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Neuroscience

Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

doi: 10.3791/50557 Published: March 31, 2014

Summary

Nous décrivons l'utilisation de colorants styryles FM à l'image synaptique recyclage des vésicules dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles. Ce protocole peut être appliqué non seulement à évoquer, mais aussi spontané et activités synaptiques miniatures. Le protocole élargit le choix des événements synaptiques qui peuvent être évaluées de manière efficace.

Abstract

Les vésicules synaptiques dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles subissent l'exocytose et l'endocytose. Ce recyclage des vésicules synaptiques peut être efficacement analysé en utilisant des colorants styryle FM, qui révèlent le chiffre d'affaires de la membrane. Des protocoles classiques pour l'utilisation de colorants FM ont été conçus pour l'analyse suivante neurones stimulée (évoqué) l'activité synaptique. Récemment, les protocoles sont devenues disponibles pour l'analyse des signaux FM qui accompagnent les activités synaptiques plus faibles, tels que les événements spontanés ou décoratifs synaptiques. L'analyse de ces petits changements dans les signaux FM nécessite que le système d'imagerie est suffisamment sensible pour détecter de petites variations de l'intensité, pour l'instant que les changements d'artefact de grande amplitude sont supprimées. Nous décrivons ici un protocole qui peut être appliquée à évoqué, spontanée, et les activités synaptiques miniatures, et en utilisant des neurones hippocampiques en culture, par exemple. Ce protocole comporte également un moyen d'évaluer le taux de photoblanchiment des colorants FM, comme il s'agit d'une importantesource d'artefacts lors de l'imagerie de petits changements dans l'intensité.

Introduction

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La fonctionnalité des vésicules synaptiques est un déterminant important de la transmission synaptique. Ces vésicules libèrent des neurotransmetteurs quand ils fusionnent avec la membrane plasmique présynaptique (exocytose), et ils seront prêts pour un autre cycle de libération après avoir été régénéré à partir de la membrane plasmique (endocytose) et rechargé avec neurotransmetteur. La recherche sur la dynamique des mécanismes sous-jacents et le recyclage des vésicules synaptiques a été fortement accélérée par l'introduction de colorants styryles FM 1. Ces molécules bipolaires, qui ont chargés positivement groupes de tête hydrophiles et queues hydrophobes (plusieurs colorants dans la figure 1A, stereoview de FM1-43 dans la figure 1B), peuvent réversible entrer et sortir de membranes lipidiques sans les imprégner. Groupes de colorants FM partagent des caractéristiques similaires qui influent sur la plage de la lumière qu'ils émettent. Par exemple, FM2-10, FM1-43, et FM1-84 ont une double liaison entre les deux composés cycliques et shoémission verte w. La différence entre eux est la longueur de la queue hydrophobe, qui détermine son hydrophobie et donc la vitesse de sortie de la membrane (décloisonnement). Dans les cas de FM5 et FM4-95-64, trois doubles liaisons relient les composés cycliques, et ils montrent émission dans le rouge. Ces colorants diffèrent en ce qui concerne leurs parties hydrophiles. Dans tous les colorants FM, l'intensité de fluorescence augmente quand ils sont insérés dans les membranes biologiques, en raison d'une augmentation du rendement quantique dans l'environnement hydrophobe par rapport à l'environnement hydrophile. Ainsi, les variations de l'intensité FM représentent les variations de la valeur de la membrane. Les différentes couleurs (spectres d'émission) et hydrophobicités font la FM teint un outil de recherche polyvalent dans le recyclage des vésicules synaptiques.

Sur la base de ces caractéristiques, les colorants FM sont principalement utilisés selon le schéma suivant dans l'analyse de recyclage des vésicules synaptiques (figure 2). Neurons sont baignées dans une solution extracellulaire contenant le colorant FM, ce qui lui permet d'être pris dans des vésicules synaptiques (SVS) car ils forment par endocytose (coloration). Le colorant est ensuite lavé par application d'une solution de colorant extracellulaire libre, ce qui révèle les terminaisons nerveuses fonctionnelles, c'est à dire que ceux subissant une endocytose activement contiendra un groupe de vésicules synaptiques qui sont chargés avec le colorant (figure 2 du bas). Exocytose ultérieur conduit à la perte du colorant FM à l'espace extracellulaire et une perte concomitante de la fluorescence (de décoloration; due à la fois à la décloisonnement à un environnement hydrophile et diffusion en dehors du site de l'exocytose). Par conséquent, les changements dans FM intensité de fluorescence sont des indicateurs de la vésicule synaptique exo-et endocytose.

Colorants FM ont été utilisés pour colorer et décolorer les vésicules synaptiques dans divers organismes et préparations 2,3. Les exemples incluent neur mammifèrescultures onal 4-9, des tranches de cerveau de mammifères 10,11, 12,13 jonctions neuromusculaires, les neurones bipolaires de la rétine 14,15 et cellules ciliées de la cochlée 16.

