Summary
Abstract
De zoogdieren neus is een multi-functioneel orgaan met ingewikkelde interne structuren. De neusholte is bekleed met diverse epitheel zoals reuk, ademhalings-en geschubde epitheel sterk kunnen verschillen in anatomische locaties, morfologie en functies. In volwassen muizen, is de neus bedekt met verschillende schedelbeenderen, het beperken van experimentele toegang tot interne structuren, vooral die in het achterste, zoals de belangrijkste reukepithelium (MOE). Hier beschrijven we een effectieve methode voor het verkrijgen van nagenoeg de volledige en intacte nasale weefsels met bewaarde anatomische structuur. Met behulp van chirurgische instrumenten onder een dissectie microscoop, we achtereenvolgens verwijder de schedel botten rond de neus weefsel. Deze procedure kan worden uitgevoerd op zowel paraformaldehyde-vaste en vers ontleed, gevilde muis hoofden. De gehele uitbenen duurt ongeveer 20-30 min, die aanzienlijk korter is dan de experimentele tijd die conventionele chemische basis deverkalking. Daarnaast presenteren we een eenvoudige methode om luchtbellen gevangen tussen turbinates, die van cruciaal belang voor het verkrijgen van intacte dunne horizontale of coronale of sagittale secties van de nasale voorbereiding weefsel te verwijderen. Neusweefsel bereid met onze methode kan worden gebruikt voor de hele montage waarneming van het gehele epitheel, evenals morfologische, immunocytochemische en RNA in situ hybridisatie en fysiologische studies, vooral in studies waar regiospecifieke onderzoek en vergelijking van belang.
Introduction
De zoogdieren neusholte bevat verschillende types van weefsels en organen die verschillende functies dienen. De neusholte maakt het inlaatdeel van de bovenste luchtwegen, die luchtvaart kunnen in en uit de longen. Ingeademde lucht door de neusholte waar het ondergaat temperatuur en vochtigheid conditionering 1, alsmede reinigings-of filteren aan irriterende en giftige stoffen en besmettelijke micro-organismen te verwijderen 2. Beide behandelingen worden uitgevoerd door nasale epitheel en subepitheliale weefsels, waaronder klieren en vaten uitgevoerd en zijn van cruciaal belang voor de bescherming van de lagere luchtwegen en de longen. Naast zijn rol bij de respiratie en epitheliale verdediging, de nasale weefsel bevat ook perifere sensorische apparaten van olfactorische en trigeminus systemen die een groot aantal chemische stoffen te detecteren in de passerende lucht. Afhankelijk van het systeem is geactiveerd, kan sensorische detectie van chemische stoffen in de neus te lokken ofweleen gevoel van geur, irritatie of pijn 3,4.
Het perifere olfactorische systeem is complex en bestaat uit verschillende anatomisch gescheiden olfactorische zintuigen in de neusholte. Onder hen, de belangrijkste reukepithelium (MOE) is de grootste, die goed is voor ongeveer 45-52% van de nasale epitheel bij knaagdieren 5 en is gelegen in de posterieure regio. In de anteroventral regio, is er een paar buisvormige structuren bekend als de vomeronasale orgaan 6, die zitten langs elke zijde van de nasale septum. Twee extra kleine groeperingen van olfactorische sensorische neuronen, die bekend staat als het septum orgaan van Masera 7,8 en de Gruneberg ganglion 9, wonen langs de ventrale septum en de dorsale binnenkomst gebied van de neusholte, respectievelijk. Deze perifere organen bevatten neuro-epitheel met onderscheidende kenmerken in morfologie, celmarker expressie, en fysiologische functie. Duizenden geur samen ontdekken zemoleculen met exquise gevoeligheid 10-12.
Naast de olfactorische zintuigen, de neusholte herbergt ook andere sensorische systemen. Het is bekend dat peptiderge trigeminal zenuwvezels aanwezig in het nasale epitheel, met name het luchtwegepitheel 13,14 zijn. Sommige van deze vezels te detecteren irriterende en giftige chemicaliën en zijn verantwoordelijk voor het initiëren van beschermende reflexen zoals hoesten en niezen 4,15. Irriterende geurende en bittere verbindingen kunnen ook worden gedetecteerd door een recent ontdekte populatie van solitaire chemosensory cellen (SCC), waarvan vele zijn geïnnerveerd door nervus zenuwvezels 16-19. Deze SCC liggen in een hogere dichtheid in het ingangsgebied van de neusholte en vomeronasal invoer leidingen, doorschemeren dat zij ook een beschermende functie dienen 16-18. Aldus kan neusepitheel aanzienlijk verschillen in functie, morfologie en celsamenstelling afhankelijk van hunanatomische locaties.
