Summary
MR kanker moleculaire beeldvorming aantonen met een kleine peptide gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in tumor stroma in een muizen prostaatkanker model.
Abstract
Tumor extracellulaire matrix overvloed aan kanker gerelateerde eiwitten die kunnen worden gebruikt als biomarkers voor kanker moleculaire beeldvorming. In dit werk hebben we aangetoond effectief MR kanker moleculaire beeldvorming met een kleine moleculaire peptide gerichte Gd-DOTA monoamide complex als een gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in de tumor stroma. We voerden het experiment van de doeltreffendheid van het middel voor niet-invasieve detectie van prostate tumor met MRI in een muis orthotope PC-3 prostaatkanker model. De beoogde contrastmiddel effectief was aanzienlijke verbetering tumor contrast produceren tegen een lage dosis van 0,03 mmol Gd / kg. De peptide gerichte MRI-contrastmiddel is veelbelovend voor MR moleculaire beeldvorming van de prostaat tumor.
Introduction
Effectieve beeldvorming van kanker-gerelateerde moleculaire doelen is van groot belang om de nauwkeurigheid van vroegere opsporing en diagnose van kanker te verbeteren. Magnetic resonance imaging (MRI) is een krachtige klinische beeldvormende modaliteit met een hoge ruimtelijke resolutie en geen ionisatie straling 1. Er zijn echter geen gerichte contrastmiddel is beschikbaar voor klinische MR kanker moleculaire beeldvorming. Innovatief ontwerp en de ontwikkeling van gerichte MRI-contrastmiddelen zou in grote mate bij de toepassing van MR kanker moleculaire beeldvorming. Aanzienlijke inspanningen geleverd om gerichte contrastmiddelen voor MRI van de biomarkers op het oppervlak van kankercellen. Door de relatief lage gevoeligheid van MRI en lage concentratie van deze biomarkers, het is een uitdaging om voldoende contrast enhancement te genereren voor een effectieve MR moleculaire beeldvorming met behulp van kleine moleculaire gerichte contrastmiddelen 2,3. Om voldoende versterking te verkrijgen, verschillende afgiftesystemen such als liposomen, nanodeeltjes en polymeerconjugaten met een hoog laadvermogen van paramagnetische Gd (III) chelaten zijn opgesteld om de lokale concentratie van contrastmiddelen verhogen op het doel plaatsen 4,5. Hoewel deze systemen konden significante tumor verbetering in diermodellen genereren hun grote afmetingen resulteerde in langzame en onvolledige verwijdering uit het lichaam, waardoor langdurige accumulatie van toxische Gd (III)-ionen, wat kan leiden tot ernstige veiligheidsproblemen 6. Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat de beperkingen van MRI voor moleculaire beeldvorming kan worden overwonnen door selectie van de juiste moleculaire biomarkers met hoge lokale expressie in de laesies en met kleine moleculaire middelen die gemakkelijk kunnen worden uitgescheiden 7,8. Het belangrijkste kenmerk van deze middelen is dat ze gericht moleculaire merkers overvloedig aanwezig is in de aangetaste weefsels met weinig aanwezigheid in normale weefsels. Een hoge concentratie contrastmiddelen kunnen binden aan deze doelstellingen, resulterend in voldoendedoende contrast enhancement voor een effectieve MR moleculaire beeldvorming. Omdat de afmetingen ervan kleiner dan de renale filtratie drempel kan ongebonden contrastmiddelen gemakkelijk worden uitgescheiden uit het lichaam met verminderde achtergrondruis. We hebben een universele kanker-gerelateerde biomarker, clotted plasma-eiwitten, die overvloedig aanwezig in tumorstroma geselecteerd, en zijn zelden aanwezig in normale weefsels 9. We gesynthetiseerd gerichte contrastmiddel met een kleine gericht peptide CGLIIQKNEC (CLT1), die een sterke specifieke binding aan de PC3 prostaat tumormodel 10, en vier Gd-DOTA monoamide chelaten toonde. Hier bieden we een methodologie voor MR kanker moleculaire beeldvorming om tumoren op te sporen bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protocol aangepast van een voorafgaande studie 11.