En général, dans ces expériences, les colorations et décoloration sont déclenchées par la stimulation largement les neurones (activité évoquée). Récemment, cependant, de la vésicule synaptique recyclage en réponse à la stimulation faible a également été analysée, de même que le recyclage en l'absence d'un stimulus externe (de l'activité synaptique spontanée et miniature) 9,17-19. Activités synaptiques spontanés et miniatures sont définis comme ceux qui se produisent en l'absence de stimuli externes, avec l'ancien impliquant la décharge spontanée de potentiels d'action (figure 3). Ces activités synaptiques faibles sont associés à de faibles changements de signaux FM que celles déclenchées par une vaste stimulation. La mesure exige que les changements dans Déess FMintensité rence reflètent fidèlement l'exocytose des vésicules synaptiques ou endocytose mais les changements ne artéfactuelles en intensité. L'une des causes de l'artefact est la présence d'une coloration non spécifique de la membrane de plasma par des colorants FM. Lavage progressif de cette composante va conduire à un changement progressif dans l'intensité de fluorescence mesurée, qui sera attribué à tort à des activités synaptiques. Ce facteur peut être réduite par des méthodes appropriées (voir Protocole). La cause la plus notable de l'artefact est le photoblanchiment de colorant FM retenu dans les vésicules synaptiques. Les changements liés à l'intensité photoblanchiment-FM doivent être petites par rapport aux biologiques (synaptiques) les changements qui sont évalués. Le développement récent des appareils sensibles, par exemple la caméra dispositif à couplage de charge d'électrons multipliant (EMCCD), permet de réduire photoblanchiment en raccourcissant la durée d'exposition et l'affaiblissement de l'intensité de la lumière utilisée pour exciter le fluorophore. Une autre cause de l'artefact est une dérive in le niveau de focalisation du microscope optique. La dérive de mise au point au cours d'une session de formation d'image peut être causée par des effets mécaniques ou thermiques, et à tort entraîner un changement dans l'intensité de fluorescence mesurée.

Nous décrivons ici des protocoles et des équipements qui font qu'il est possible d'utiliser des colorants FM pour analyser recyclage des vésicules synaptiques, même dans le contexte de faible ou pas de stimulation, en particulier, l'activité synaptique miniature. Nous montrons des exemples de la coloration et décoloration de vésicules synaptiques lors d'événements évoqué et spontanées, en utilisant les neurones de rongeurs hippocampe en culture, et l'imagerie de la phase de décoloration. Nous démontrons également comment évaluer le degré de photoblanchiment FM colorant, en l'absence de toute perte de colorant FM en raison des activités synaptiques.

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Protocol

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Une. Culture primaire de neurones du cerveau des mammifères

Toutes les procédures animales réalisées dans cette étude sont approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Iowa.

  1. Préparer la culture de la cellule dissociée des régions CA3 de l'hippocampe-CA1 de souris ou des rats aux jours postnataux 0-1 19,20. Plaquer les cellules de l'hippocampe sur des lamelles de 12 mm d'épaisseur (numéro 0) préconfigurées avec la couche nourricière de cellules gliales de rat, dans des boîtes de 24 puits, et à une densité de 12 000 cellules / puits.
  2. Culture des neurones de l'hippocampe pendant au moins 8 jours pour les terminaisons nerveuses fonctionnelles à développer 21. Nous utilisons les neurones sur 11-14 jours in vitro lorsque les terminaisons nerveuses individuelles sont relativement isolés, sans trop de clustering. Les neurones peuvent être utilisés pour des expériences allant jusqu'à environ 21 à 28 jours in vitro, par exemple Willig et al. Nosyreva 22 et 23 et Kavalali.
  3. Pourétudes fonctionnelles, évaluer lamelles (avant coloration) pour les indicateurs de neurones sains en utilisant la microscopie lumière transmise (par exemple contraste optique de phase à un grossissement de 10-20x). Les indicateurs de bonne santé: une couche uniforme gliale de cellule, une marge cellulaire clair autour des neurones, les dendrites étendues sans structures de perles, un manque de soma en cluster, et un manque de neurites groupés.