Zelfs binnen een en gespecialiseerde epitheel, zijn er regionale verschillen. De MOE is een voorbeeld van. De MOE lijnen verschillende turbinates die ingewikkeld en gekrulde structuur. Door hen, verschillende regio's van de MOE ervaring verschillende luchtstroom, en dus verschillende diffusie en klaring van de lucht geurmoleculen 20. Ook is het bekend dat olfactorische sensorische neuronen (ASN) expressie brengen van een bepaalde geur receptor bevinden zich in vier omzeild zones van de MOE 21,22. Hoe deze locatie verschil invloed reactie van een OSN aan geurstoffen is grotendeels onbekend. Bovendien hebben sommige OSN bevolkingsgroepen vertonen regionale voorkeur. Guanylylcyclase-D (GC-D) tot expressie OSNs hebben zonale distributies begunstiging van de cul-de-sac gebieden van de ectoturbinates 23,24. Meer recent, vonden we een subpopulatie van canonieke OSNs die transient receptor potential kanalen M5 uitdrukt (trPM5) en is bij voorkeur gelegen in de laterale en ventrale gebieden 25. Deze resultaten geven aan dat MOE niet uniform. Echter, hoe deze regionale verschillen beïnvloeden olfactorische codering wordt niet begrepen. Dit komt voor een deel omdat grondig fysiologische onderzoek van de MOE en de neus is beperkt door de moeilijkheid om intacte neusepitheel met bewaarde anatomische organisatie met behulp van de huidige methoden.
De nasale epitheel worden voornamelijk omringd door de voorste beenderen van de schedel, inclusief de neus, bovenkaak, palatine, jukbeen, en ethmoid botten. In volwassen muizen en andere knaagdiermodellen deze beenderen zijn hard en moeilijk zonder de nauw verbonden nasale weefsel, met name de delicate turbinates verwijderen. Vaak wordt chemische basis ontkalking gebruikt om botten zacht zodat cryosectioning nasale weefsels van morfologische, immunohistochemische en in situ hybridisatie studies, maar afhanding van de leeftijd van het dier, kan de ontkalking proces nachts tot 7 dagen duren 24,26-28. Deze behandeling is eveneens beperkt, omdat het vereist weefsel fixeermiddel bewaard. Daarnaast kunnen chemische ontkalking hard zijn en invloed hebben op de immunokleuring van sommige gevoelige antilichamen 29,30. Voor fysiologische studies, is levend weefsel nodig is, en dus zijn deze experimenten vaak uitgevoerd op geïsoleerde OSNs of MOE plakjes verkregen van pasgeborenen waarvan de schedel botten zijn dun en zacht 17,31,32. Fysiologische studies kunnen ook gebruik maken ganse berg voorbereidingen door het splitsen van het hoofd 25,33,34, maar meestal alleen de mediale oppervlak van de neus is goed bereikbaar, fysiologische opnames beperken op andere gebieden.
Hier beschrijven we een effectieve, handmatige ontbenen methode om intacte nasale weefsels te bereiden met bewaard gebleven originele anatomische structuur en morfologie. We sequentieel verwijder de belangrijkste beenderen van de voorsteschedel onder een dissectie microscoop om een bijna volledig intact neusepithelium bloot terwijl de dunne turbinate botten intact, tenzij de muizen zijn zeer oud en cryosectioning nodig is. Ook de werkwijze uit te breiden tot het verband tussen de nasale weefsels en reukkwabben, evenals de rest van de hersenen te behouden, waardoor het gemakkelijker gelijktijdig onderzoek van zowel perifere als centrale circuits. De methode kan worden gebruikt om paraformaldehyde-gefixeerde, evenals verse, levende neusweefsel bereiden. Zo is onze methode zal naar verwachting morfologische, immunohistochemische en fysiologische studies van de ademhaling, reukzin, en nasale schade en ziekte te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Muis Neus Voorbereiding
We gebruikten volwassen C57BL / 6 achtergrond muizen in deze studie. Alle dierlijke zorg en procedures zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comites (IACUC) van de Universiteit van Maryland, Baltimore County.
