Summary
Abstract
האף של היונקים הוא איבר רב תפקודי עם מבנים פנימיים מורכבים. חלל האף הוא מצופה epithelia השונים כגון epithelia חוש הריח, נשימה, וקשקש אשר נבדלים במידה ניכרת במקומות אנטומיים, מורפולוגיה, ופונקציות. בעכברים בוגרים, האף מכוסה בעצמות גולגולת שונות, המגביל את הגישה ניסיונית למבנים פנימיים, במיוחד אלה בכזה אחורי כאפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך). כאן אנו מתארים שיטה יעילה להשגת כמעט בכל רקמות האף ושלמות עם ארגון האנטומי נשמר. שימוש בכלים כירורגיים תחת מיקרוסקופ לנתח, אנחנו ברצף להסיר את עצמות הגולגולת מקיפות את רקמות האף. הליך זה יכול להתבצע בשני ראשי עכבר paraformaldehyde-קבועים וטרי, גזורים עור. הליך פירוק העצמות של כל לוקח בערך 20-30 דקות, שהוא קצר יותר באופן משמעותי מהזמן הנדרש לדה הניסיונית מבוססת כימי הקונבנציונליתהסתיידות. בנוסף, אנו מציגים שיטה קלה כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין turbinates, שהוא קריטי להשגת חלקים אופקיים או העטרה או sagittal דקים שלמים מהכנת רקמת האף. רקמת האף מוכנה באמצעות השיטה שלנו יכולה לשמש לכל תצפית הר כולו epithelia, כמו גם מורפולוגית, immunocytochemical, רנ"א הכלאה באתרו, ומחקרים פיסיולוגיים, במיוחד במחקרים שבם האזור ספציפית בדיקה והשוואה הן בעלי העניין.
Introduction
חלל האף היונקים מכיל סוגים שונים של רקמות ואיברים המשרתים פונקציות שונות. חלל האף מהווה חלק כניסתם של דרך הנשימה העליונה, המאפשרת נסיעות אוויר לתוך ומחוץ לריאות. שאיפת אוויר עובר דרך חלל האף שבו הוא עובר טמפרטורה ולחות אוויר 1, כמו גם ניקוי או סינון כדי להסיר חומרים רעילים ומעצבנים ומיקרואורגניזמים זיהומיות 2. שני הטיפולים מבוצעים על ידי האף epithelia ורקמות subepithelial, כולל בלוטות וכלי והנם קריטיים להגנה על דרכי הנשימה התחתונה והריאות. בנוסף לתפקידה בנשימה והגנת אפיתל, רקמות האף מכילה גם מנגנונים תחושתיים היקפיים של מערכות חוש הריח ומשולשות, אשר לזהות מגוון רחב של חומרים כימיים באוויר שעובר. תלוי באיזה מערכת מופעלת, גילוי חושי של כימיקלים באף יכול לעורר אוחוש הריח, גירוי או כאב 3,4.
מערכת ההרחה ההיקפית היא מורכבת ומורכב מכמה איברי חישה ריח מופרדים אנטומית בתוך חלל האף. ביניהם, אפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך) הוא הגדול ביותר, המהווה כ 45-52% מepithelia האף במכרסמים 5 והוא ממוקם באזור האחורי. באזור anteroventral, יש זוג מבנים צינוריים המכונים איבר יעקובסון 6, שיושב לאורך כל צד של מחיצת האף. שתי קבוצות נוספות קטנות של עצב סנסורי חוש הריח, המכונות איבר במחיצה של Masera 7,8 וגנגליון Gruneberg 9, מתגורר יחד מחץ הגחון ואזור כניסת הגב של חלל האף, בהתאמה. איברים היקפיים אלה מכילים נוירו epithelia עם מאפיינים בולטים במורפולוגיה, ביטוי תא דה מרקר, ותפקוד פיסיולוגי. יחד הם מזהים אלפי ריחמולקולות עם רגישות מעודנת 10-12.