1. Vervoeging van Gd-DOTA naar CLT1 Peptide
- Met behulp van standaard vaste fase peptidesynthese, synthetiseren CLT1 peptide (CGLIIQKNEC) van Fmoc-beschermde aminozuren op een 2-chloortritylchloridehars (1,0 mmol).
- Na toevoeging laatste aminozuur, gecycliseerd het lineaire peptide op hars met thallium (III) trifluoracetaat (1,09 g, 2,0 mmol, 2 equivalenten) in DMF (20 ml) bij 0 ° C gedurende 2 uur.
- Vervolgens conjugaat PEG en lysine achtereenvolgens aan de N-terminus van CLT1 peptide (1,0 mmol) van hars door reactie met achtereenvolgens Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3.0 mmol) en een tweede partij van Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
- Verwijder Fmoc met piperidine. Add DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 equivalenten aan elke aminogroep) reageren met de vier vrije aminen van de lysine dendrimeer op de hars gedurende 2 uur.
- Tot slot, klieven en bescherming te ontdoen van het productvan de hars door behandeling met een cocktail van trifluorazijnzuur, water en triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) gedurende 8 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de hars door filtratie gevolgd door wassen met trifluorazijnzuur (TFA). Voeg de gecombineerde filtraten druppelsgewijs koude ethylether (200 ml), centrifuge, en wassen met ethylether 4x. Droog onder vacuüm om een kleurloze vaste stof (1,99 g, 61% opbrengst).
- Zuiver het ruwe product met preparatieve HPLC met een gradiënt van 0-40% oplosmiddel B (0.1% TFA in acetonitril) in oplosmiddel A (0,1% TFA waterige oplossing) gedurende 20 min en 40-90% oplosmiddel B in oplosmiddel A gedurende 10 minuten .
- Los CLT1-dl-(DOTA) 4 (250 mg, 0.077 mmol) in gedeïoniseerd water (15 ml) en op pH 6 met 1 M NaOH. Voeg Gd (OAc) 3 0,4 H2O (472 mg, 0.462 mmol, 1,5 equivalenten aan DOTA monoamide) in porties aan de oplossing, terwijl de pH op 6 met 1 M NaOH. Roer de reactie-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
- Complexer de resterende Gd (III) met ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), en zuiver het ruwe product met een grootte-uitsluiting het eindproduct CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).
2. Karakterisering van Contraststoffen
- Meet Gd (III) tevreden met inductief gekoppeld plasma-optische emissie spectroscopie.
- Acquire matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectra lineaire modus met 2,5-dihydroxybenzoëzuur (2,5-DHB) als matrix.
- Meet relaxatietijden van de waterige oplossing van de contrastmiddelen van CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 en een nontargeted controlestof sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 in verschillende concentraties op 60 MHz (1,5 T) met een relaxometer bij 37 ° C. Gebruik een inversie-recovery pulssequentiewaarde T 1 en een Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence meten met 500 echo's naar T 2 te meten. Bereken T 1 en T 2 relaxiviteiten van the agenten van de hellingen van de percelen van 1 / T 1 en 1 / T 2 versus de Gd concentraties.
3. Cel Cultuur en Ontwikkeling van Animal Model met Orthotope PC3 Prostaat Tumor
- Cultuur PC3-prostaatkankercellen met constitutieve expressie van groene fluorescentie eiwit (GFP) in RPMI medium aangevuld met 5% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine / fungizone, oogst door trypsine en resuspendeer in dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / ul PBS.
- Handhaaf mannelijke NIH athymische naakt muizen (4-5 weken oud) bij de Athymische Animal Core Facility, Case Western Reserve University (CWRU) volgens een dier protocol door de CWRU Institutional Animal Care en gebruik Comite.