1.1 Het verwerven van de neus van paraformaldahyde-vaste muizen
Figuur 1. Beenderen van een muis schedel A:. Dorsal weergave van de schedel B:. Ventraal uitzicht op de schedel met de onderkaak verwijderd. De schedel werd bereid uit een 40-dagen oude muis. Individuele botten zijn gekleurd voor een betere visualisatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
- Perfuseren transcardiaal om individuele muizen vast na the protocol van Lin, et al.., (2008) 16. In het kort werden muizen diep verdoofd met tribroomethanol (Avertin 250 ug / g lichaamsgewicht), transcardiaal geperfuseerd met 0,1 M fosfaatbuffer (PB, 30-50 ml), gevolgd door een fosfaatgebufferde fixeermiddel met 3% paraformaldehyde, 19 mM L-lysine monohydrochloride en 0,23% natrium-m-perjodaat (ongeveer 35-50 ml). Men kan ook de stappen in de JoVE artikel voor dieren perfusie 35.
- Gebruik een schaar af te snijden onderkaak (of de onderkaak) en verwijder de huid op de kop.
- Scheid de gehele kop van de rest van het lichaam.
- Verwijder het gehemelte. Ook, schoon en verwijder de overgebleven bindweefsel en spier aan het oppervlak van de schedel bij de in figuren 1A en 1B specimen te verkrijgen.
- Onder een dissectie microscoop, verwijder de schedel bot die de hersenen en het olfactorische bollen. De overtollige weefsel en botten. Geente, voor het verlengde bereiding weefsel waarin de hersenen en neus verbonden blijven, alleen de schedel botten worden verwijderd. Voor immunohistochemische experimenten, het weefsel werd nagefixeerd gedurende 1,5 uur en overgebracht naar 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 25% sucrose overnacht. Neusweefsel moet gedurende de dissectie bevochtigd gehouden worden door dompelen in de gebufferde sucrose oplossing meerdere malen.
1.2 Het verwerven van de neus van vers geëuthanaseerd muizen
- Individuele muizen werden overgebracht naar een schone kooi en blootgesteld aan CO2 gas, gevolgd door cervicale dislocatie 5 minuten na de laatste adem. Om het bloed in de neus weefsel te verminderen, gebruik een schaar om de kist te openen en snijd het hart om bloed te lekken.
- Herhaal de stappen 1.1.2 tot 1.1.5, met uitzondering van de post-fixatie en cryoprotection met 25% sucrose. Het monster moet bevochtigde behouden en onderhouden met zoutoplossing bevattende Tyrode (in mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 Na pyruvaat, 10 D-glucose en 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur buffer (HEPES, op pH 7.4). Als alternatief, vouw een stuk Kimwipes, laten weken met Tyrode oplossing, en plaats onder het monster terwijl ontleden en af en toe het model dompelen in een oplossing van de Tyrode of laten vallen enkele oplossing op het weefsel om het bevochtigd om de levensvatbaarheid van de cellen en weefsels te behouden te houden .
2. Snijtand, Anterior Vomer en Maxilla Bone verwijderen
- Starten vanaf een ventrale oogpunt. Zoek de vomer bot en breken vomer bot langs zijn lengte met een rongeur of tang met tanden aan de ventrale grootste deel van het bot breken.
- Met behulp van getande tang, verwijder de gebroken segmenten van de vomer bot door voorzichtig varen de botfragmenten uit de buurt van de vomeronasal orgaan (VNO). Let op, voor muizen minder dan een maand oud is, of als alleen geïnteresseerd in de MOE, deze twee steps kan worden overgeslagen.
- Houd het hoofd stevig vast met een pincet. Gebruik rongeur het voorste gedeelte van zowel snijtanden en jointed regio anterior maxilla tussen de twee snijtanden en vomer bot breekt.
- Breek het ventrale gedeelte van de rechter bovenkaak in de regio alleen maar juist voor de jukbeenboog tot op het niveau van de dorsale jukbeen plaat.