בנוסף לאברי החישה הריח, חלל האף גם בתי מערכות חושיות אחרות. זה ידוע כי סיבי עצב משולש peptidergic נמצאים באפיתל באף, במיוחד אפיתל הנשימה 13,14. חלק מסיבים אלה לזהות כימיקלים רעילים ומעצבנים ואחראי לייזום רפלקסים הגנה כגון שיעול או התעטשות 4,15. יכולות גם להיות מזוהות תרכובות ריחניות ומריר מעצבנת על ידי אוכלוסייה שהתגלתה לאחרונה של תאים בודדים (chemosensory SCCs), שרבים מן מעוצבבים על ידי סיבי עצב משולש 16-19. SCCs אלה ממוקמים בצפיפות גבוהה יותר באזור הכניסה של חלל האף וצינורות הזנת vomeronasal, ורמז כי הם עשויים לשמש גם תפקיד הגנתי 16-18. לפיכך, אף epithelia יכול שונה באופן מהותי בתפקוד, מורפולוגיה, ובהרכב של תאים בהתאם להםמקומות אנטומיים.
אפילו בתוך האפיתל יחיד ומיוחד, שיש הבדלים אזוריים. משרד החינוך הוא דוגמה אחת כזו. קווי משרד החינוך turbinates השונים, שהם מסובכים ומסולסלים מבנים. בגללם, אזורים שונים של ספיקות האוויר השונות ניסיון מו, ובכך, דיפוזיה שונה ושיעורי פינוי של מולקולות ריח נישאות באוויר 20. כמו כן, ידוע כי עצב סנסורי חוש הריח (OSNs) מבטא רצפטור ריח נתון נמצאים באחד מארבעת אזורים של לעקוף 21,22 משרד החינוך. איך זה משפיע על הבדל מיקום לא ידועה התגובה של OSN לodorants במידה רבה. בנוסף, חלק מאוכלוסיות OSN מפגינות העדפה אזורית. יש לי OSNs מבטא-Guanylyl cyclase-D (GC-D) הפצות אזוריות העדפת אזורי רחוב ללא מוצא של ectoturbinates 23,24. לאחרונה, מצאנו subpopulation של OSNs הקאנוניים שמבטא ערוץ פוטנציאל רצפטור החולף M5 (TRPM5) והוא ממוקם באזורים מועדף לרוחב וגחון 25. תוצאות אלו מצביעות על משרד החינוך שאינו אחיד. עם זאת, כמה הבדלים אזוריים אלה משפיעים על קידוד חוש הריח אינו מובן. מדובר בין השאר משום שהחקירה פיזיולוגית מעמיקה של משרד החינוך ואף הייתה מוגבלת על ידי קושי בהשגת שלמות באף epithelia עם ארגון האנטומי נשמר באמצעות שיטות קיימות.
האף epithelia מוקף בעיקר על ידי העצמות הקדמיות של הגולגולת, כולל האף, הלסת העליונה, הפלטין, הזיגומטית, ועצמות כברתי. בעכברים בוגרים ומודלים של מכרסמים אחרים, העצמות האלה קשות וקשות להסרה מבלי לפגוע ברקמת האף קשורה באופן הדוק, ובמיוחד את turbinates העדין. לעתים קרובות, משמש decalcification מבוסס כימי לריכוך עצמות כדי לאפשר cryosectioning של רקמות האף למורפולוגי, immunohistochemical, ובמחקרי הכלאה באתר, עם זאת, depenדינג בגילו של בעל החיים, התהליך יכול להימשך decalcification הלילה עד 7 ימים 24,26-28. טיפול זה הוא מוגבל גם מכיוון שהיא דורשת להיות רקמה מקבע השתמרה. בנוסף, decalcification הכימי יכול להיות קשה ולהשפיע immunolabeling של כמה נוגדנים רגישים 29,30. למחקרים פיסיולוגיים, נדרשת רקמה חי, ובכך, ניסויים אלה לעתים קרובות נערכים בOSNs מבודד או פרוסות המתקבלות ממשרד חינוך ילודים עצמות גולגולת שלהם הם דקים ורכות 17,31,32. מחקרים פיסיולוגיים יכולים גם לנצל את כל הכנות הר על ידי פיצול ראש 25,33,34, אך בדרך כלל רק המשטח המדיאלי של האף הוא נגיש בקלות, הגבלת הקלטות פיסיולוגיות בתחומים אחרים.