- De chirurgische vlakken werden besproeid met 2% chloorhexidine-oplossing en vervolgens bedekt met absorberende doeken. Steriele chirurgische handschoenen werden gedragen tijdens de procedure. Voor dier chirurgie, ip geïnjecteerd Avertin (250 mg / kg) aan anesthetize de muizen. Als alternatief kan ketamine / xylazine / acepromazine worden gebruikt bij een concentratie van 50/5/1 mg / kg. Ofthalmische zalf werd aangebracht op de muis om voldoende vocht tijdens de anesthesie te handhaven.
- Start de operatie door het snijden van een kleine incisie door de huid en het buikvlies langs de onderste middellijn bij een lengte van ongeveer 1 cm met een steriele scalpel. Een steriele chirurgische laken werd rond de incisie die tijdens survival operaties.
- Voorzichtig exterioriseren en stabiliseren de prostaat dorsale lobben aan de prostaat bloot te leggen. De suspensie injecteren van PC3-GFP cellen in PBS (20 pl) in de prostaat met een naald van 30 gauge. Tenslotte sluit de incisie met gewikkelde Autoclip 12.
- Voor post-procedure monitoring, bewaken dieren tweemaal per dag gedurende 1 week. Tekenen van ziekte zijn gebrek aan eten, donkere urine verzamelen rond urethra, en onvaste gang die infectie of occlusie van de blaas kunnen worden aangegeven in de nietjes.
- Na 10 dagen, te verwijderen thij nietjes met een ontnieter. Controleer de dieren dagelijks tumorgrootte en enig bewijs van pijn zoals gewichtsverlies, gedrags-afwijkingen en motorische gebreken beoordelen. Euthanaseren van de dieren die een tumorgrootte groter dan het ethisch toegestane limiet of het bewijs van pijn tijdens tumorgroei toonde.
4. Bevestiging van Tumor Binding Specificiteit van de peptiden met fluorescentie beeldvorming en histologie
- Na tumorcel inoculatie, zodat ongeveer 4 weken van tumorgroei voor het begin van de beeldvorming. Vóór injectie van het peptide probes verwerven GFP fluorescentie beelden met levende muizen op een fluorescentie imager de aanwezigheid van tumor controleren.
- Iv injecteren Texas rood gemerkte peptiden aan de tumor dragende muizen in een dosis van 10 nmol / muis.
- Offer de muizen 2 uur later door cervicale dislocatie, het verzamelen van de tumor en de belangrijkste organen, en meteen beeld op een fluorescentie imager. Gebruik groen licht filters voor GFP (excitatie: 444-490 nm, emissie: 515 nm lange pass filter, de verwerving instellingen: 500-720 in 10 nm stappen) en rood licht filters voor Texas Red (excitatie: 576-621 nm, emissie: 635 nm lange pass filter, de verwerving instellingen: 630-800 in 10 nm stappen). 10 msec belichtingstijd voor GFP en 150 msec voor Texas Red.
- Onmiddellijk na het meten van hele weefsel fluorescentie, verzamel tumor weefsel, vast met formaline en cryosection in 5-micrometer plakjes.
- Na spoelen met PBS, monteren met 1 druppel montage medium met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), foto onmiddellijk op een confocale laser scanning microscoop.
5. Magnetic Resonance Imaging (MRI)
- Ongeveer 4 weken na tumorcelinoculatie, zodat de tumoren groeien tot 0,3-0,6 cm in diameter. Gebruik een 7 T MRI scanner met een volume radiofrequentie (RF) spoel voor MRI onderzoek.
- Verdoven van de muis met een 2% isofluraan-zuurstof mengsel in een isofluraan inductie kamer. OPHthalmic zalf werd aangebracht op de muis om voldoende vocht tijdens de anesthesie te handhaven.
- Steek een 30 gauge naald in een 1,0 m lange buis gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing. Plaats de self-made katheter in de muis staart ader.
