プリザーブド解剖組織と無傷マウスの鼻腔組織を準備するための効果的なマニュアル脱骨方法
Abstract
哺乳類の鼻は複雑な内部構造を持つ多機能な器官である。鼻腔は、解剖学的部位、形態や機能に著しく異なる、嗅覚呼吸、および扁平上皮などの様々な上皮が並んでいます。成体マウスにおいて、鼻、特に内部構造、主嗅上皮（MOE）として後方などの形態と実験的なアクセスを制限する、種々の頭蓋骨で覆われている。ここでは、保存され、解剖学的組織とほぼ全体とそのまま鼻組織を得るための効果的な方法を説明する。解剖顕微鏡下手術のツールを使用して、我々は順番に鼻の周囲の組織の頭蓋骨の骨を取り除く。この手順は、両方のパラホルムアルデヒド固定し、新たに解剖し、肌のマウスの頭を行うことができる。全体の脱骨手順は、従来の化学ベースドに必要な実験時間よりも大幅に短くなって20〜30分程度をとり、石灰化。また、鼻の組織標本から無傷薄い水平または冠状または矢状セクションを取得するために重要である甲、間に閉じ込められた気泡を除去する簡単な方法を提示する。我々の方法を用いて調製した鼻腔組織は、特に地域特有の検査との比較に関心がある研究では、全体のマウント全体上皮の観察だけでなく、形態学、免疫細胞化学、RNAのようなin situハイブリダイゼーション 、および生理学的研究のために使用することができる。
Introduction
哺乳類の鼻腔は、異なる機能を果たす組織や臓器の様々なタイプが含まれています。鼻腔、肺の中に空の旅を可能にし、外に上気道の入り口部分を構成している。吸入空気は、それが同様に清掃や刺激や有害物質や感染性微生物2を除去するためにフィルタリングなどの温度と湿度の調節1を経鼻腔を通過する。両方の治療は腺や血管を含め、鼻上皮および上皮下組織によって実施され、下気道や肺を保護するために不可欠です。呼吸および上皮防衛におけるその役割に加えて、鼻の組織はまた、通過する空気中の化学物質の広い範囲を検出嗅覚と三叉神経システムの末梢感覚装置が含まれています。活性化されたシステムに応じて、鼻の中の化学物質の官能検出のいずれかを誘発することができ嗅覚、刺激、または痛み3,4。
末梢嗅覚系は複雑であり、鼻腔内のいくつかの解剖学的に分離された嗅覚の感覚器官で構成されている。このうち、主嗅上皮（MOE）はげっ歯5の鼻の上皮の約45から52パーセントを占めると後方領域に配置され、最大である。前腹領域では、鼻中隔の各辺に沿って座る鼻器官06として知られている管状構造のペアがある。 Masera 7,8とGruneberg神経節9の中隔臓器として知られている嗅覚ニューロンの二つの追加の小さなグループが、それぞれ、腹側中隔と鼻腔の背エントリ領域に沿って存在します。これらの末梢器官は、独特の形態の特徴、細胞マーカー発現、および生理機能と神経上皮が含まれています。彼らは一緒に臭いの何千ものを検出絶妙な感度10-12持つ分子。
嗅覚の感覚器官に加えて、鼻腔はまた、他の感覚系を収容する。これは、ペプチド性三叉神経繊維は、特に気道上皮13,14鼻上皮に存在することが知られている。これらの繊維の中には、刺激性や有毒化学物質を検出し、そのような4,15の咳やくしゃみなどの保護反射を開始する責任があります。刺激性の臭気と苦味化合物は、また、三叉神経線維16-19によって支配されているその多くは孤独な化学感覚細胞（SCCの）の最近発見された人口によって検出することができる。これらのSCCは、それらがまた、保護機能16-18を果たす可能性があることを示唆、鼻腔と鋤鼻エントリーダクトの入口領域における高密度に配置されています。従って、鼻上皮は、その機能に応じて、形態学、および細胞組成物が実質的に異なる可能性が解剖学的部位。