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה פירוק עצמות, במדריך כדי להכין את רקמות האף שלמות עם השתמר ארגון האנטומי מקורי ומורפולוגיה. אנחנו ברצף להסיר את העצמות הגדולות של קדמייש צורך בגולגולת תחת מיקרוסקופ לנתיחה לחשוף אפיתל האף כמעט בשלמות לחלוטין, תוך שמירה על עצמות חלזוני דקות ללא פגע, אלא אם כן את העכברים הם ישנים מאוד וcryosectioning. אנחנו גם להרחיב את השיטה לשמירה על הקשר בין רקמות האף ונורות חוש הריח, כמו גם את שאר חלקי המוח, ובכך להקל בחינה בו זמנית של שני מעגלים היקפיים והמרכזיים. השיטה שלנו יכולה לשמש להכנת paraformaldehyde-קבוע, כמו גם טרי, רקמות האף חיים. לכן, השיטה שלנו צפויה להקל על מחקרים מורפולוגיים, immunohistochemical ופיסיולוגיים של נשימה, olfaction, ואף נזקים ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת האף מאוס
אנחנו השתמשנו בעכברים מבוגרים רקע C57BL / 6 במחקר זה. כל הטיפול בבעלי החיים ובנהלים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים וועדות להשתמש (IACUC) מאוניברסיטת מרילנד, במחוז בולטימור.
1.1 רכישת האף מעכברי paraformaldahyde-קבועים
איור 1. עצמות גולגולת של עכבר: A. תצוגה הגבי של הגולגולת ב ':. תצוגת הגחון של הגולגולת עם הלסת התחתונה הוסרה. הגולגולת הייתה מוכנה מעכבר בן 40 יום. עצמות בודדות הן בצבע להדמיה טובה יותר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
- Perfuse transcardially לתקן עכברים בודדים לאחר הדואר הפרוטוקול של לין, et al., (2008) 16. בקצרה, עכברים היו מורדמים עמוק עם tribromoethanol (משקל Avertin 250 מיקרוגרם / g גוף), perfused transcardially עם 0.1M פוספט חיץ (PB, 30-50 מ"ל), ואחריו פוספט שנאגרו מקבע המכיל 3% paraformaldehyde, 19 מ"מ L-ליזין monohydrochloride, ו0.23% נתרן מ-periodate (כ 35-50 מ"ל). אפשר גם לבצע את השלבים במאמר יופיטר לזלוף בעלי החיים 35.
- השתמש במספריים כדי לחתוך את הלסת התחתונה (או הלסת התחתונה) ולהסיר את העור על הראש.
- להפריד את הראש מכל שאר הגוף.
- הסר את החיך. כמו כן, לנקות ולהסיר את רקמת חיבור ושרירים שנותרו על פני השטח של הגולגולת כדי להשיג הדגימה מוצגת ב1A ו-1B דמויות.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את עצם הגולגולת המכסה את המוח ואת נורות חוש הריח. לקצץ את הרקמות ועצמות עודפים. לאטה, להכנת הרקמה המורחבת שבו המוח והאף נשארים מחובר, רק את עצמות הגולגולת יוסרו. עבור ניסויי immunohistochemical, הרקמות היו שלאחר שנקבעה ל1.5 שעות והועברו ל0.1M פוספט שנאגרו מלוח (PBS) עם 25% סוכרוז בן לילה. רקמת האף צריכה להישמר לאורך humidified הנתיחה על ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז נאגר מספר פעמים.
1.2 רכישת האף מעכברים טריים מורדמים
- עכברים בודדים הועברו לכלוב נקי וחשוף לגז CO 2, שאחריו 5 דקות נקע בצוואר רחם לאחר הנשימה האחרונה. כדי להפחית את הדם ברקמות האף, השתמש במספריים כדי לפתוח את החזה וחתך את הלב כדי לאפשר לדם לניקוז.