2. Chargement du vésicules synaptiques avec le colorant FM (coloration)

  1. La coloration due à l'activité synaptique évoquée par une stimulation de champ électrique (concerne les potentiels d'action)
    1. Préparez coloration solution 1 en ajoutant le colorant FM pour une solution sans colorant à base d'HEPES, la solution de Tyrode par exemple (voir SOLUTIONS pour plus de détails). La concentration de colorant FM est de 10 uM FM1-43 et 2,5 uM FM4-64. Gammes de concentration typiques sont: 2-15 uM FM1-43, ou 2,5-20 uM FM4-64 3,6. Pour les expériences nécessitant la suppression de récidivel'activité synaptique glutamatergique et l'induction de la plasticité synaptique, ajoutent en outre des antagonistes des récepteurs ionotropiques du glutamate: les récepteurs AMPA (par exemple, 10 uM CNQX) et des récepteurs de NMDA (par exemple, 50 pM AP5).
    2. Transférer une lamelle couvre-objet avec des cellules à partir du milieu de culture à la chambre d'imagerie pré-rempli avec la solution de Tyrode brut. Nous utilisons une chambre d'imagerie avec les électrodes de stimulation attachés aux parois latérales (fils de platine séparées par 6,3 mm, RC-21BRFS). Cette chambre est conçue comme une chambre d'imagerie fermée, mais on l'utilise en tant que chambre ouverte (c'est à dire sans lamelle couvre-objet en haut), avec un volume de bain de ~ 200 ul. Pendant le transfert, ne pas exposer les cellules cultivées à l'air, et ne pas pincer les cellules cultivées avec la pince à épiler (choisir la lamelle en place du périmètre plutôt que près du centre).
    3. Perfuser la chambre de formation d'image avec une solution de Tyrode brut à la température ambiante (23-25 ​​° C).
    4. Appliquer coloration solution 1 par coperfusion Instant.
    5. Évoquer l'activité synaptique par l'application d'impulsions électriques. Pour la coloration maximale du pool total de recyclage des vésicules synaptiques dans les neurones de l'hippocampe, stimuler les cultures à 10 Hz pour 60-120 sec 24. Lorsque vous essayez d'atteindre une efficacité maximale de stimulation de champ, garder quelques éléments à l'esprit. 1) La hauteur de la solution du bain doit être aussi faible que possible, tout en conservant les neurones et les électrodes de stimulation entièrement immergés dans une couche mince de la solution de Tyrode (de façon à conserver les neurones vivants et pour obtenir un champ électrique homogène). 2) L'intensité du courant et la durée doivent être optimisés en utilisant un indicateur de l'excitabilité neuronale, par exemple fluorescent Ca 2 + imagerie; dans notre cas, un courant constant de 30 mA l'intensité et 1 msec donne des résultats fiables. 3) La solution du bain doit être appliqué à un débit constant au cours de la stimulation, la stimulation électrique conduit à l'électrolyse, ce qui provoque des protons (H Hanks, par exemple avec du rouge de phénol).
    6. Laissez les neurones dans une solution de coloration 1 pour un montant supplémentaire de 60 secondes après la stimulation de champ est terminée, de sorte que post-stimulus endocytose sera achevée 25.
    7. Laver la solution de coloration de la chambre d'imagerie par perfusion avec une solution de rinçage 1, la solution de un Tyrode sans colorant-plus des antagonistes des récepteurs AMPA et les récepteurs NMDA (voir section 2.1.1), et un bloqueur de tension dépendant de canaux Na + ( par exemple de 0,5 à 1 uM de tétrodotoxine, TTX). La combinaison d'inhibiteurs supprime la perte de colorant FM par l'activité synaptique spontanée. Afin de maximiser l'efficacité du lavage, augmenter le débit de perfusion (<em> par exemple, jusqu'à 6.5 ml / min) pendant 1 à 2 min, et ajouter un bolus (par exemple 1 ml) de solution de rinçage 1 directement à la chambre d'imagerie ouvert manuellement, à l'aide d'une pipette. Contrôler la force et la direction de la perfusion manuelle, afin de ne pas perturber les neurones en culture.
  2. La coloration due à l'activité synaptique évoquée par solution haut de K + (ne concerne pas les potentiels d'action).
    1. Préparer coloration solution 2 en ajoutant le colorant FM à la solution de haute K + Tyrode. Plus précisément, préparer une solution de Tyrode modifiée avec 45 mM de KCl, par substitution équimolaire de KCl pour NaCl. Si nécessaire, ajouter des antagonistes de l'AMPA et NMDA. Cette solution haute-K + se dépolariser les neurones en permanence, permettre influx de Ca2 + dans les terminaisons nerveuses, et de lancer l'exocytose des vésicules synaptiques dans la mesure maximale 26. Des concentrations plus élevées (70-90 mm) ont également été utilisés dans d'autres rapports, par exemple Klingauf et al. 27 und Richards et al. 28
    2. Transférer une lamelle couvre-objet avec des neurones en culture à partir du milieu de culture à la chambre d'imagerie pré-rempli avec la solution de Tyrode brut.
    3. Colorer les neurones à la température ambiante pendant 1 à 2 min par application d'une solution de coloration à deux perfusion constante ou à l'aide d'une pipette de 26,28. Dans ce dernier cas, la concentration finale de colorant doit être contrôlée par addition d'un volume connu de solution de coloration à deux à un volume connu de solution sans colorant.
    4. Laver la solution de coloration de la chambre d'imagerie, comme décrit dans la section 2.1.7.
  3. La coloration due à l'activité synaptique spontanée et miniature.
    1. Préchauffer la solution à base de bicarbonate (par exemple, le Milieu Essentiel Minimum, MEM) à 37 ° C en plaçant dans l'incubateur de culture pendant plus de 60 min.
    2. Pour la coloration en fonction de l'activité synaptique spontanée, préparer la solution de coloration 3 en ajoutant le colorant FM pour MEM. Pour la coloration sur la base de miniature activité synaptique, préparer la solution de coloration en ajoutant 4 TTX à la solution de coloration 3.
    3. neurones les taches en transférant une lamelle couvre-objet avec des neurones en culture à partir du milieu de culture pour la coloration solution 3 ou 4, et de les laisser dans la même solution de coloration à 37 ° C pendant 10 min.
    4. Rincer la lamelle brièvement dans la solution 1 rinçage.
    5. Transférer la lamelle couvre-objet pour une solution de rinçage dans une chambre d'imagerie. Gardez à l'esprit ce qui suit. 1) Les cellules ne doivent pas être exposées à l'air, si nécessaire, transférer la lamelle couvre-objet directement à la chambre de formation d'image sans rinçage. 2) Les neurones peuvent être colorés à la température ambiante en remplaçant la solution de coloration 3 ou 4 avec une solution à base d'HEPES. 3) Les neurones peuvent être colorées pour l'activité synaptique évoquée dans le cadre de la solution de haut-K + à l'aide de cette méthode, en remplaçant la solution de coloration 3 ou 4 avec une solution de coloration à deux et en réalisant les étapes suivantes à la température ambiante.
    6. Laver la solution de coloration sur la formation d'imagechambre comme décrit dans la section 2.1.7.

