Måling vækst og genekspression Dynamics af Tumor-Målrettet Published: July 6, 2013 doi: 10.3791/50540

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tal Danino*¹, Arthur Prindle*², Jeff Hasty^2,3,4, Sangeeta Bhatia^1,5,6,7,8

¹Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ³Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ⁴Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego, ⁵Broad Institute of Harvard and MIT, ⁶Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, ⁷Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Summary

Målet med disse eksperimenter er at generere kvantitative tidsforløb data på vækst og genekspression dynamik svækket

Abstract

Målet med disse eksperimenter er at generere kvantitative tidsforløb data på vækst og genekspression dynamik svækket S. typhimurium bakteriekolonier vokser inde tumorer.

Vi genererede model xenotransplantattumorer i mus ved subkutan injektion af en human ovariecancer cellelinie, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Vi forvandlet svækkede stammer af S. typhimurium bakterier (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) med et konstitutivt udtrykt luciferase (luxCDABE) plasmid til visualisering ^2. Disse stammer specifikt kolonisere tumorer, mens de resterende væsentlige ikke-virulent for mus ^1.

Når målbare tumorer blev etableret, blev bakterier injiceret intravenøst ​​via halevenen med varierende dosering. Tumor-lokaliserede, blev bakteriel genekspression overvåges i realtid i løbet af 60 timer med enin vivo imaging-system (IVIS). På hvert tidspunkt blev tumorer udskåret, homogeniseret og udpladet til kvantificering bakteriekolonier for korrelation med genekspression data.

Sammen disse data giver en kvantitativ måling af in vivo-vækst og genekspression dynamik af bakterier vokser inde tumorer.

Introduction

Syntetisk biologi er skredet hastigt i det seneste årti og er nu positioneret til at påvirke vigtige problemer inden for energi og sundhed. Imidlertid har ekspansion i den kliniske arena blevet bremset af sikkerhedshensyn og et fravær af at udvikle kriterier for udformningen in vivo genetiske kredsløb. Hurtigere stor gennemslagskraft medicinske anvendelser vil kræve at udnytte metoder, interface direkte med medicinsk infrastruktur, genetiske kredsløb, der fungerer uden for det kontrollerede lab indstilling, og sikre og klinisk accepteret mikrobielle værter.

En række af stammer er blevet undersøgt for cancerterapi på grund af deres evne til at vokse fortrinsvis i tumorer. Disse har omfattet C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, og S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium har skabt særlig interesse, da de har udstillet sikkerhed og tolerance i et antal humane kliniske forsøg ^9-12. Disse bakterie en blev oprindeligt vist at skabe antitumorvirkninger gennem stimulering af værtens immunsystem og ved udtømning af næringsstoffer, der kræves for kræft cellestofskiftet. Produktion af terapeutisk gods blev senere tilføjet gennem genetiske modifikationer. Mens disse undersøgelser udgør vigtige fremskridt i brugen af bakterier for tumor terapier, har de fleste af de eksisterende indsats påberåbt sig højt niveau udtryk, der typisk resulterer i leveringen af høje doser, off-target effekter og udvikling af værtsresistens ^13-16 .

Nu kan syntetisk biologi tilføje programmerbar cargo produktionen ved at udnytte beregningsmæssigt designede genetiske kredsløb, der kan udføre avancerede sensing og levering ^17-20. Disse kredsløb kan være udformet til at fungere som afgivelsessystemer som registrerer tumor-specifikke stimuli og selvregulerer gods produktion efter behov. Imidlertid har studere funktionen af disse kredsløb in vivo hidtil været udfordrende.

ve_content "> Da plasmider er de fælles rammer for syntetiske kredsløb beskriver vi en metode til at karakterisere dynamikken i plasmid-baserede genekspression in vivo ved hjælp af en musemodel. Disse metoder anvender time-lapse luminescence billedbehandling og kvantitativ måling af biofordeling. Sammen disse tilgange skabe en ramme for at studere plasmid-baserede netværk in vivo for kliniske anvendelser.

Protocol

1.. Cell Preparation

1. Passage cellelinjer under anvendelse af standard cellekulturteknikker. I dette eksperiment brugte vi OVCAR-8 celler (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Dyrk cellerne til et mål sammenflydning på 80 - 100%.
2. Cellerne inkuberes med 5 ml trypsin i 5 minutter, derefter tilsættes 5 ml RPMI-medium + FBS at inaktivere trypsin.
3. Harvest og tæller celler i et hæmocytometer. Resuspender i phenolrødt-frit DMEM ved en målkoncentration på 5 x 10 ⁷ celler / ml, eller ca 200 pi pr kolbe.
4. Tilsæt 15% reduceret vækstfaktor Matrigel (BD Biosciences) og hold den celle suspension på is indtil implantation.