- חזור על שלבי 1.1.2 ל1.1.5, למעט לאחר הקיבוע וcryoprotection עם 25% סוכרוז. הדגימה צריכה להישמר humidified ומתוחזק עם המכיל תמיסת מלח של Tyrode (מ"מ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 פירובט Na, 10 D-גלוקוז, ו10 N-2-hydroxyethylpiperazine-רוקנ-2-ethanesulfonic חיץ החומצה (HEPES, מותאם ב-pH 7.4). לחלופין, לקפל פיסת Kimwipes, להשרות אותו עם הפתרון של Tyrode, ומקום מתחת לדגימה בזמן לנתח ומדי פעם לטבול את הדגימה בפתרון של Tyrode או להפיל איזה פתרון על הרקמות כדי לשמור אותו humidified כדי לשמור על יכולת הקיום של התאים והרקמות .
2. חותכת, Vomer קדמי והסרת עצם לסת עליונה
- התחל מנקודת מבט הגחון. אתר את עצם vomer ולשבור את עצם vomer לאורכו באמצעות מלקחיים או rongeur עם שיניים כדי לשבור את רוב הגחון של העצם.
- בעזרת מלקחיים משוננים, להסיר את הקטעים שבורים של עצם vomer בעדינות על ידי משוטטות את שברי העצמות מאיבר יעקובסון (VNO). שימו לב, לעכברים פחות מבן חודש, או אם מעוניין רק במשרד החינוך, אלה שני STEניתן לדלג PS.
- חזק היטב את הראש עם מלקחיים. השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של שני שיניים חותכות ואזור מפרקים של לסת עליונה קדמית בין שתי השיניים החותכות ועצם vomer.
- לשבור את החלק הגחוני של הלסת העליונה הימנית באזור רק הקדמי לקשת עד לרמה של צלחת הזיגומטית הגבי הזיגומטית.
- להעיף מעל האף לנקודת מבט הגבי. השתמש rongeur לשבור את הלסת העליונה קדמי הימנית של צלחת הזיגומטית הגבי. קדמי הלסת העליונה הימנית של כל צלחת הזיגומטית צריך להיות משוחרר. השתמש במלקחיים העדינים להפריד כל רקמת האף בסיס הלסת העליונה בעדינות, ולאחר מכן בעדינות להרים משם שבר העצם.
- חזור על שלבים 2.4 ו 2.5 כדי לשחרר את השן החותכת השמאלית ולסת העליונה קדמית שמאלית ולהסיר אותם לאחר עצם האף הוסר.
3. עצם האף והסרת פלייט הזיגומטית הגבי
- השתמש במלקחיים המשוננים או rongeur מחדשלהעביר את שארית העצמות הקדמיות רק הזנב לעצמות האף. לאחר הסרת פיסת עצם זה, ניתן אחז בחלק הזנב של עצם האף באמצעות מלקחיים.
- השתמש rongeur לשבור את החלק הקדמי של קשת הזיגומטית, אשר מחוברת לצלחת הזיגומטית.
- קח את המלקחיים העדינים בקצה הלטרלי של סוף הגב של צלחת הזיגומטית והעדינות להעיף את העצם ולהסיר אותו. אם העצם לא רופף, השתמש rongeur כדי לצבוט אותו בעדינות כדי לשחרר אותו להסרה.
- השתמש בסכין גילוח מלקחיים או קנס כדי לשחרר את התפר המדיאלי בין עצמות האף הימניות והשמאליות.
- השתמש במלקחיים המשוננים לאחוז סוף הזנב של עצם האף הימני. בעדינות להזיז את העצמות מצד לצד כדי להפריד אותו מבסיס רקמות. זה שימושי כדי להעביר את המלקחיים יחד שלישי הזנב של עצם האף להעברה לצד העצם לצד. כמו עצם האף מפריד, לאט להרים את העצם מקצה הזנב.
- אמנם לאהוא עצם האף מעט מורם, הטה את העצם רוחבי לחשוף בליטה לרוחב של העצם שהוא מצופה ברקמת אפיתל נשימה דקה. שימוש במלקחיים בסדר לשחרר רקמה זו בעדינות מעצם האף. תמשיך להרים את עצם האף. כאשר העצם מופרד לחלוטין מהרקמה בסיסית, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצם האף בסוף מקורי.