- Plaats de muis in de magneet en houdt onder inhalatie-anesthesie met 1,5% isofluraan en zuurstof via een neuskegel.
- Plaats een respiratoire sensor aangesloten op een systeem van toezicht op de buik om snelheid en diepte van de ademhaling te controleren. Houd de lichaamstemperatuur op 37 ° C door het blazen van hete lucht in de magneet via een teruggekoppeld regelsysteem.
- Begin met sagittale doorsnede beelden met behulp van een lokaliserend volgorde om de tumor locatie (TR / TE = 200/3.7 msec, FOV = identificeren 3,0 cm, slice dikte = 2,2 mm, slice nummer = 16, gemiddelde = 2, flip hoek = 45 °, matrix = 128 x 128).
- Gebruik een 2D T1-gewogen gradiënt vet onderdrukking volgorde om 2D axiale beelden voor CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msec, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, verwerven sluizen dikte = 1,2 mm, slice nummer = 12, gemiddelde = 1, flip hoek = 80 °, matrix = 128 x 128).
- Na pre-injectie beeld basislijn MR verwerving begint de beoogde middel of middel voor het regelen injecteren in een dosis van 0,03 mmol Gd / kg door spoelen met 200 pl zoutoplossing.
- Doorgaan naar CE-MRI-beelden te verwerven op verschillende tijdstippen voor maximaal 30 minuten.
6. Beeldverwerking en analyse
- Gebruik imaging software voor beeldanalyse.
- Teken de gebieden van belang (ROI) over de gehele tumor en de nieren in de tweedimensionale beeldvlak en meet de gemiddelde signaalintensiteit.
- Om de CE-MRI data te kwantificeren, meten tumor of nier contrast enhancement (ΔSNR) door berekening van de stijging van de post-contrast SNR dan pre-contrast SNR met behulp van de volgende vergelijking: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), waarbij S 0 en S t geven het signaal in de tumof of de nieren voor en na contrast en σ 0 en σ t zijn de standaardafwijking gemeten ruis van de achtergrond lucht voor en na contrast.
- Bereken de p-waarden met behulp van twee-tailed t-test van de student, uitgaande van statistische significantie bij p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de synthese van de gerichte contrastmiddel CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 en de algemene opzet van het experiment. CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 shows veel hoger relaxatie dan klinische Gd-DOTA (tabel 1). Op 1,5 T, de T1 relaxiviteit per gadolinium van CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 in PBS (pH 7,4) is ongeveer 3 maal hoger dan die van Gd-DOTA 10. Maestro beeldvorming bevestigt de sterke specifieke binding van met Texas rood gemerkte CLT1 (CLT1-TR) naar tumor met weinig binding aan normale organen en weefsels, terwijl de niet-specifieke scrambled peptide (sCLT1-TR) toont weinig tumor binden (Figuur 2). Figuur 3 toont typische pre-en post-injectie contrast versterkte (HV) T 1-gewogen beelden. Het doelgericht gestuurde middel resulteert in een grotere en meer verbetering in tumorweefsel in vergelijking met niet-gerichte gecodeerde middelen. Contrastverbetering in de urineblaas geleidelijk toeneemt dantijd, wat aangeeft dat de contrastmiddelen via nierfiltratie werden uitgescheiden. Kwantitatieve signaalanalyse blijkt dat het doelgericht gestuurde middel produceerde meer significante versterking signaal in het tumorweefsel dan het controlemiddel (p <0,05) tot 30 minuten. De biodistributie studie toont de agent heeft minimale retentie Gd in de belangrijkste organen en weefsels 2 dagen na de injectie. Onze voorlopige gegevens blijkt dat CLT1 gerichte MRI contrastmiddelen kunnen specifiek aan de tumor te leveren bij relatief lage doses (een derde klinische dosis).