3. Lavage du colorant FM

  1. Après coloration neuronale et lavage initial par l'une des méthodes décrites ci-dessus (section 2.1.7), continuer à perfuser la chambre de formation d'image avec une solution de rinçage pendant 5-10 min à température ambiante. Cela permettra d'éliminer le colorant FM à partir de la membrane plasmique et la solution extracellulaire. Dans le cas de notre chambre d'imagerie, le taux de perfusion bain est 600-1.200 ul / min. Le lavage peut également être réalisée en l'absence de Ca 2 + extracellulaire FM pour supprimer la perte de colorant en raison des activités synaptiques 17. Les lavages peuvent être améliorées par une brève application de Advasep-7, une cyclodextrine modifiée qui sert de fixateur de colorants FM à partir de la membrane de plasma de 29 à 31. Il est essentiel de garder tout Advasep-7 l'exposition de courte durée (par exemple 5 secondes dans le cas de la culture monocouche) pour éviter à la fois la réduction de l'intensité des points lacrymaux FM 31 et compromettre la HEAlth des cellules. La fluorescence de FM1-43 dans la membrane de plasma peut également être supprimée par une application d'un agent d'extinction de la sulforhodamine 101 (50 à 100 pM), qui ne pénètre pas dans les vésicules synaptiques 32.

4. Recherche d'un terrain d'image optimale lors du lavage

  1. Vérifiez que les cellules dans le champ à de représentation sont en bonne santé, en utilisant la microscopie de lumière transmise avec un objectif à fort grossissement et haute ouverture numérique (par exemple 40X). Dans cette section, nous continuons à utiliser un microscope inversé (Eclipse Ti, Nikon) équipé de contraste de phase ou d'interférence différentiel contraste optique. Ce microscope est également équipé avec Perfect Focus System (PFS) qui permet, correction de mise au point continue en temps réel, qui surmonte l'accent dérive du microscope. Cette fonction est essentielle pour l'imagerie time-lapse pendant décoloration avec le même plan de focalisation.
  2. Vérifiez que la coloration a été efficace, en utilisant l'optique de fluorescence. Avagrégats oid de puncta FM moins qu'ils ne soient la cible de la recherche, car boutons individuels seront difficiles à discerner. Faites attention à la forme des points lacrymaux FM: si la plupart des boutons colorés apparaissent comme des colliers de perles circulaires, ils pourraient représenter les terminaisons nerveuses malsaines. Réduire l'exposition des neurones à forte excitation de fluorescence afin d'éviter photoblanchiment.

5. Déchargement FM colorant du Synaptic vésicules (de décoloration)

  1. Décoloration due à l'activité synaptique évoquée par une stimulation de champ électrique.
    1. Laver TTX en perfusant les neurones abondamment avec une solution de rinçage 2 (identique à une solution de rinçage, mais sans TTX). Confirmer l'efficacité de TTX lavage dans des expériences séparées, en utilisant les mêmes paramètres de lavage (taux de perfusion et durée), par exemple par fluorescence Ca 2 + imagerie de cytoplasmiques Ca 2 + transitoires induits par la stimulation de champ, ou par l'enregistrement de patch-clamp de voltscourants Na + dépendant de l'âge.
    2. Lancer l'imagerie des colorants FM. Pour imager FM1-43 ou FM4-64, utiliser 520 nm ou 650 filtres longue passe d'émission nm, respectivement, et un filtre d'excitation de 490 nm. Acquérir les images chaque 1-2 sec, en utilisant un court temps d'exposition (par exemple 10-20 ms), faible intensité d'excitation (par exemple 5-10% de la puissance LED), et une sensibilité élevée (par exemple, avec un gain de EM). Réduire photoblanchiment des colorants FM en réduisant le temps d'exposition et l'intensité de l'excitation de fluorescence. Réduire l'accent dérive du microscope en tournant sur le système mise au point parfaite.
    3. Stimuler les neurones dans une solution de rinçage 2, en utilisant le terrain stimulation (par exemple à 10 Hz pendant 120 secondes) 20.
    4. Appliquer plusieurs cycles de stimulation, avec intermédiaires des périodes de 1-2 min de repos, d'épuiser toutes les vésicules synaptiques recyclage de colorant FM. Ceci est important lors de l'évaluation de la taille du pool total de recyclage des vésicules synaptiques qui ont été colorées avec des colorants FM en ee état ​​antérieur 20,33.
  2. Décoloration due aux activités synaptiques évoqués en l'absence de potentiels d'action.
    1. Lancer l'imagerie du colorant FM.
    2. Appliquer les réactifs de stimulation dissous dans une solution de rinçage 1 ou 2. De tels réactifs comprennent: KCl (solution à haute K +, par exemple 45 mM) 26, ionomycine (un ionophore Ca 2 + qui augmente la concentration en Ca2 + intracellulaire en permettant influx de Ca2 + dans la cellule à partir de la solution extracellulaire, par exemple, utilisé à 5 M) 20,34, et le saccharose (une solution hypertonique qui stimule la libération des vésicules synaptiques de la piscine facilement détachable, par exemple, utilisé à 500 mM) 35,36. Utiliser un système de perfusion rapide, local pour un contrôle temporel fiable dans l'application des réactifs, par exemple le système SF-77B de la Warner Instruments 37, ou système Lyre 38-40.
  3. Décoloration due à spontanée et miniature activité synaptique.
    1. Pour la décoloration due à l'activité synaptique spontanée, laver TTX comme ci-dessus (section 5.1.1), en utilisant une solution de rinçage 2. Lancer l'imagerie des colorants FM en perfusion neurones avec une solution de rinçage 2. Pour la décoloration due aux activités synaptiques miniatures, commencer l'imagerie des colorants FM, tout en continuant à perfuser les neurones avec une solution (avec TTX) de rinçage.
    2. Après décoloration basée sur l'activité spontanée ou miniature, identifier les terminaisons nerveuses fonctionnelles par décoloration par l'activité synaptique évoquée. L'activité peut être provoquée par l'une des procédures décrites ci-dessus. Ce processus d'identification est nécessaire parce que les structures colorées peuvent être des personnes autres que les terminaisons nerveuses fonctionnelles (par exemple le recyclage lentement endosomes ou des vésicules astrocytes) et une grande quantité de décoloration par les aides d'activité évoqués dans ce processus.