2.. Tumorimplantering

1. Bedøve fire uger gamle kvindelige NCR / Nu mus ved hjælp af 3% isofluran og vente ca 5 min for at sikre dyb anæstesi. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
2. Læg de celler (100 pi per tumor) i en 1 ml sprøjte og vedlægge en 27 1/ 2 gauge nål.
3. For hver af to bilaterale bagben flanke injektionssteder, løft huden forsigtigt med en pincet til at gøre et telt og injicere celler på basen. Passe på ikke at trænge for dybt, producerer blod. Brug en pincet til forsigtigt at fjerne sprøjte uden sprøjt.
4. Overvåge tumorvækst dagligt i 10 - 20 dage, indtil en tumor diameter på 2 - 4 mm er nået.

3.. Bakterier Forberedelse

1. Start en overnight kultur af bakterier i 3 ml LB medier + Ampicillin fra en -80 C fryser bestand eller nedkølet plade. I dette eksperiment brugte vi S. typhimurium stamme ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. I morgen, fortynde kulturen 1:100 ind filtreret LB og vokse til OD600 0,4-0,6.
3. Spin ned og vaskes 3 gange i phosphatbufret saltvand (PBS) og resuspender i en endelig OD600 på 0,1 (ca. 1 x 10 ⁷ celler / ml).

4.. Bakterier Injection

1. Anesthetize dyret end position på siden med halen peger mod din dominerende hånd. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
2. Dilate halevenen med varmt vand eller en varmelampe.
3. Læg de bakterier (100 pi per mus) i en 1 ml sprøjte og bøj spidsen blot mindre end 90 grader.
4. Juster sprøjten med halen vene, trænger til en overfladisk dybde (skal føle nogen modstand) og injicere bakterier. Observere bloodflow forskydning for en vellykket injektion.

5.. Mus Imaging

1. Anesthetize dyr induktion kammeret derefter placere hver mus på imaging-platformen. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi. Opretholde en præcis positionering for at sikre kvantitative resultater mellem tidspunkter.
2. Billed dyr ved hjælp af IVIS Spectrum billeddannende system (Caliper Life Sciences). Hvis imaging mere end 1 dyr, sted lysbarrierer mellem dem for at undgå cross-illumelse. Dyr bør afbildes først på den ventrale side at bekræfte lokaliseringen af ​​bakterier.
3. Billed dyr dorsalt hjælp IVIS hver 2 timer for varigheden af ​​forsøget (36 timer). Generer et tidsforløb for en given ROI.

6.. Kvantificering bakteriel Biodistribution

1. Afliv dyr ved hjælp CO ₂ og sted på ryggen på en absorberende ble.
2. Drej dyret at blotlægge de to hind flank subkutane tumorer. Skær den omkringliggende hud væv til at adskille og fjerne tumorer. Holding tumoren med en pincet, fjern skindet ved hjælp af en omvendt saks bevægelse. Når størstedelen af ​​huden er blevet adskilt, fuldt fjerne tumoren med en pincet.
3. Placer organer i tarerede mikrocentrifugerør. Da massen af ​​disse rør kan variere betydeligt, er det vigtigt at pre-vejes til kvantitative resultater.

7.. Kvantificering bakteriel Biodistribution

1. For hvert tidspunkt, punktafgifter og afveje tumorer.
2. Tilsæt 500 pi PBS + 15% glycerol og homogeniseres ved hjælp af en Tissue-Tearor (Biospec). Skyl homogenisatoren 3 gange med ethanol mellem prøverne.
3. Generere seriefortyndinger og plade for bakteriel koloni tælling. Til tallerken flere fortyndinger på en enkelt plade bruge pre-delt plader.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol, er vi i stand til at generere data på in vivo vækst og genekspression dynamik tumor målrettede bakterier. Den samlede arbejdsgang er opsummeret i figur 1..

I den første fase, injicere vi bakterier (grøn) og image dyret ved hjælp IVIS at måle genekspression med luminescens (blå) som en reporter.

Så i den anden fase, vi punktafgifter, blandes og plade tumorer for kolonitællinger til at bestemme antallet af bakterier vokser i tumoren.