- חזור על שלבים 3.1, 3.5 ו -3.6 להסרת עצם האף שמאלי.
- חזור על שלבים 3.2 ו -3.3 לצד השמאלי של האף.
4. הסרת פלייט הזיגומטית לרוחב
- הסר את צלחת צד אחד הזיגומטית בכל פעם. כך או צלחת הזיגומטית ניתן להסיר ראשונה.
- מנקודת מבט הגחון, לשבור את הלסת העליונה נחות קשת הזיגומטית עד הפסקה מגיעה לקשת הזיגומטית.
- מנקודת מבט הגבי, בעדינות לתפוס את קשת הזיגומטית ולהרים את קדימה ורוחב. אם צלחת הזיגומטית עדיין מחוברת לכל רקמה, לקחת את הקנסמלקחיים ועדינות לנתק את הקשרים בין הרקמות והעצמות.
- חזור על פעולה עבור צלחת הזיגומטית בצד השני של האף.
5. הסרת עצם אורביט
- מנקודת מבט הגחון, לשבור את עצמות palantine בין הטוחנות של האף.
- השתמש rongeur לשבור את 3 שיניים טוחנות והלסת עליונה בכל צד של האף.
- לשבור ולהסיר את כל חתיכות עבות הנותרות של עצם הגחון ואחוריות לturbinates בכל צד של האף.
6. הסרת עצם כברתי
- לשבור את כל חלק של העצם כברתי הזנב הבולט לturbinates. זה הכרחי כדי למנוע אובדן של רקמת חלזוני בעת הסרת חתיכות דקות של העצם כברתי מכסות את turbinates.
- לצדו הימני של החרטום, הנח את המלקחיים העדינים בקצה הקדמי של העצם כברתי בעדינות ולהסיר אותו. אם חלק של העצם נשאר, לחזור על הליך זה עד שכל העצם הדק המכסה את turbinates הוסר. עצמות חלזוני לא צריכים להסיר ברוב של ההכנות. בעכברים בגיל, צלחת cribriform הופכת פריכה. אם יש צורך cryosectioning של רקמות האף, להסיר חתיכות קטנות של הצלחת עם מלקחיים עדינים כדי להפחית את נזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי העצם.
- חזור על שלב 6.2) לצד השמאלי של האף.
- הוצא את כל שברי עצמות שנותרו לפני חתך. הערה: בחיות יותר מ, אזור posterodorsal בת של עצם מחץ היא מעט עבה וקשה. אפשר להסיר את החלק הזה באמצעות מלקחיים בסדר. הכנס את הקצה של המלקחיים לצד השני של העצם כדי להפריד את החלק הגבי של עצם מחץ ורקמת האפיתל המצפה. השתמש זוג מלקחיים כדי לתפוס את העצם ולהחזיק את הדגימה. השתמש בזוג נוסף של מלקחיים כדי לשבור את החלק הגרמי העליון מחלק הסחוסים התחתון של מחיצת האף בעדינות ולהסיר אותו.
> 7. הכנה לאף cryosectioning
- הגדר את משאבת ואקום aspirator.
- מניחים את האף בעובש הטבעה. להטביע את האף בתקשורת אוקטובר
- להשתמש בשואב אבק כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בתוך רקמת האף. תהליך זה נמשך עד 5 דקות.
- לאחר הסרת בועות אוויר, הגדר את הרקמה בכיוון הרצוי.
- להקפיא את אוקטובר ורקמות בתבנית בעזרת קרח יבש. הרקמה מוטבעת אז יכולה להיות cryosectioned מייד או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שיטה זו, אנו יכולים אמין להשיג רקמת האף כמעט בשלמותה לחלוטין. 2A איור מראה תמונה של דגימה באף מבוגר מראש paraformaldehyde-קבוע. בדגימה זו, כל האיברים ארבעת תת חוש הריח החושי, כולל איבר משרד החינוך, במחיצה, גנגליון Gruneberg, וVNO, הם בשלמותה. כמו כן, epithelia הנשימה ורקמות subepithelial, כגון בלוטות וכלי, נשמרים. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו במספר המחקרים בהם חקרנו מורפולוגיה, הפצה, עצבוב עצב, וביטוי סמן תא באוכלוסיות 16,17,36-38 סלולריים חושיות מיוחדות שונות.