6. L'évaluation du taux de photoblanchiment Colorants FM

  1. Colorer les terminaisons nerveuses avec FM colorant aldéhyde-fixable (par exemple FM1-43FX, FM4-64FX). Ceci peut faire en utilisant la méthode de coloration spontanée ou évoquée miniature décrit ci-dessus, et en remplaçant le colorant FM FM avec un colorant pouvant être fixé.
  2. Laver le colorant FM fixable comme décrit dans la section 2.1.7.
  3. Fixer chimiquement des neurones par le transfert de la lamelle de la solution de fixation: 4% de paraformaldéhyde et de 4% de saccharose dans la solution de Tyrode à 30 min à 4 ° C. L'intensité de fluorescence du colorant FM fixable sera conservée après la fixation chimique.
  4. Laver le fixatif pendant 10 min dans une solution de Tyrode, par le transfert de la lamelle de la solution de Tyrode fraîche deux fois.
  5. Transférer la lamelle couvre-objet dans la solution de Tyrode fraîche dans la chambre d'imagerie.
  6. Lancer l'imagerie du colorant FM peut être fixée à l'aide du même ensemble de paramètres d'imagerie comme pour les neurones vivants. Il est important de rincer la chambre d'imagerie très bien après l'utilisation de tout spécimen fixes chimiquement, cartout en restant fixateur peut affecter ultérieures des expériences d'imagerie en temps réel des cellules réalisées dans la même chambre. Alternativement à l'imagerie cellulaire fixe, les cellules vivantes colorées peuvent être visualisés pour évaluer le taux de photoblanchiment. Toutefois, il convient de garder à l'esprit qu'il est difficile de bloquer l'activité synaptique miniature aiguë, par exemple, la fréquence de l'activité miniature peut être réduite à environ 50% en enlevant le Ca2 + extracellulaire 23, mais ce n'est pas une complète blocus.
  7. A la fin de chaque session d'imagerie, l'acquisition d'une image de fond pour l'évaluation de la valeur absolue de l'intensité de fluorescence FM. L'intensité des points lacrymaux FM représente non seulement le signal vrai à partir des colorants FM dans les terminaisons nerveuses, mais également le bruit de fond à partir de 1) les cellules gliales qui sous-tendent la culture monocouche neuronal, 2) la lamelle couvre-objet et les composants optiques (lentilles, par exemple l'objectif, des filtres et un miroir), et 3) le détecteur (caméra EMCCD). Le bruit de fond est assessed dans les régions nonstained du champ imagé. Lorsque ces régions sont limitées dans l'espace ou hétérogène dans l'intensité, la remplacer par une image avec l'obturateur de l'appareil fermé et acquérir le bruit du détecteur, même si ce n'est pas une méthode idéale. Acquérir environ 10 images en utilisant les mêmes paramètres d'imagerie.