Bioluminescens genereret af bakteriestammer er visualiseret under anvendelse IVIS (figur 2). Signal stiger med injiceret dosis, med et minimum koloniserende dosis omkring 5 x 10 ⁵ (figur 2A). I alle tilfælde er svækkede bakterier kun i stand til enten specielt kolonisere tumorer eller undlader at vokse i de mus. Signal er kvantificeret ved hjælp af udstråling enheder normalize for eksponeringstid, hvor typiske værdier for 10 ^ 6 eller højere er tegn på kolonisering.

For en given infektion. Signal øges med tiden mere end 24-48 timer (figur 2B) Den maksimale debut er omkring 36 timer efter injektion, men timingen kan variere afhængigt af stammen og plasmid anvendes. Vær sikker på at placere musen på nøjagtig samme måde hver gang for at sikre kvantitative resultater.

I det næste sæt af eksperimenter, er bakteriel biodistrution kvantificeres at måle væksten af bakterier over tid (figur 3). Levedygtige bakterier i tumorer kvantificeres ved udskæring og homogenisering af tumor og udpladning på seriefortyndinger (figur 3A). Andre organer kan også kvantificeres på samme måde. Her har vi brugt milten, eftersom tumor-milt ratio er et typisk mål for bakteriel specificitet ^{21, 22.}

Disse tæller tillade os at måle den bakterielle befolkningning over tid (figur 3B). Til venstre, kan vi se, at antallet af bakterier vokse støt i tumoren under hele forsøget, med en fordobling tid 1-3 timer, betydeligt langsommere end i batchkultur eksperimenter. Denne reducerede sats er sandsynligvis på grund af de dårlige næringsstoffer forhold i tumor miljø. Til højre har vi kvantificeret tumor-milt forholdet og konstatere, at det øger hele forsøget. Denne konstatering udviser specificitet, idet milten tæller er væsentlige konstant, mens bakterier fortsætte med at vokse i tumoren.

Figur 1. Skematisk af den samlede eksperimentelle proces. (A) Bakterier bliver injiceret på halen-vene og specifikt kolonisere tumorer. (B) På hvert tidspunkt, måles tumorer udskæres,homogeniseret, og belagt for kolonitællinger. Genoptrykt med tilladelse ^25. Ophavsret 2012 American Chemical Society.

Figur 2. Whole-animalsk luminescens imaging ved hjælp IVIS. (A) Signal stiger med injektion dosering og (b) tid. Tilpasset med tilladelse ^25. Ophavsret 2012 American Chemical Society.

Figur 3. Plating og koloni tæller at måle vækstdynamik. (A) Seriefortyndinger tillader individuelle kolonier der skal tælles for et repræsentativt milt prøve (nederst). (B) Ved at følge disse tællinger, kan vi skabe in vivo population foranstaltninger bakterier inde tumorer ( som i b </ Strong>) antallet af celler med og uden plasmidet (som i c), og tumor til milt-forhold (som i d). Tilpasset med tilladelse ^25. Ophavsret 2012 American Chemical Society.

Discussion

Hjælp af denne procedure, er vi i stand til at generere tidsforløb for væksten og genekspression dynamik af bakterier koloniserer tumorer. Mens disse målinger rutinemæssigt udføres in vitro i batchkultur eller mikrofluidiksystemer enheder, de er meget sværere at udføre in vivo.

Der er flere ændringer, der kan anvendes til disse metoder. Mens vi brugte OVCAR-8 cellelinien at generere vores musemodeller, kan en række andre cellelinier anvendes tilsvarende. For eksempel kan luciferized cellelinier anvendes som muliggør 3D colokalisering af tumor og bakteriel luciferase kanaler. Derudover kan mens vi anvendte en bilateral hind flanke model, et forskelligt antal og placeringer af injektionssteder anvendes til frembringelse modeller til at studere forskellige fænomener. For eksempel, hvis tumorstørrelse en vigtig variabel, kan serielle fortyndinger af celler fremstilles og injiceres til forskellige steder samtidigt, genererer smaller-og i større tumorer. Endelig mens vi brugte S. typhimurium stammen ELH430, andre stammer af S. typhimurium eller andre bakterier, såsom C. novyi, E. coli, V. cholorae, kan B. longum anvendes ækvivalent med disse metoder, selvom kimtal til injektion kan være nødvendigt at justere.