- Flip over de neus voor een dorsale gezichtspunt. Gebruik de rongeur rechts bovenkaak voorste van de dorsale jukbeen plaat breken. Het gehele rechts maxilla voorste van de jukbeen plaat moet los. Gebruik de fijne tang om voorzichtig te scheiden elke neusweefsel grondslag liggen aan de bovenkaak, en dan zachtjes til het bot fragment.
- Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 aan de linker snijtand en linker anterior bovenkaak los en verwijder ze na het neusbeen is verwijderd.
3. Neusbeen en Dorsale Zygomatic Plate Removal
- Gebruik de gekartelde tang of de rongeur opnieuwbewegen de rest van de voorhoofdsbeenderen net caudaal van de nasale botten. Na het verwijderen van dit stukje bot, kan het caudale deel van het neusbeen worden vastgepakt behulp van een tang.
- Gebruik rongeur aan het voorste gedeelte van het jukbeen, dat verbonden is met het jukbeen plaat breken.
- Neem de fijne tang aan de laterale rand van het dorsale einde van het jukbeen plaat en voorzichtig omdraaien het bot en verwijder deze. Als het bot is niet los, gebruikt u de rongeur te klemmen voorzichtig om het los te verwijderen.
- Gebruik het fijn pincet of een scheermesje aan de mediale hechting tussen de rechter en linker neusbeenderen los.
- Gebruik de gekartelde tang om het caudale einde van het recht neusbeen grijpen. Beweeg het been van links naar rechts om het te scheiden van de onderliggende weefsel. Het is nuttig de forceps bewegen langs de caudale derde van de nasale bot van de botzijde beweging naar rechts. Zoals het neusbeen scheidt, langzaam til het been van het caudale einde.
- Terwijl thij neusbeen is iets opgetild, kantel het bot lateraal een laterale uitstulping van het bot dat is bekleed met dunne respiratoire epitheelweefsel onthullen. Gebruik fijn pincet om dit weefsel voorzichtig los te maken van het neusbeen. Doorgaan met het neusbeen tillen. Wanneer het bot volledig gescheiden is van het onderliggende weefsel, met een schaar het neusbeen af te snijden aan de rostrale einde.
- Herhaal de stappen 3.1, 3.5 en 3.6 voor het verwijderen van de linker neusbeen.
- Herhaal de stappen 3.2 en 3.3 voor de linkerkant van de neus.
4. Laterale Zygomatic Plate Removal
- Verwijder het jukbeen plaat ene kant tegelijk. Ofwel jukbeen plaat kan eerst worden verwijderd.
- Vanuit een ventrale oogpunt, breken de bovenkaak inferieur aan de jukbeenboog totdat pauze de jukbeenboog bereikt.
- Vanuit een dorsale oogpunt, voorzichtig pak de jukbeenboog en til voren en lateraal. Als het jukbeen plaat is nog steeds verbonden aan een weefsel, neem de fijnetang en zacht verbreken de verbinding tussen het weefsel en het bot.
- Herhaal dit voor het jukbeen plaat aan de andere kant van de neus.
5. Orbit Bone Verwijdering
- Vanuit een ventrale oogpunt, breken de palantine bot tussen de kiezen van de neus.
- Gebruik rongeur de 3 molaren en bovenkaak breken elke zijde van de neus.
- Breken en verwijder alle resterende dikke stukjes bot ventrale en posterior aan de turbinates aan elke kant van de neus.
6. Ethmoid Bone Verwijdering
- Breek elk deel van het zeefbeen bot uitsteekt caudaal van de turbinates. Dit is nodig om het verlies van turbinate weefsel voorkomen bij het verwijderen van dunne stukjes van de ethmoid bot die de neusschelpen.
- Voor de rechterkant van de neus, plaats de fijne tang aan de voorste rand van de ethmoid bot en verwijder deze voorzichtig. Als een deel van het bot blijft, herhaalt u deze procedure totdat allede dunne bot die de turbinates is verwijderd. De turbinate botten niet nodig in de meeste van de voorbereidingen worden verwijderd. In oude muizen, de zeefplaat bros. Als cryosectioning van de nasale weefsel nodig is, verwijdert kleine stukjes van de plaat met fijne tang om de potentiële schade als gevolg van het bot te verminderen.
- Herhaal stap 6.2) voor de linkerkant van de neus.