7. Analyse de l'image

  1. Importer les données acquises dans le logiciel d'analyse d'image comme une pile d'images de séries chronologiques. Nous utilisons ImageJ (WS Rasband, NIH), et les plug-ins associés, par exemple, stabilisateur d'image plug-in (Kang Li) pour corriger un petit degré de mouvement entre les points lacrymaux FM, et Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) pour analyser la série temporelle.
  2. Calculer les variations de l'intensité de la FM, au début et à la fin de la série (AFm). A cet effet, la moyenne des images avant le début de décoloration et après la fin de la décoloration (par exemple, 5 chacun) trames d'image, et générer une image de différence par subtracting eux.
  3. Identifier les terminaisons nerveuses fonctionnels potentiellement en appliquant un seuil d'intensité de l'image de différence, et détecter des pixels dont les intensités sont supérieures au seuil. Un procédé de réglage du seuil est de choisir l'écart-type de l'intensité d'arrière-plan obtenues à partir de la zone de lamelle nu.
  4. Identifier les isolés, les terminaisons nerveuses fonctionnelles que les pixels contigus qui ont été détectés et qui répondent à un critère de taille (nombre minimal et maximal de pixels de contiguïté). Ce processus élimine les bruits de fond et les terminaisons nerveuses agrégés de l'analyse.
  5. Attribuer régions d'intérêts (ROI) sur les groupes de pixels détectés (avec des clusters individuels correspondant à des terminaisons nerveuses individuelles). La variation totale de l'intensité au cours de décoloration (AFm) est un paramètre caractéristique de l'analyse. Cela représente le montant cumulé de l'activité synaptique évoquée, spontanée ou miniature. Exclure ROI si elles présentent une des caractéristiques suivantesvariations de l'intensité en fonction des fins d'expériences: une augmentation pendant l'enregistrement, une baisse soudaine avant la stimulation, ou une longue période de latence après stimulation.
  6. Évaluer le taux de photoblanchiment par l'importation des données de séries chronologiques acquis dans le logiciel d'analyse d'image. La moyenne des images de fond (par exemple avec un volet fermé), et la soustraire de chaque image. Attribuer ROI à puncta FM qui correspondent putative de terminaisons nerveuses, et de mesurer les changements dans l'intensité du retour sur investissement dans le temps.

Solutions

  1. La solution de Tyrode
    • Composition (en mM): 125 NaCl, 2 de KCl, CaCl 2 2, MgCl 2 2, 30 glucose, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
  2. Solution de coloration 1
    • Tyrode solution plus le colorant FM.
    • Cette solution est utilisée pour la coloration, sur la base de l'activité synaptique évoquée par une stimulation électrique.
    • Ajouter les antagonistes des récepteurs AMPA et NMDA receptors si nécessaire.
  3. Solution de coloration 2
    • La solution de High-K + Tyrode plus le colorant FM.
    • Cette solution de Tyrode modifiée est préparée en augmentant la concentration de KCl à 45 mM, par substitution équimolaire de KCl de NaCl.
    • Cette solution est utilisée pour la coloration, sur la base de l'activité synaptique évoquée par dépolarisation continue.
    • Ajouter les antagonistes des récepteurs AMPA et NMDA récepteurs si nécessaire.
  4. Solution de coloration 3
    • Solution MEM plus le colorant FM.
    • Cette solution est utilisée pour la coloration, sur la base de l'activité synaptique spontanée.
  5. Solution de coloration 4
    • Solution MEM plus le colorant FM et TTX.
    • Cette solution est utilisée pour la coloration, sur la base de l'activité synaptique miniature.
  6. Solution de rinçage 1
    • Tyrode solution ainsi que les antagonistes des récepteurs AMPA et les récepteurs NMDA, et TTX.
  7. Solution de rinçage 2
    • Tyrode solution ainsi que les antagonistes des récepteurs AMPA et les récepteurs NMDA, mais sans TTX.

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Representative Results

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A titre d'exemple, nous montrons des résultats représentatifs pour le cours du temps de décoloration des vésicules synaptiques (figure 4). Neurones hippocampiques en culture ont été colorées avec FM4-64, en utilisant l'activité synaptique spontanée (étape 2.3) et lavées avec une solution sans colorant (solution de rinçage 2). L'imagerie montre le cours initial de temps de décoloration utilisant activité spontanée (étape 5.3) (partie initiale de la ligne continue, la figure 4A). Ceci est suivi par l'évolution dans le temps de décoloration en utilisant trois séries d'activité évoquée à une stimulation de champ 10 Hz pendant 120 secondes chacun (étape 5.1). Une façon de mesurer la quantité de décoloration provoquée est illustrée avec une double flèche (AFm évoqués) qui correspond à la taille du pool total de recyclage des vésicules.

Avant la première impulsion a été donnée, il y avait une diminution progressive de l'intensité de la FM (agrandi sur la figure 4B). Cette diminution a été composé de décolorationen raison de l'activité synaptique spontanée (AFm Spont) et photoblanchiment (AFm PB). Lorsque la contribution de photoblanchiment est faible, la variation de la ligne de base preimaging (AFm Spont + PB AFm) peut être utilisée comme une approximation de la quantité de décoloration de l'activité spontanée.

Figure 1
Figure 1. Structures de colorants FM. A. FM teintures part certaines caractéristiques structurelles communes. Les groupes hydrophiles restent en solution aqueuse et les queues hydrophobes permettent les colorants FM à partitionner en membrane. FM2-10, FM1-43 et FM1-84 montrent émission verte, tandis que FM5-95 et FM4-64 montrent émission décalée vers le rouge. B. Stereoview de FM1-43, colorant la FM la plus couramment utilisée. Groupe hydrophile est orientée vers le haut et queues hydrophobes sont orientés vers le bas. Nitratomes Ogen sont de couleur bleue. Pour une autre vue de FM1-43, voir Schote et Seelig 63.