| r2 (mM -1. s -1) | r 1 (mM -1. s -1) | Gd-gehalte (mmol-Gd / g) | |||
| per Gd | per molecuul | per Gd | per molecuul | ||
| CLT1-(Gd-DOTA) 4 | 10,1 ± 1,0 | 40,4 ± 3,0 | 13.0 ± 3.1 | 52.0 ± 9.6 | 1.05 ± 0.10 |
| sCLT1-(Gd-DOTA) 4 | 11.5 ± 1.4 | 46,0 ± 5,0 | 12.4 ± 0.3 | 49,6 ± 1,3 | 0.97 ± 0.08 |
| Gd-DOTA 4 | 2.9 * | 2.9 * | 3.2 * | 3.2 * | |
Tabel 1. Fysisch-chemische eigenschappen van de gerichte en gecodeerde MRI contrastmiddelen 1.5 T, 37 ° C (* relaxatietijden voor Gd-DOTA in water bij 37 ° C zijn uit referentie 10).
> Figuur 1. Grafische weergave van de synthese procedure en de algehele experiment. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Tumor binding van CLT1-TR. Gerichte CLT1-TR (A) en ongerichte sCLT1-TR (B) werden intraveneus geïnjecteerd in naakt muizen met orthotope PC3-GFP prostaat bij een dosis van 10 nmol / muis zonder thymus. Na 2 uur, tumoren en diverse organen werden verzameld en afgebeeld. Groene fluorescentie afbeeldingen zijn van PC3-GFP tumorcellen. Rode fluorescentie beelden zijn van CLT1-TR (A) en sCLT1-TR (B) sondes. 1. tumor; 2. milt; 3. hart; 4. nier; 5. testikel; 6. lever; 7. long; 8. spier; 9. hersenen.565fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Representatieve T1-gewogen axiale 2D gradiënt beelden van orthotope PC-3 menselijke prostate tumor vóór en na intraveneuze injectie van CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (A) en sCLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (B) en 0,03 mmol Gd / kg in nu / nu muizen. Tumor gelabeld met rode cirkel en de blaas gelabeld met groene cirkel. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
Selectie van de juiste Biomarker en Targeting Kleine Peptide
Met succes te ontwikkelen een gerichte contrastmiddel met kleine grootte, moet twee belangrijke punten te worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een goede moleculaire biomarkers die overvloedig aanwezig in zieke weefsels met weinig aanwezigheid in normale weefsels te selecteren. Onze geselecteerde kanker-gerelateerde biomarker, clotted plasma-eiwitten, voldoet aan deze eis. Ten tweede moet het geselecteerde gerichte kleine moleculaire exact hoge bindingsaffiniteit voor de biomarkers, zodat voldoende contrastmiddelen kunnen binden aan deze doelstellingen, waardoor voldoende contrastverbetering. In dit onderzoek werd gekozen de klonter bindende peptide CLT1 die sterke specifieke binding aan plasmaproteïnen het stolde in de tumor 11 toont.
Contrastmiddel Synthese
Het peptide synthese zijn osidizing twee thiolgroepen in het lineaire peptide molecuul uiteindelijke CLT1 cyclische peptide te vormen. Terwijl peptide cyclisatie gewoonlijk uitgevoerd in oplossing bij lage concentratie potentiële aggregatie, dimerisatie en oligomerisatie minimaliseren, on-hars cyclisatie maakt gebruik van de pseudo-verdunning verschijnsel en het verwijderen van reagentia door eenvoudig wassen en filtratie 13. In onze synthese procedure, vinden we dat op-hars cyclisatie behulp van thallium (III) trifluoroacetaat goed werkt met een hoog rendement en weinig dimerizatie, hoewel thallium (III) trifluoroacetaat is zeer giftig en zorg moet worden genomen tijdens de werkzaamheden. Een tweede benadering maakt gebruik van 20% DMSO in oplossing bij lage peptide concentratie. Echter meer maatregelen nodig om DMSO te verwijderen, en vriesdrogen van het grote volume oplossing langer duurt. Door het gebruik van beide methoden, is het cruciaal om ervoor te zorgen dat de gehele vorming van intramoleculaire disulfidebinding. Wanneer complexing de peptideligand met Gd, kan de vrije thiolen inducerengrote aggregaties omdat zware metalen in de buffer katalyseren lucht oxidatie, waardoor de overoxidatie van cysteine polymerisatie 14 te vormen. Dit vermindert meestal drastisch de opbrengst en zuiverheid van het eindproduct. Om ervoor te zorgen volledige disulfide band formatie te maken, moeten we eerst milde oxidatie omstandigheden gebruiken om de vorming van intermoleculaire disulfidebinding resulterend in dimeer of hoger vorming oligomeer voorkomen. Ten tweede moet lang genoeg reactietijd worden gehandhaafd om ervoor te zorgen dat alle thiol groepen geoxideerd voordat de Gd vervoeging stap.