- Verwijder eventuele resterende botfragmenten voorafgaand aan snijden. Opmerking: bij dieren meer dan een jaar oud, de posterodorsal regio van het septum bot is enigszins dik en hard. Men kan dit gedeelte met fijn pincet te verwijderen. Steek de punt van de tang naar beide zijden van het bot aan de dorsale gedeelte van het septum bot en de voering epitheelweefsel scheiden. Gebruik een pincet om het bot te grijpen en het monster te houden. Gebruik een ander paar tang om de bovenste benige gedeelte van de onderste kraakbeen gedeelte van het septum te breken en verwijder deze voorzichtig.
- Stel de aspirator vacuümpomp.
- Plaats de neus in een inbedding mal. Dompel de neus in oktober media.
- Gebruik een stofzuiger om luchtbellen gevangen in de neus weefsel te verwijderen. Dit proces duurt maximaal 5 minuten.
- Na het verwijderen van luchtbellen, stel het weefsel in de gewenste richting.
- Bevriezen van de LGO en weefsel in de mal met behulp van droogijs. De ingebed weefsel kan dan meteen cryosectioned of bewaard bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methode kunnen we betrouwbaar krijgen bijna volledig intact neusweefsel. Figuur 2A toont een beeld van volwassen nasale specimen van een paraformaldehyde-vaste kop. In dit exemplaar, alle vier sub-olfactorische sensorische organen, waaronder de MOE, septum orgel, de Gruneberg ganglion, en VNO, intact zijn. Ook de respiratoire epithelia en subepitheliale weefsels, zoals klieren en vaten worden bewaard. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode in een aantal studies waarin werd onderzocht morfologie, distributie, zenuwen innervatie, en celmarker expressie in verschillende gespecialiseerde sensorische celpopulaties 16,17,36-38.
Figuur 2B toont een exemplaar met de hersenen, olfactorische bollen, en de neus samen. Deze uitgebreide preparaat is vooral nuttig in studies die zenuwverbinding tussen de perifere en centrale olfactorische vereisen. We bereid dit exemplaar door het verwijderen van de schedelbeenderen surrounding de hersenen vóór de verwijdering van gezichtsbeenderen. Onze uitgebreide methode laat onderzoekers toe om experimenten uit te voeren op zowel perifere als centrale olfactorische systeem in een enkel preparaat.
De nasale weefsel getoond in figuur 2 kan worden gebruikt voor het hele mount observatie, alsmede voor de bereiding van weefselcoupes. Figuur 3A tonen een horizontale doorsnede-door zowel de MOE en respiratoire regio. Figuur 3B toont een coronale doorsnede doormidden gesneden van het MOE. We gekleurd de secties met neutraal rood voor een betere weergave van de verschillende soorten epitheel en submucosale structuren op verschillende anatomische locaties. Deze resultaten demonstreren dat onze techniek behoudt zelfs delicate MOE neusschelpstructuur en anatomische structuur van de neus, die uitgebreide en vergelijkend onderzoek nasale morfologische en functionele veranderingen in normale en pathologische omstandigheden mogelijk.
Figuur 2. Geïsoleerde neus-en hersenweefsel A:.. Dorsal weergave van intacte neus weefsel ontleed met behulp van onze uitbenen methode B:. Dorsal weergave van een neus en de hersenen met neurale verbindingen tussen de centrale en perifere olfactorische systemen intact Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Delen van nasale weefsels A:.. Een horizontale doorsnede die olfactorische en respiratoire epitheel en andere neusstructuren B: coronale doorsnede door de turbinates of de MOE in de achterkant van de neus. Beide secties waren 14 micrometer dik en gekleurd met neutraal rood MOE:. Main reukepithelium RE:.. Epitheel Respiratory Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier toonden we aan een stap-voor-stap procedure voor het isoleren van intacte olfactorische en respiratoire weefsel van de muis neus door het achtereenvolgens verwijderen van het omringende bot terwijl het sparen onder het weefsel. We tonen aan dat een zorgvuldige botverwijdering zelfs de meest delicate weefsels in hun geheel kunnen bewaren. We delen ook inzicht in mogelijke modificaties van deze techniek, waarbij isoleren we zowel de hersenen en neus weefsel samen om de zenuwverbinding behouden. Deze nieuwe werkwijze verschaft een middel voor het isoleren hele olfactorische en respiratoire weefsels in een enkel exemplaar voor verdere verwerking in immunohistochemische RNA in situ hybridisatie en fysiologische experimenten.