Figure 2
Figure 2. Schéma de principe de l'utilisation d'un colorant FM. Après application sur les neurones, le colorant FM insérée dans la membrane plasmique devient fluorescent (vert), alors que, dans la solution aqueuse est beaucoup moins fluorescent (gris). Une vésicule synaptique (SV) est chargé (souillé) par le colorant FM, lorsqu'il subit une endocytose, l'exocytose typiquement suivante. Lavage du colorant FM en solution extracellulaire permet que les vésicules colorées pour être fluorescent. Par la suite, une vésicule synaptique est déchargé (décolorés) quand il subit l'exocytose et libère le colorant FM donc. Une image ci-dessous illustre une coloration exemplaire des neurones d'hippocampe en culture avec FM1-43 (une superposition de fluorescence et de phase des images à contraste). Il est à noter que, dans le protocole décrit dans le présent document, les points lacrymaux fluorescentes représentent des terminaisons présynaptiques nerveuses (diamètre ~ 1 um dans les neurones centraux typiques) avec des grappes de vésicules synaptiques colorées, pas les vésicules synaptiques individuels (diamètre ~ 40 nm). Par souci de simplicité, ce système représente une idée générale de l'exo-endocytose des vésicules synaptiques. Il peut inclure plusieurs formes de exo-endocytose, telles que la fusion complète effondrement suivie par la clathrine endocytose, le kiss-and-run exo-endocytose transitoire, et l'endocytose en vrac 64. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Trois types d'activités synaptiques étudiés par imagerie FM. L'activité synaptique évoquée nécessite généralement, des stimuli électriques externes. L'activité synaptique spontanée se produit en l'absence de stimuli électriques. L'activité synaptique miniature se produit spontanément sans stimuli électriques et sans potentiels d'action: le plus souvent l'action génération de potentiel est supprimée par un bloqueur de canal Na +, tétrodotoxine dépendant de la tension. D'autres activités incluent l'activité évoquée lorsque l'exocytose est stimulée par une solution high-K + (dépolarisation continue), ionomycine (augmentation continue de la concentration de Ca2 + cytoplasmique), et une solution hypertonique contenant du saccharose (susciter l'exocytose de vésicules dans la piscine facilement détachable), tous ce qui ne nécessitera pas de potentiel d'action tir de vésicules synaptiques à subir l'exocytose. Notez que, dans certaines études, l'activité spontanée est généralement défini pour englober l'activité miniature ainsi.

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Figure 4. Résultat représentatif de décoloration. A. neurones de l'hippocampe en culture ont été colorées par l'activité spontanée avec 2,5 uM FM4-64 pendant 10 min à 37 ° C (étape 2.3), et lavées (protocole n ° 3). Les neurones ont été imagées pendant décoloration à l'activité spontanée (étape 5.3), et trois cycles d'activités évoqués (étape 5.1) (courbe continue, moyenne de n = 25 terminaisons nerveuses). Les barres verticales représentent SEM. L'axe des Y représente l'intensité absolue de FM et "0" représente l'intensité quand un obturateur de l'appareil est fermé. Le montant total de décoloration provoquée est indiqué (AFm évoqués). B. Une vue élargie de la phase initiale de décoloration dans la partie A (courbe continue, barres SEM omis pour plus de clarté). Lors d'une observation de 60 secondes, la détentrice est principalement due à acte spontanéivité (AFm Spont) mais est en partie due au photoblanchiment (AFm PB). L'évolution dans le temps de photoblanchiment de FM4-64 (courbe en pointillés d'épaisseur) a été déterminée dans une expérience séparée par imagerie fixable FM4-64 (protocole n ° 6). Le taux était de 2-3% au cours de 2 min (une seule fonction exponentielle avec une constante de temps de 5,736 sec, déterminé par emboîtement au-dessus de la courbe 9 min) 19. La courbe de photoblanchiment a été établi comme une fonction exponentielle avec une valeur initiale équivalente à celle de l'intensité mesurée de FM4-64. Voir Figure complémentaire S5 dans Kakazu et al. 19 pour le photoblanchiment sur ​​la période plus longue (9 min), et avec la variable intensité d'excitation et le temps d'exposition. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Nous avons décrit les protocoles de coloration et de décoloration des vésicules synaptiques en réponse à évoqué, l'activité synaptique spontanée et miniature, et pour l'imagerie au cours de la phase de décoloration. En plus des protocoles existants, nous avons inclus un nouveau protocole d'observer la décoloration FM sur la base de l'activité synaptique miniature. L'utilisation de ces protocoles, nous l'avons déjà identifié des anomalies dans les neurones en culture à partir d'un modèle de souris de la dystonie de troubles du mouvement. En comparaison à leurs homologues chez les souris de type sauvage, ces neurones ont subi une accélération synaptique exocytose des vésicules dans un 2 temps + dépendante Ca lorsqu'il est stimulé par une forte activité 20. Ces neurones ont également montré l'activité synaptique miniature plus fréquents, comme l'a confirmé par des enregistrements électrophysiologiques de patch-clamp de la libération de neurotransmetteurs 19.