איור 2 מציג את דגימה עם המוח, נורות חוש הריח, והאף יחד. ההכנה מורחבת זו שימושית במיוחד במחקרים הדורשים חיבור עצבי בין מערכות חוש הריח ההיקפיות ומרכזיות. הכנו דגימה זאת על ידי הסרת עצמות הגולגולת surrounding המוח לפני הסרת עצמות פנים. השיטה המורחבת שלנו מאפשרת לחוקרים לבצע ניסויים במערכת הרחה הן היקפית ומרכזית בהכנה יחידה.
רקמות האף שמוצגת באיור 2 יכולות לשמש לתצפית כל ההר, כמו גם עבור הכנה של חלקי רקמות. איור 3 א להראות סעיף חתך אופקי באמצעות שני אזורי משרד החינוך ומערכת נשימה. איור 3 ב מציג סעיף העטרה לחתוך דרך האמצע ממשרד החינוך. אנו מוכתמים הסעיפים באדום ניטראלי לתצוגה טובה יותר של סוגים שונים של מבנים ואפיתל submucosal במקומות אנטומיים שונים. תוצאות אלו מראות כי הטכניקה שלנו משמרת את המבנה העדין אפילו משרד החינוך חלזוני וארגון האנטומי של האף, המאפשר בדיקה מקיפה והשוואתית של שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים באף בתנאים נורמלים ופתולוגיים.
איור 2. מבודד ואף רקמת מוח:.. תצוגת גב של רקמת האף ללא פגע גזור בשיטת פירוק העצמות שלנו ב ':. תצוגה הגבי של האף ומוח עם קשרים עצביים בין מערכות חוש הריח המרכזיות והיקפיות השלמים לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. קטעים של רקמות האף A:.. סעיף אופקי מראה epithelia הרחה ונשימה, כמו גם מבנים אחרים באף ב ': סעיף עטרה דרך o turbinatesF משרד החינוך באחורי של האף. שני החלקים היו 14 מיקרומטר עבה ומוכתם באדום ניטראלי משרד החינוך:. אפיתל הרחה הראשי RE:.. אפיתל נשימה לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו הפגנו הליך צעד אחר צעד לבידוד רקמת הרחה ונשימה ללא פגע מהאף העכבר על ידי רצף הסרת העצמות המקיפות תוך חוסך הרקמה להלן. אנו מראים כי הסרת עצם זהירה יכולה לשמר גם את הרקמות העדינות ביותר בשלמותם. כמו כן, אנו חולקים תובנות שינויים אפשריים של טכניקה זו, שבה אנו מבודדים גם במוח וברקמות האף יחד לשמר את הקשר העצבי. שיטה חדשה זו מספקת אמצעי לבידוד רקמות חוש הריח ונשימה שלמות בדגימה אחת לעיבוד נוסף בimmunohistochemical, רנ"א הכלאה באתרו, וניסויים פיסיולוגיים.
יתרונות של הסרת עצם
לפני השיטה שלנו, סוכני decalcifying היו משמשים בדרך כלל כדי לרכך עצמות עבור חתך רקמות ואימונוהיסטוכימיה. עם זאת, בהתאם לגודלו של העצם וגילם של בעלי החיים, decalcificationיכול להיות תהליך ממושך הדורש דגירה רקמות בdecalcifiers העצם במשך שעות או אפילו מספר ימים 29,30. הסוכנים הנפוצים גם מכילים חומצות, אשר עשוי להיות השפעות על הרקמה שיכול לשנות או לעכב immunolabeling 29,30. כדי להילחם בכך, חלק מהחוקרים להשתמש בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון להטמנת יוני סידן מהעצם 24,26-28. שיטה זו של decalcification דורשת גם ימים. ניתן לבצע הנתיחה שמוצגת כאן בכ 20-30 דקות ואינה דורשת את היישום של פתרונות כימיים שעשויות לשנות stainability של רקמה.