でも、シングルと専門上皮内、地域差があります。 MOEは、その一例である。構造を複雑にし、カールしているMOEライン様々な甲、。したがって、それらのために、異なるMOE体験異なる空気流量の領域、および、異なる拡散と空中匂い分子20のクリアランス速度。また、それは所与の匂い受容体を発現する嗅細胞（OSNs）はMOE 21,22の4迂回ゾーンのいずれかに位置していることが知られている。この場所の差がどのように影響するか匂いにOSNの応答は、主に知られていない。さらに、いくつかのOSN集団は、地域嗜好を示す。グアニル酸シクラーゼ-D（GC-D）発現OSNsはectoturbinates 23,24の袋小路領域を支持する帯状の分布を有する。さらに最近では、我々は（TR一過性受容体電位チャネルM5を表現正規OSNsの亜集団を発見PM5）とは、優先的に横と腹側領域に25に位置しています。これらの結果は、MOEが均一でないことを示している。しかし、これらの地域差は、嗅覚のコーディングにどのように影響するかを理解されていません。これは一部にはあるためMOEと鼻の徹底的な生理調査が現在の方法を使用して保存され、解剖学的組織とそのまま鼻上皮を得ることの難しさによって限定されているされています。
鼻の上皮は、主に鼻、上顎、口蓋、頬骨、および篩骨骨を含む頭蓋前方骨に囲まれています。成体マウスや他の齧歯類モデルでは、これらの骨は特に密接に関連した鼻腔組織、繊細な甲を損傷することなく削除するのは難しいとは困難である。多くの場合、化学ベースの脱灰は、免疫組織化学、形態学、およびin situハイブリダイゼーションの研究で用鼻組織の凍結切片許可するように骨を柔らかくするために使用されていますが、依鼎は、動物の年齢に、脱灰プロセスは一晩まで7日間24,26-28続くことができます。それは組織が固定·保存される必要があるため、この治療法も限られている。さらに、化学的な脱灰が厳しいことと、いくつかの敏感な抗体29,30の免疫標識に影響を与えることができる。生理学的研究のために、生きている組織が 必要とされているので、これらの実験は、しばしば、その頭蓋骨の骨薄いと17,31,32柔らかい新生児から得孤立OSNsまたはMOEスライスに行われている。他の分野に生理の記録を制限する、生理学的研究はまた、分割して頭25,33,34のホールマウント標本を利用することができますが、通常は鼻の唯一の内側表面は簡単にアクセスできます。
ここでは、保存され、元の解剖学的組織と形態をそのまま鼻組織を準備するために効果的な、手動の除骨方法について説明します。私たちは、順番に前方の主要な骨を取り除くマウスは非常に古く、凍結切片が必要とされない限り、薄い甲の骨をそのまま維持しながら、ほぼ完全に無傷鼻上皮を公開する解剖顕微鏡下で頭蓋骨。また、このようにして末梢および中枢両方の回路の同時検査を容易にする、鼻腔組織及び嗅球の間の接続、ならびに脳の残りの部分を保持する方法が延びている。我々の手法は、パラホルムアルデヒド固定だけでなく、新鮮な、ライブ鼻腔組織調製するために用いることができる。したがって、我々の方法は、呼吸、嗅覚、そして鼻の損傷や病気の、形態学的免疫組織化学的および生理学的研究を促進することが期待される。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、下記の組織を温存しながら順次周囲の骨を除去することにより、マウスの鼻から無傷の嗅覚および呼吸組織を分離するためのステップごとの手順を示した。我々は慎重に、骨の除去は、その全体をも、最も繊細な組織を維持することができることを示している。我々はまた、我々は神経接続を維持するために一緒に両方の脳と鼻の組織を分離しているこの技術の可能な修正、洞察?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はWeihong林への研究助成金（NIH / NIDCD 009269、012831及びARRA行政サプリメントNIHの助成）によってサポートされていました。我々は、特にビデオテープに録画して処理するの彼の技術支援のためにUMBCで氏ティムフォードに感謝します。また、ビデオ撮影での機器の援助のためにオリンパスアメリカ社から博士ダフネブラムバーグ、UMBCで氏シェアーペティ氏とニコラス·マッカラムに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
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