L'aspect critique du protocole pour l'utilisation de colorants FM dans de telles analyses est à Asseart et de minimiser photoblanchiment. Des changements subtils dans l'intensité de fluorescence FM peuvent être évalués de façon fiable si les changements causés par photoblanchiment sont petites par rapport à celles provoquées par l'activité synaptique. Photoblanchiment réduite a aussi le potentiel pour supprimer ou éliminer cytotoxicité. Photoblanchiment peut être réduite en minimisant l'exposition des fluorophores à une excitation lumineuse, et il ya au moins deux composants de matériel pour ce faire des expériences en direct d'imagerie. Un élément important est un détecteur sensible de photons, par exemple, une caméra EMCCD. Ceci permet de minimiser la durée et l'intensité de l'exposition, sans affecter négativement la détection d'une émission de fluorescence. Un composant associé est le système de source de lumière qui limite l'exposition de l'échantillon à la lumière d'excitation que lorsque le détecteur acquiert des images. Ceci est facilement réalisé par une lumière 41 LED qui permet un contrôle efficace du moment de l'exposition de lumière (ON / OFF tComprennent beaucoup moins de 1 ms). L'exposition peut être déclenchée que pendant la capture d'image, par la sortie numérique de l'appareil photo (par exemple terminal "Fire" à huis clos Andor). D'autres avantages de l'utilisation de la LED comprennent: la capacité de contrôler l'intensité de la lumière sans l'aide de filtres neutres de densité, stabilité à long terme de l'intensité lumineuse, et l'absence de vibrations mécaniques qui pourraient interférer avec une manipulation de précision de pipettes en verre comme dans l'enregistrement patch-clamp .

En général, les colorants structuralement différents de photoblanchiment à des vitesses différentes dans les mêmes conditions de formation d'image. Ainsi, il serait idéal pour évaluer l'ampleur de photoblanchiment du fluorophore utilisé dans une expérience particulière. Pour les colorants FM dans les terminaisons nerveuses vivantes, il est techniquement difficile d'évaluer le taux de photoblanchiment indépendante de l'activité synaptique, en raison de l'activité synaptique spontanée ou miniature. Une diminution de l'intensité de la fluorescence au cours de cette activity pourrait être dû à la perte biologique des colorants (FM), d'exocytose photoblanchiment des colorants FM, ou les deux. Heureusement, les structures des colorants pouvant être fixés FM sont conçus pour être pratiquement identiques à celles des colorants FM nonfixable. Dans le protocole décrit ici, les colorants pouvant être fixés FM ont été chargés dans les vésicules synaptiques par les mêmes procédés que les colorants FM nonfixable, alors que l'activité synaptique a été bloqué ensuite par la fixation chimique de l'échantillon. En particulier, le taux de photoblanchiment mesuré en utilisant ce système était aussi bas que 3.2% de plus de 2 min, lorsque les conditions de formation d'image sont les mêmes que ceux pour l'imagerie des cellules vivantes 19.

Colorants FM peuvent être utilisés avec des protocoles différents pour explorer divers aspects du recyclage des vésicules synaptiques. Activités synaptiques différents au cours de la coloration et décoloration peuvent être combinés de différentes manières, selon les objectifs et les fonctionnalités expérimentales spécifiques de recyclage des vésicules synaptiques à évaluer. La sélection de antagonists dépend aussi de l'objectif de l'expérience. En outre, l'imagerie FM peut être réalisée pendant la phase de coloration, ainsi que pendant la phase de décoloration 9,18,42. Il convient également de garder à l'esprit, cependant, que les colorants FM peuvent avoir des effets inattendus, tels que le blocage des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine 43, et imprégnant les canaux de mechanotransducer 44, magasin fonctionnant canaux Ca 2 + 45, et de l'ATP récepteurs 46. De fortes concentrations de colorants FM peuvent potentiellement modifier l'efficacité de l'exocytose des vésicules synaptiques se 47. Ainsi, nous recommandons la prudence dans la conception des expériences et l'interprétation des résultats concernant le recyclage des vésicules synaptiques. Méthodes complémentaires à prendre en compte comprennent l'absorption dans des vésicules synaptiques des anticorps dont les épitopes sont des domaines intra-luminales de protéines vésiculaires 22,48. Ils comprennent également exprimant la GFP sensible au pH des variants ciblés de lumière de la vésicule 49 à 51, et l'absorptiondes conjugués d'anticorps sensibles au pH de 52 à 54 fois de ce qui détectent les variations du pH intra-vésiculaires accompagnant exo-endocytose.

Une fois que ces effets indésirables sont exclus, colorants FM ont de larges applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour examiner si les mêmes piscines des vésicules synaptiques sont partagés pour spontanée et évoquée vésicules rejets 17,55, dans quelle mesure l'efficacité du recyclage des vésicules synaptiques peuvent être réglementés 56,57, et quels sont les effets fait un état ​​antérieur (repos ou stimulé) exercent sur ​​l'état plus tard de recyclage des vésicules sur la base, par exemple, spontanée et l'activité synaptique miniature. FM colorants peuvent également être utilisés pour évaluer recyclage des vésicules synaptiques au niveau ultrastructural, en mettant en corrélation les observations de la lumière et microscopie électronique par le procédé de photoconversion FM 30,58-62. Colorant FM peut être utilisé pour surveiller simultanément les fonctions synaptiques et intracellulaire de Ca 2 + concentration 5. En plus de l'étiquetage des vésicules synaptiques, les colorants FM et d'autres marqueurs fluorescents en phase liquide tels que le dextran fluorescent 7 peut être utilisé pour surveiller le nombre d'endocytose qui est déclenchée par une activité neuronale intense. En conclusion, les applications de colorants FM constituent une source inestimable d'informations sur le recyclage des vésicules synaptiques et les fonctions synaptiques supplémentaires.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les membres du laboratoire Harata pour des discussions utiles tout au long de l'exécution de ce travail. Ce travail a été financé par des subventions de l'American Heart Association, la Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation et la Fondation Whitehall à NCH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903

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References

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Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures
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Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).More

Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).

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