De mest kritiske trin i denne protokol indebærer oprettelse af musens kræft model og forberedelse og injektion af bakterier. For oprettelsen af ​​kræft-modellen vil præcision i celletal og koncentration, injektionsvolumen og injektionsstedet placering i høj grad øge sammenhængen i de genererede tumorer. Vi har fundet, at tilsvarende størrelse, formet og placeret tumorer skabe de mest kvantitativt sammenlignelige data. Til fremstilling af bakterier, er det afgørende at helt vaske dem før injektion og styre for bakterier koncentration, volumen og injektionsstedet omhyggeligt. Disse skridt er nødvendige for at Avoid overdreven immunologiske konsekvenser af injektion, og til at opretholde kvantitativ sammenligning mellem separate musemodeller. Da antallet af bakterier, der kommer ind i tumoren er en lille brøkdel af den injicerede dosis, kan variationer i antallet af injicerede bakterier mellem mus resultere i dramatiske forskelle på koloni progression. For yderligere information, se adskillige yderligere referencer på bakteriel forberedelse til kvantitativ in vivo studier, ^{3, 4,}

Mens disse teknikker er meget tilpasningsdygtige til en række specifikke undersøgelser, nogle begrænsninger eksisterer for udvidelse til visse applikationer. For eksempel kan intravenøs levering af høje kimtal ikke være ønskeligt for visse bakterier og / eller musemodeller grund immunologisk virkning. Et alternativ administrationsvej er oral levering (sonde), en teknik, der er beskrevet på JOVE ^23.. Derudover kan time-lapse billeddannelse være ganske arbejdskrævende afhængigt specific eksperiment længde, tid-opløsning og udstyr til rådighed. Automatisering af imaging-processen ville afhjælpe mange af disse byrder, men introducerer også nye tekniske udfordringer. Mus livstegn såsom puls, åndedræt sats, og temperaturen skal løbende overvåges af ekstra udstyr. Derudover, for længerevarende anæstesi, skal øjensalver anvendes til at opretholde tilstrækkelig fugt. Endelig skal niveauet af bedøvelsesmiddel leveret til musen justeres løbende for at opretholde den rette dybde af anæstesi. Et lukket loop control system, der integrerer mus vitale målinger med bedøvelsesmiddel leveringen ville i høj grad lette denne proces.

Mens syntetisk biologi har opnået stor succes ^{17, 19, 20,} anvendelse af manipuleret gen kredsløb til in vivo-anvendelser vil kræve kvantitative, in vivo tidsforløb at informere design principper. S. typhimurium er en glimrende stamme til klinisk syntetisk biollogi til cancerbehandling, da det svarer til E. coli specifikt koloniserer tumorer, og har vist sig sikkert i humane kliniske forsøg ^{6, 12, 14, 22.} Derudover har nyere undersøgelser vist, at mange offentliggjorte kredsløb fungerer i S. typhimurium uden ændringer ^24.. Brug den eksperimentelle platform er beskrevet her, vi for nylig beskrev, hvordan dynamisk in vivo udtryk profiler kan programmeres ved hjælp af iboende ustabilitet plasmidvektorer ^25. Desuden har nyere forskning udviklet nye metoder til stabilt fastholde plasmidvektorer in vivo ^23.

Mens luciferase er en fælles reporter anvendes til in vivo billeddannelse til dens følsomhed ^5, der er eksempler på gode studier på kvantitative in vivo genekspression hjælp GFP ^26.. Brug GFP ville give forskeren at studere rumlige-temporale dynamik de enkelte bakterier in vivo.Og mens vi brugte en subkutan model udvide disse undersøgelser mod mere relevante modeller af kræft vil yderligere øge deres prædiktive effekt ^7. Fremtidige studier som dette kan muliggøre en næste generation af in vivo syntetisk biologi til kliniske anvendelser.

Udvikle både eksperimentelle og beregningsmæssige teknikker i koncerten vil være afgørende for ingeniør in vivo genetiske kredsløb. Datamodellering hurtigt kan sonde systemets parametre til at udforske mulige udgange, men skal forblive tæt knyttet til eksperimentelle resultater til at forblive relevant. Hidtil har disse resultater været vanskeligt at opnå kvantitativt, dels på grund af mangel på metoder til at studere genetiske kredsløb in vivo.

Med udgangspunkt i denne platform, vil fremtidige applikationer omfatter manipuleret gen kredsløb, der yderligere udvider rækken af ​​udtryk dynamik, sansning tumor-specifikke stimuli og selvregulerende last produktion efter behov. Som det sofistikerede af disse in vivo kredsløb stiger, kræves kravene om kvantitative data til at tune dem vil også stige. Vi mener, at de metoder, der er beskrevet her, sammen med nye innovationer i langsigtet mus billeddannelse, vil gøre denne proces muligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulin Syringe	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610