השיטה שלנו יכולה לשמש גם כדי להשיג רקמת האף ללא פגע מאפים טריים גזורים, מתן יתרון להשגת רקמת חיה להקלטות פיסיולוגיות. לדוגמה, פרוסות האף משמשות בדרך כלל עבור Ca 2 + ההדמיה של OSNs ותאים תומכים באפיתל ההרחה 31,32. פרוסות אלה צריכים להיותהכין מעכברי יילודים לפני העצמות המקיפות את רקמות נתקשו. עם זאת, דגימות ילודים אינן זהות למבוגרים בגלל אפיתל ההרחה ממשיך התפתחות והתבגרות לאחר לידה. שימוש בשיטה שלנו, חוקרים יכולים להשיג רקמת הרחה ללא פגע מעכברים מבוגרים יותר מגילי ילוד. זה מציג יתרון משמעותי, במיוחד במחקרים של שינויים תלויי גיל.
שינויים ופתרון בעיות
אנחנו הראיתי רצף אחד יעיל כדי להסיר עצמות שמסביב. עם זאת, ישנם רצפים אחרים של הסרת עצם להשיג רקמות האף ללא פגע, והצעד אחר צעד הליך עשוי להיות שונה בהתאם לצרכים האישיים של החוקר והרקמות של רוב העניין. לדוגמה, אם יש צורך באיבר יעקובסון, עצם vomer יש להסיר בשלב מוקדם של ההליך, כי יש יותר עצמות המכוסים שטחים כדי לתפוס להחזיק את הרקמה במקום הרצוי בעת ההסרה. על ידי ADAPטינג הליך לכל יישום, רקמות של עניין יש סיכוי גבוה יותר להישאר שלם לעיבוד נוסף. עצמות האף גם נוטות להיות קשה להסרה, כמו הרקמה מתחת נצמדה לעצמות ולעתים קרובות כלקרוע את העצמות הם הרימו שם. בנוסף לנענוע עצמות האף, כפי שמוצג בסרטון, מלקחיים קטנים עשויים להיות מוכנסים בעדינות בין עצם האף והרקמה הבסיסית כדי לעזור להעביר את הרקמה למטה מן העצמות במהלך ההסרה.
הנתיחה גם משתנה מעט בהתאם לגילם של העכברים. בעכברים צעירים, העצמות נוטות להיות רכה יותר, ואילו העצמות של עכברים מבוגרים הן פריכות יותר וחזקות התמזגו לעצמות שכנות באזורים מסוימים. עצם רך קל יותר להפריד ולהסיר בחתיכות קטנות יותר מעצם קשה יותר. הבדל זה ניתן להתגבר בקלות על ידי שימוש במלקחיים לציון או לגרד בחיבורים בין עצמות כדי לסייע בהפרדה שלהם וההסרה נקיות. בבעלי חיים מבוגרים, מחדש posterodorsalגיון של מחיצה הוא מעט עבה וקשה, ויש להסיר לפני cryosectioning. החלק הגרמי של מחיצת האף ניתן להסיר כמתואר בהליך 6.4. למרות שיש הבדלים קטנים בנתיחה למבוגר וצעירים עכברים, גיל אינו מהווה גורם מגביל. במחקרים שלנו, הכנו בהצלחה רקמות האף ללא פגע מעכברים הנעים בין 14 ימים לגיל שנים.
אין הבדל משמעותי בין הצעדים לנתח משמשים לאף מקבע-קבוע ולאף טרי למרות הרקמה טרי היא רכה יותר ודורשת מניפולציה זהירה יותר. בשתי ההכנות, תוך שמירה על רקמות humidified במהלך הניתוח היא חשובה. זה לא הכרחי כדי לבצע את נתיחת הרקמה טריות במלוח נאגר, עם זאת, מעת לעת טבילת הרקמה בפתרון של Tyrode או מטפטף את הפתרון על הרקמות תוך ביתור היא קריטית כפי שהוא ישמור את רקמת humidified והמזין סופק כדי לשמור עליו Viability.