Voordelen van Bone Removal
Voordat onze methode, werden ontkalkingsmiddelen meestal gebruikt om botten te snijden weefsel en immunohistochemie verzachten. Afhankelijk van de grootte van het bot en de leeftijd van de dieren, ontkalkingkan een langdurig proces waarbij weefsel incubatie in bot ontkalkingsmiddelen voor uren of zelfs enkele dagen 29,30 zijn. De middelen gebruikte zuren, die effecten op het weefsel dat kan veranderen of verhinderen immunokleuring 29,30 kunnen bevatten. Om dit tegen sommige onderzoekers gebruiken ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van calciumionen sekwestreren van het bot 24,26-28. Deze werkwijze vereist ook ontkalking dagen. De hier getoonde ontleding kan worden uitgevoerd in ongeveer 20-30 min en de toepassing van chemische oplossingen die de kleurbaarheid van weefsel kunnen veranderen niet vereist.
De methode kan ook gebruikt worden om intact nasale weefsel te verkrijgen uit vers ontleed neuzen, die een voordeel voor het verkrijgen van levend weefsel om fysiologische opnames. Zo zijn neus plakjes gebruikt voor Ca 2 + beeldvorming van OSNs en steuncellen in het reukepithelium 31,32. Deze segmenten moetenbereid uit neonatale muizen voordat de botten rondom de weefsels verhard. Echter, neonatale monsters niet identiek zijn aan volwassenen, omdat de olfactorische epithelium blijft ontwikkeling en rijping postnataal. Met behulp van onze methode, kunnen onderzoekers intact olfactorische weefsel te verkrijgen van muizen ouder dan neonatale leeftijden. Dit vormt een belangrijk voordeel, vooral in studies van leeftijdsgebonden veranderingen.
Wijzigingen en probleemoplossing
We toonden een effectieve volgorde om de omliggende botten te verwijderen. Er zijn echter andere sequenties van botverwijdering intact nasale weefsels te verkrijgen, en de stapsgewijze procedure kan worden aangepast afhankelijk van de individuele behoeften van de onderzoeker en de weefsels die het meest interessant. Als bijvoorbeeld de vomeronasal orgaan nodig, het vomer botweefsel vroeg in de procedure verwijderd omdat er meer bot bedekte gebieden te grijpen op het weefsel te houden op de gewenste plaats tijdens het verwijderen. Door aanpasting van de procedure voor elke toepassing, weefsels van belang hebben meer kans om intact blijven voor verdere verwerking. De neusbeenderen ook vaak moeilijk te verwijderen, zoals hieronder weefsel vast aan de botten en vaak scheuren als de botten weg worden opgeheven. Naast wiebelen de nasale botten, zoals aangegeven in de video, kunnen kleine tang voorzichtig worden ingevoegd tussen het neusbeen en het onderliggende weefsel te helpen verplaatsen van het weefsel naar beneden en weg van de botten tijdens het verwijderen.
De dissectie varieert enigszins afhankelijk van de leeftijd van de muizen. Bij jonge muizen, de botten meestal zachter, terwijl de botten van oudere muizen brozer en sterker gefuseerd aangrenzende botten in sommige gebieden. Zacht bot is makkelijker te scheiden en in kleine stukjes dan harder bot te verwijderen. Dit verschil kan gemakkelijk worden ondervangen door het gebruik van een tang om te scoren of schrapen op verbindingen tussen botten te helpen bij hun scheiding en schone verwijdering. In oudere dieren, de re posterodorsalGewest van septum is enigszins dik en hard en moeten worden verwijderd voordat cryosectioning. De benige gedeelte van het septum kan worden verwijderd zoals beschreven in proces 6.4. Hoewel er kleine verschillen in de dissectie oudere en jongere muizen, leeftijd is geen beperkende factor. In onze studies hebben we met succes voorbereid intact nasale weefsel van muizen, variërend van 14 dagen tot twee jaar oud.
