafamento celular e diferenciação em músculos transplantados
Os músculos transplantados e de controle são colhidos no momento apropriado (<2 dias para análise de engraftment de curto prazo, 2-3 semanas para médio prazo e > 1 mês para análise de longo prazo). Se as células transplantadas forem rotuladas com GFP, o enxerto em músculos recém-isolados pode ser avaliado por fluorescência direta sob um estereóscópio equipado com UV.
- Coloque e oriente ao longo do eixo vertical músculos recém-isolados na goma de tragachanth (6% c/v)
- Desidrate as amostras em isopentane pré-ciclimada por um minuto, congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.
- Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura em slides polarizados. Prove a maioria dos músculos nos slides, coletando aproximadamente 8-10 slides com 30-40 seções/slide. É aconselhável coletar uma série de seções em um tubo de 1,5 ml para realizar ensaios de biologia molecular/bioquímica.
- Avalie o enxerto celular com diferentes manchas imunofluorescentes, dependendo da configuração experimental. Por exemplo, no caso do transplante HIDEM em camundongos Sgca-null/scid/bg, manchas com: a) um anticorpo contra Lamin A/C para detectar núcleos de células humanas enxertados; b) um anticorpo contra laminina para visualizar a estrutura geral do músculo; e c) um anticorpo contra Sgca para detectar a restauração derivada do doador da proteína ausente no animal distrófico.
- Quantifique, usando um microscópio de fluorescência, o número de núcleos doadores por seção muscular dentro e fora das fibras musculares e o número de miofibers esqueléticos derivados de doadores por seção.
5. Histopatologia Muscular
Análises histopatológicas permitem a avaliação da estrutura morfológica do músculo transplantado. A melhoria arquitetônica na estrutura tecidual é esperada como resultado da abordagem da terapia celular.
- Fixar os músculos recém-isolados com 4% de paraformaldeído por 1 hora a 4 °C.
- Desidratar as amostras com um gradiente ascendente de sacarose (por exemplo, 7,5-15-30% c/v).
- Deixe os músculos durante a noite na solução de sacarose mais alta.
- Incorpore as amostras em Tissue Tek OCT, coloque-as em isopentane pré-cichilled até que o OCT se torne sólido (evitando a imersão completa das amostras), congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.
- Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura conforme descrito acima.
- Manche as seções com hematoxilina e eosina ou tricromome de Masson de acordo com os protocolos do fabricante padrão.
A hematoxilina e a coloração de eosina permitem calcular marcas do músculo regenerador, tais como: a) o número de miofibers; b) área transversal; c) o número de miofibers contendo um núcleo central. O tricromome de Masson é usado para calcular o índice fibroso, feito subtraindo a área total ocupada pelos miofibers esqueléticos da área total da imagem: a área resultante reflete principalmente o infiltrado conjuntivo e gordo do músculo. Todas as análises nas imagens poderiam ser realizadas usando o software ImageJ (NIH) com a ferramenta de medição e o plugin do contador de células.
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Representative Results
Os resultados representativos relatados seguem os principais ensaios in vitro/in vivo retratados no fluxo de trabalho na Figura 1. 48 horas após 4OH-tamoxifen administração Núcleos myoD-positivos são identificáveis dentro de IDEMs transduzidos myoD-ER na cultura(Figura 2A). As células então se fundem e se diferenciam em miótubos multinucleados(Figura 2B). Quando transplantados intramuscularmente em um modelo murino de lesão muscular aguda, os IDEMs contribuem para a regeneração tecidual(Figura 3). A eficácia dos IDEMs em um ambiente de terapia genética e celular para modelos de murina de distrofia muscular foi avaliada pelo teste de tolerância ao exercício da esteira: A Figura 4 mostra os resultados obtidos após o transplante de MIDEMs do tipo selvagem em camundongos Sgca-null/scid/bege, exibindo uma amenização da capacidade motora em camundongos tratados7. Análises ex vivo de músculos transplantados mostram áreas GFP-positivas representando a extensão da colonização de IDEMs no tecido hospedeiro (Figuras 5A-C),demonstrando assim que as células doadoras engrafam em músculo distrófico. É importante ressaltar que as células transplantadas são capazes de diferenciar in vivo,formando novos miofibers esqueléticos. De fato, a Figura 5 mostra a expressão Sgca de HIDEMs geneticamente corrigidos em camundongos Sgca-null/scid/bege(Figuras 5D e 5E). A amenização estrutural na arquitetura dos músculos transplantados pode ser avaliada através da coloração tricrática de Masson: A Figura 5F mostra uma diminuição na quantidade de tecido fibroso no músculo tratado.