ההליך שהוצג כאן יכול להיות שונה עוד יותר לכלול הסרת עצם שמשאירה גם את המוח ואת האף שלם בדגימה אחת (איור 2). שינוי זה חוסך את הקשרים העצביים בין המוח והאף שעובר דרך צלחת cribriform. מיומנות טכנית יותר וזמן נדרשים לנתיחה זו מהאף לבד. עם זאת, שמירה על קשרים מהפריפריה למוח מאפשרת ליישומים מגוונים יותר של שיטה זו.
מגבלות
אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי להכין את רקמות האף למספר המחקרים, כולל תיוג immunohistochemical וmRNA בניתוח הכלאה באתרו, ויש שכותרתו בהצלחה רבים בחלבוני איתות מסלולים, סמנים סלולריים מוכתמים באוכלוסיות תאים שונות, ובחנו את תכונות מורפולוגיות והפצה סלולארי דרך חלל האף 16,17,36-39. אנחנו לא Expמגבלות erience בcryosectioning וimmunolabeling. ללימודים שדורשים cryosectioning של ההכנה הממושכת שמחזיקה את רקמת המוח ואף מחוברת בדגימה אחת, אנו ממליצים להשתמש בעכברים צעירים מ -4 חודשים מאז בעכברים מבוגרים צלחת cribriform שבירה עלולה ליצור נזק לרקמות בחתך. עם זאת, לרקמה טריות המיועדת להקלטות אלקטרו, הרקמות המדיאלי בין turbinates אינן נגישים בקלות בכל הכנת ההר. הסרת חתיכות קטנות של רקמה או פיצול באזורים נפרדים עשויה להתגבר על הבעיה. בגלל אלקטרו olfactogram הקונבנציונלי נעשית על פני השטח המדיאלי של Endo-turbinates 25,33,34, הכנת הרקמה שלנו עשויה לאפשר הקלטות מאזורים אחרים במניפולציה קטנה.
יישומים מעבר אימונוהיסטוכימיה
יישומים של ההליך רבים קיימים למי ששולט בטכניקה. applicat האפשרייונים כוללים מחקרים אזוריים על רקמות חוש הריח ונשימה ש, תוך שימוש בשיטות אחרות, כבר קשה להשיג בשלמות ובתצורה האנטומי המקורית שלהם. יישומים קיימים גם לכך שהוא מאפשר electrophysiology-הקלטות מרובות בו זמנית על כל רקמות, טריות. חלק מיישומים אלה, שהיו קשים לביצוע תוך שימוש בטכניקות קיימות, מתאפשר הודות לשיטת פירוק העצמות שלנו. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם למחקרים ביוכימיים, גנטי, וproteomic שדורשים איסוף דגימה עקבית באזורים שונים להשוואה ביקורתית.
לסיכום, יש לנו פיתחו הליך במהירות ובאמינות לגשת רקמות חוש הריח ונשימה באף העכבר על ידי הסרת העצמות שמסביב. לשיטה זו יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות כגון decalcification. יתר על כן, השיטה שלנו לא דורשת טיפול כימי, ולכן, רקמות אינן מוגבלות לשימוש בimmunohistochemistניסויי ר"י, אבל גם יכולים להיות רלוונטיים עבור הכלאה באתרו ומחקרים פיסיולוגיים. לכן, השיטה שלנו היא דרך מהירה יותר, ישירה יותר כדי להכין את האף העכבר לעיבוד נוסף. אנו מצפים בשיטה שלנו יקל על מחקרים וריח נשימה באזורי האף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NIH / 009,269 NIDCD, 012,831 ומענקי NIH תוספת מנהליים ערה) לWeihong לין. תודה מיוחדת למר טים פורד בUMBC לקבלת הסיוע הטכני שלו בצילום וידאו ועיבוד. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר דפנה בלומברג, גב 'Chere פטי בUMBC ומר ניקולס מק' קול מאולימפוס אמריקה בע"מ לסיוע הציוד שלהם בצילום וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