Er is geen significant verschil tussen het ontleden stappen gebruikt voor fixeer-vaste neus en voor frisse neus al het verse weefsel is zachter en vereist meer zorgvuldige manipulatie. In beide preparaten, waarbij het weefsel bevochtigd tijdens de dissectie is belangrijk. Het is niet noodzakelijk de verse weefsel dissectie voeren in gebufferde zoutoplossing echter periodiek dompelen het weefsel in Tyrode's oplossing of druipt de oplossing op het weefsel terwijl het ontleden is essentieel omdat het weefsel bevochtigde en voedingsstoffen geleverd aan de v behouden blijftANSPRAKELIJKHEID.
De hier gepresenteerde kunnen verder worden gemodificeerd om botverwijdering dat zowel de hersenen en neus in een monster (figuur 2B) wordt afgebroken omvatten. Deze wijziging spaart de zenuw verbindingen tussen de hersenen en de neus die pas door de zeefplaat. Meer technische vaardigheid en tijd nodig zijn voor deze dissectie dan de neus alleen. Echter, het behoud van de verbindingen van de periferie naar de hersenen zorgt voor meer diverse toepassingen van deze methode.
Beperkingen
We hebben deze methode voor nasale weefsels bereiden op een aantal studies, waaronder immunohistochemische labeling en mRNA in situ hybridisatie-analyse, en met succes vele eiwitten gelabeld signaaltransductiewegen gekleurde cel markers in verschillende celpopulaties en onderzocht morfologische kenmerken en celverdeling via de neusholte 16,17,36-39. We deden niet experience beperkingen in cryosectioning en immunokleuring. Voor studies die vereisen cryosectioning van de uitgebreide voorbereiding die de hersenen en het nasale weefsel verbonden in een enkel exemplaar houdt, raden wij u aan muizen jonger dan 4 maanden te gebruiken, omdat in oudere muizen de broze zeefvormige plaat kan weefselbeschadiging te creëren tijdens het snijden. Voor verse weefsel bestemd voor elektrofysiologische opnames, de mediale weefsel tussen turbinates niet in de ganse berg preparaat gemakkelijk toegankelijk. Verwijderen van kleine stukjes weefsel of te splitsen in afzonderlijke regio's kan het probleem te overwinnen. Omdat conventionele electro-olfactogram gebeurt op het mediale oppervlak van endo-turbinates 25,33,34 kunnen onze weefselvoorbereiding opnamen van andere gebieden kunnen met weinig manipuleren.
Toepassingen buiten Immunohistochemistry
Veel toepassingen van de procedure bestaan voor degenen die de techniek onder de knie hebt. Mogelijk applicationen bevatten zonale studies over olfactorische en respiratoire weefsels die, met behulp van andere methoden, moeilijk zijn geweest om intact en in hun oorspronkelijke anatomische configuratie te verkrijgen. Toepassingen bestaan ook voor elektrofysiologie doordat gelijktijdig meerdere-opnamen op hele, verse weefsels. Sommige van deze toepassingen, die moeilijk uit te voeren met bestaande technieken waren, worden mogelijk gemaakt door onze ontbenen methode. Verder kan dit protocol ook worden aangepast aan biochemische, genomische en proteomics studies die consistente monstername op verschillende regio's voor kritische vergelijking vereisen.
Samengevat hebben we een procedure snel en betrouwbaar toegang olfactorische en respiratoire weefsels in de muis neus door het verwijderen van de omringende botten ontwikkeld. Deze werkwijze heeft aanzienlijke voordelen boven gebruikelijke technieken zoals ontkalking. Verder, onze werkwijze geen chemische behandeling vereist, daarom zijn weefsels niet beperkt voor gebruik in immunohistochemistry experimenten, maar ook toepasbaar voor in situ hybridisatie en fysiologische studies. Aldus onze werkwijze een snellere, meer directe manier om de muis neus te bereiden voor verdere verwerking. We verwachten dat onze methode zal olfactorische en respiratoire studies faciliteren in nasale regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek (NIH / NIDCD 009269, 012831 en ARRA administratieve supplement NIH subsidies) te Weihong Lin. We hebben vooral danken de heer Tim Ford bij UMBC voor zijn technische bijstand bij video-opnamen en verwerken. Wij willen ook dr. Daphne Blumberg, mevrouw Chere Petty bij UMBC en de heer Nicholas McCollum bedanken van Olympus America Inc voor hun uitrusting hulp bij video-opnamen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