Figura 1. Mapa de fluxo de protocolo. O esquema fornece uma visão geral da estratégia baseada no IDEM, desde ensaios preliminares de diferenciação in vitro (esquerda) até as várias etapas necessárias para avaliar o enenxermento, potencial miogênico e amelioração funcional in vivo e ex vivo (à direita). As caixas cinza escuras contêm as várias etapas descritas no protocolo; caixas cinza claro contêm partes do método não detalhado neste artigo. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 2. Avaliação do potencial miogênico in vitro. (A) Imunofluorescência mostrando expressão de MyoD nuclear em 4 de 7 núcleos MIDEM transduzidos myoD-ER após 48 horas de exposição a 4OH-tamoxifen. (B) Mancha de imunofluorescência para cadeia pesada de miosina (MyHC) em myotubes derivados de HIDEM induzidos por 4OH-tamoxifen após uma semana em meio de diferenciação (Barra de escala, 200 μm). Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 3. Avaliação in vivo do enxerto celular em um modelo de regeneração muscular aguda. (A) Imagens de fluorescência estereoscópica de GFP de músculos tíclicos recém-isolados lesionados por cardiotoxina anterior explanibilizadas 2 semanas após injeção intramuscular de10 6 GFP-HIDEMs (esquerda) e GFP-MIDEMs (centro). Barra de escala, 2 mm. (B) Fotos de ampliação baixa (superior) e alta (inferior) do músculo transplantado com MIDEMs mostrados em (A) exibindo miofibers GFP positivo. Barra de escala, 200 μm. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 4. Teste de tolerância ao exercício da esteira. Teste de esteira representativo para transplante (IM = intramuscular; IA = intra-arterial). Camundongos sgca-nulo/scid/ bege (106 células/injeção) versus camundongos distróficos e não-moldados imunodeficientes de controle não moldados. O enredo mostra a amenização funcional de camundongos distróficos transplantados com MIDEMs (12-22% a mais do que animais não transferidos 35 dias após o transplante). Os dados são mostrados como capacidade motora média em relação ao desempenho da linha de base (ou seja, 100% representa o desempenho da linha de base de cada grupo e apenas os camundongos tratados melhoram significativamente em medições repetidas). *P < 0,05; **P < 0,005, ANOVA unidirecional. A partir de trabalhos publicados anteriormente dos autores7. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 5. Avaliação in vivo do engrafamento e potencial miogênico em modelos de camundongos de distrofia muscular. (A) Imagens de fluorescência estereoscópica de GFP de músculos anteriores de tibialis recém-isolados de camundongos Sgca-null/scid/bege explanados 3-4 semanas após injeção intramuscular de 106 humanos (HIDEMs, esquerda; transplante em camundongos juvenis) e murine (MIDEMs; direita) GFP-IDEMs. Barra de escala, 2 mm. (B) Imagem de fluorescência estereoscópica GFP de um músculo gastrocnemius recém-isolado explanado 3 semanas após injeção intra-arterial de 106 GFP-MIDEMs. Barra de escala, 1 mm. (C) Seção transversal congelada fresca do músculo transplantado com MIDEMs mostrados em (A) exibindo um conjunto de miofibers GFP positivo. Barra de escala, 200 μm. (D) Coloração de imunofluorescência em seções de músculos transplantados intra-muscularmente (como em A) mostrando agrupamentos de fibras geneticamente corrigidas, originadas de IDEMs enxertados. Barra de escala, 150 μm. (E) Quantificação de α-sarcoglycano (Sgca)-myofibers positivos um mês após o transplante intramuscular de IDEMs geneticamente corrigidos em camundongos Sgca-null/scid/bege. (F) Mancha tricrática de Masson dos músculos tibialis anteriores transplantados e controle de camundongos Sgca-nulo/scid/bege (vermelho: fibras musculares; azul: fibrose) destacando a redução do infiltrado fibroso no músculo tratado. Barra de escala, 200 μm. Clique aqui para ver a figura maior.
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Discussion
Os iPSCs podem ser expandidos indefinidamente, preservando seu potencial de auto-renovação e, portanto, orientados a diferenciar-se em uma ampla gama de linhagenscelulares 12. Por essa e outras razões, as células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC são consideradas uma fonte promissora para abordagens autólogas de genética e terapia celular13. Um trabalho publicado anteriormente pelos Autores relatou a geração de progenitores miogênicos e camundongos humanos de iPSCs com um fenótipo semelhante ao dos MABs derivados de pericílito (IDEMs) e sua contribuição eficiente para a regeneração muscular em um modelo de camundongos de distrofia muscular7.