Animal Model en Canulatie van Muisstaartje Vein
Voorbereiding van het dier tumor model en de staart ader cannulatie zijn ook zeer belangrijke aspecten van deze procedure. Tijdens de operatie moet het gereedschap / bank schoon en steriel gehouden voor mogelijke infecties die kunnen verwonden of doden de muizen voorkomen. Om te voorkomen dat het bewegen van de muis voor en na injectietie, is het noodzakelijk muis staartader canule. Om de katheter voor infusen bereiden, breek een 30 gauge naald uit de hub en steek de stompe uiteinde in een 1,0 m lange slang, en een ander einde van de slang aan op een spuit geladen met 1% gehepariniseerde zoutoplossing. Duw de spuit te vullen van de slang. Verwijden de staart met warm water (~ 105 ° F). Steek de naald in de ader. Bloed terugstroming in de slang geeft succesvol inbrengen van de katheter. Om te controleren of de naald in de ader, duw de spuit en de zoutoplossing kan soepel worden geïnjecteerd, de ader wordt gewist met de injectie van een kleine hoeveelheid zout. Bevestig de katheter op zijn plaats met tape voordat u de muis naar de scanner.
Beperkingen en eventuele wijzigingen
Er zijn een aantal beperkingen in onze huidige studie. Eerste plaats uit de voorlopige resultaten zien we dat CLT1 wast heel snel van de targeting website, hoewel het shows uitstekende binding aan de tumor. In vivo proteolytische degradatie aandoeningen die de instabiliteit van CLT1. Wijziging van CLT1 te beschermen tegen proteolytische afbraak moet de stabiliteit te verbeteren en verlengen de wash-out tijd in vivo. Met D-aminozuren de natuurlijke L-vorm aminozuren vervangen is een potentiële strategie om dit doel te bereiken. Ten tweede, de huidige studie niet duidelijk welke precieze componenten in de gestolde plasma-eiwitten de CLT1 peptide bindt aan. Tenslotte synthetiseren we de contrastmiddelen voornamelijk op vaste fase-synthese met een relatief lage opbrengst en hoge kosten. Het ontwikkelen van een vloeibare fase synthese methode moet het rendement te verhogen en de kosten te verlagen.
Toepassingen
We zijn het ontwikkelen van technieken voor een nauwkeurige detectie van kleine kwaadaardige tumoren met contrast versterkte MRI. MRI met het doelgericht gestuurde middel verschaft een effectiever en veiliger alternatief voor kanker moleculaire beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt mede ondersteund door de American Heart Association GRA Lente 09 Postdoctoraal Fellowship (09POST2250268) en het NIH R01 CA097465. We waarderen ten zeerste Dr Wen Li en Dr Vikas Gulani voor MRI-protocol testen en setup, en mevrouw Yvonne Parker voor haar hulp op tumorimplantatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
- Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
- Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
- Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
- Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
- Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
- Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
- Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
- Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
- Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
- Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
- Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
- Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
- McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
- Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).