Um pré-requisito para maximizar o potencial miogênico do IDEM é a expressão do fator miogênico MyoD nas células. A transdução com um MyoD-ER indutível de tamoxifen permitiu ter um controle temporal preciso sobre sua expressão com a vantagem de sincronizar sua ativação em toda a cultura e, posteriormente, in vivo. Uma estratégia de transplante baseada em uma única administração de células por músculo (ou por artéria femoral) foi descrita neste artigo. No entanto, as repetidas injeções celulares têm se mostrado eficazes no aumento do enxerto de MAB em diferentes protocolos de terapia celular8. Portanto, em caso de resultados subótimos com IDEMs, vale a pena realizar transplantes repetidos para aumentar a dosagem celular e, consequentemente, contribuir para o músculo hospedeiro.
As medições de desfecho permitem a avaliação da contribuição das células doadoras na amenização funcional do fenótipo dos animais tratados. Além do teste de tolerância/resistência ao exercício realizado com a esteira, podem serconsideradostestes adicionais para análise da capacidade motora voluntária (por exemplo, teste de roda livre), fragilidade de fibras(por exemplo, ensaio de absorção de corante azul Evans) e força específica(por exemplo, fibras únicas ou mecânica muscular inteira) Métodos adicionais para testar a amenização do fenótipo funcional estão disponíveis como procedimentos operacionais padrão no site treat-NMD(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Para coletar informações significativas dos animais transplantados, a amenização funcional deve ser seguida e validada por análises imunohistoquímicas e histológicas, para avaliar o enenxermento celular e arquitetura/remodelação tecidual. Em particular, é importante avaliar a estrutura morfométrica dos músculos enxertados para marcas de regeneração e fibrose, como avaliar o número de fibras com núcleo central, a área transversal dos miofibers e o índice fibroso. Estas últimas análises, juntamente com os desfechos funcionais, dão uma visão exaustiva sobre a eficácia da estratégia. Além disso, o monitoramento da linhagem adotada pelas células transplantadas em termos de contribuição para o tecido (ou seja, myofibers) e manutenção do compartimento de células-tronco é importante para a eficácia a longo prazo de todas as estratégias de terapia celular. Neste caso, já foi relatada a contribuição derivada do doador in vivo para o compartimento pericyte do qual os mesoangioblastos são derivados7; além disso, resultados preliminares indicam contribuição funcional dos IDEMs também para o pool de células satélites (Gerli e Tedesco, resultados inéditos). As análises moleculares para demonstrar o enxerto e a expressão do gene corrigido (ou seja, PCR quantitativo e mancha ocidental) também são críticas, mas estão além do escopo deste artigo e exigiriam um artigo dedicado.
Embora este protocolo tenha sido desenvolvido principalmente utilizando camundongos Sgca-nulo/scid/bege7 (um modelo imunodeficante recentemente publicado de LGMD2D), espera-se que ele possa ser facilmente aplicável a outros modelos de doença muscular. No caso de Sgca-nulo/scid/bege, os camundongos não usamos cardiotoxina, uma vez que os músculos desses animais estão severamente comprometidos e cronicamente sujeitos a ciclos de degeneração e regeneração (portanto, não é necessário um dano adicional de cardiotoxina). No entanto, não poderíamos excluir que um pré-tratamento com cardiotoxina poderia facilitar o enxerto em modelos mais leves de distrofia muscular (por exemplo, camundongos mdx). As amenizações de nossa estratégia podem incluir métodos para melhorar a imunodeficiência do hospedeiro do camundongo (que nos modelos atuais ainda é subótimo) e a eficácia do enxerto celular doador, em particular sobre a entrega intra-arterial de células xenogênicas. Embora o transplante de células múltiplas e o uso de camundongos juvenis contribuam para o aumento do enxertocelular 7,8, as moléculas de adesão do camundongo encontradas pelas células humanas durante a extravasão e/ou migração podem representar obstáculos adicionais à imunodeficiência limitada dos modelos atuais. As direções futuras para a tradução dessa abordagem genética e terapêutica celular em um ambiente clínico podem incluir estratégias farmacológicas para melhorar a extravasão celular e o uso de vetores não intencionais (por exemplo, plasmídeos, mRNAs, cromossomos artificiais humanos ou vetores virais nonintegrando) para reprogramar e corrigir geneticamente as células, evitando assim o risco de inserção de mutagenerose.
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Disclosures
F.S.T. registrou um pedido de patente internacional (não. PCT/GB2013/050112) incluindo parte da estratégia descrita neste artigo. Ele recebeu financiamento da Promimetic e DWC Ltd. para sua pesquisa.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Giulio Cossu, Martina Ragazzi e todo o laboratório por uma discussão e apoio úteis, e Jeff Chamberlain por fornecer gentilmente vetor MyoD-ER. Todos os experimentos envolvendo animais vivos foram concluídos de acordo com todas as agências, regulamentos e diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. O trabalho no laboratório de autores é apoiado pelo Uk Medical Research Council, European Community 7th Framework projects Optistem and Biodesign e o Italian Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
