Summary
כדי להדגים הדמיה מולקולרית סרטן MR עם פפטיד קטן ממוקד חומר ניגוד MRI ספציפי לחלבוני פלזמה קרוש בstroma גידול במודל עכבר של סרטן ערמונית.
Abstract
יש מטריצה תאית גידול שפע של חלבוני סרטן הקשורים שיכול לשמש כסמנים ביולוגיים להדמיה מולקולרית בסרטן. בעבודה זו, שהראינו הדמיה מולקולרית יעילה סרטן MR עם פפטיד מולקולרי קטן הממוקד מורכב monoamide האלוקים-DOTA כחומר ניגוד MRI ממוקד ספציפי לחלבוני פלזמה קרוש בstroma גידול. אנחנו ביצענו את הניסוי של הערכה האפקטיביות של הסוכן לגילוי בלתי פולשנית של גידול בערמונית עם MRI במודל של עכברי orthotopic PC-3 סרטן ערמונית. חומר הניגוד הממוקד היה יעיל כדי לייצר שיפור לעומת גידול משמעותי במינון נמוך של 0.03 אלוקים / קילוגרם מילימול. פפטיד ממוקד חומר ניגוד MRI הוא מבטיח להדמיה מולקולרית MR של גידול בערמונית.
Introduction
הדמיה אפקטיבית של מטרות מולקולריות סרטן הקשורים היא בעל חשיבות רבה כדי לשפר את הדיוק של זיהוי סרטן מוקדם ואבחון. דימות תהודה מגנטית (MRI) היא שיטת הדמיה קלינית רבת עוצמה עם רזולוציה מרחבית גבוהה ואין קרינת יינון 1. עם זאת, אין חומר ניגוד ממוקד זמין עבור הדמיה מולקולרית סרטן MR קליני. עיצוב ופיתוח חדשני של סוכנים בניגוד MRI ממוקדים יקדמו באופן משמעותי את היישום של הדמיה מולקולרית סרטן MR. מאמצים משמעותיים נעשו לפתח סוכנים בניגוד ממוקדים על MR הדמיה של הסמנים הביולוגיים לידי ביטוי על פני השטח של תאי סרטן. בשל רגישות נמוכה יחסית של ה-MRI וריכוז נמוך של סמנים אלה, זה אתגר לייצר שיפור לעומת מספיק להדמיה מולקולרית MR היעיל באמצעות סוכנים קטנים מולקולריים ממוקדים ניגוד 2,3. על מנת לקבל שיפור מספיק, מערכות אספקה שונות sucשעות כמו ליפוזומים, חלקיקים וconjugates פולימר עם מטען גבוה של הקב"ה chelates (III) פאראמגנטיים היו מוכנים להגביר את הריכוז מקומי של סוכנים בניגוד לאתרי היעד 4,5. למרות שמערכות אספקה אלה היו מסוגלים להפיק שיפור משמעותי בגידול מודלים של בעלי חיים, במידות הגדולות שלהם הביאו לחיסול איטי ולא שלם מהגוף, וכתוצאה מכך ההצטברות ארוכה הטווח של הקב"ה יונים רעילים (III), שעלול לגרום לבעיות בטיחות חמורות 6. לאחרונה, כמה מחקרים הראו כי המגבלות של ה-MRI להדמיה מולקולרית ניתן להתגבר על ידי בחירת סמנים ביולוגיים מולקולריים הנכונים עם ביטוי מקומי גבוה בנגעים ובאמצעות סוכנים מולקולריים קטנים שיכול להיות מופרש 7,8 בקלות. התכונה המרכזית של חומרים אלה היא שהם יעד סמנים מולקולריים בשפע נוכח ברקמות החולות עם נוכחות קטנה ברקמות נורמליות. ריכוז גבוה של סוכנים בניגוד יכול להיקשר למטרות אלה, וכתוצאה מכך suffiשיפור לעומת cient להדמיה מולקולרית MR יעיל. מאז הגודל שלהם קטן יותר מסף הסינון של הכליות, יכולים בקלות להיות מופרשים סוכנים בניגוד מאוגדים מהגוף עם רעש רקע מופחת. יש לנו נבחרת סמן אוניברסלי הקשורים לסרטן, חלבוני פלזמה קורשים, אשר קיים בשפע בstroma גידול, ורק לעתים נדירות קיימים ברקמות נורמליות 9. אנו מסונתזים חומר ניגוד ממוקד המכיל פפטיד קטן מיקוד CGLIIQKNEC (CLT1), אשר הראה ספציפי חזק מחייב למודל הגידול בערמונית PC3 10, וארבעה chelates monoamide האלוקים-DOTA. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה להדמיה מולקולרית סרטן MR לגילוי גידולים בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול מותאם ממחקר לפני 11.
1. נטיה של הקב"ה-DOTA לCLT1 פפטיד
- באמצעות סינתזת פפטיד מוצק שלב סטנדרטי, לסנתז פפטיד CLT1 (CGLIIQKNEC) מחומצות אמינו המוגנים ב-Fmoc על שרף 2-chlorotrityl כלוריד (1.0 מילימול).
- לאחר הוספת חומצת אמינו סופית, cyclize פפטיד ליניארי על שרף עם trifluoroacetate תליום (III) (1.09 גרם, 2.0 מילימול, 2 שווה) בDMF (20 מיליליטר) ב 0 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- בשלב הבא, המצומד PEG ורצף ליזין לN-הסופית של פפטיד CLT1 (1.0 מילימול) על שרף על ידי מגיב ברצף עם Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 מילימול), Fmoc-ליס (Fmoc)-OH (3.0 מילימול), ומנה שנייה של Fmoc-ליס (Fmoc)-OH (6 מילימול).
- הסר Fmoc עם piperidine. הוספת DOTA-טריס (t-BU) (4.58 גרם, 8.0 מילימול, 2 שווה לכל קבוצת אמינו) כדי להגיב עם ארבעה אמינים חופשיים מdendrimer יזין על השרף לשעה 2.
- לבסוף, לבקע וdeprotect המוצרמהשרף על ידי טיפול עם קוקטייל של חומצת trifluoroacetic, מים, וtriisobutylsilane (TIS) (20 מיליליטר, 95/2.5/2.5) במשך 8 שעות ב RT. הסר את השרף על ידי סינון ואחרי כביסה עם חומצת trifluoroacetic (TFA). הוסף את filtrates שילוב dropwise לאתר קר אתיל (200 מיליליטר), צנטריפוגות, ולשטוף עם 4x אתר אתיל. ייבש תחת ואקום לתת (ז 1.99, תשואת 61%) חסר צבע מוצק.
- לטהר את המוצר הגולמי עם HPLC preparative באמצעות שיפוע של 0-40% B ממס (TFA 0.1% באצטוניטריל) בממס (0.1% תמיסה מימית TFA) עבור 20 דקות ו40-90% B ממס בממס עבור 10 דקות .
- ממיסים CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 מ"ג, 0.077 מילימול) במי DI (15 מיליליטר) ולהתאים את ה-pH ל 6 באמצעות 1 M NaOH. מוסיף הקב"ה (OAC) 3 .4 H 2 O (472 מ"ג, 0.462 מילימול, 1.5 שווה לmonoamide DOTA) במנות לפתרון, תוך שמירה על רמת החומציות ב6 באמצעות 1 M NaOH. מערבבים את פתרון התגובה על RT במשך 48 שעות.
- מורכב הקב"ה שיורי (III) עם דוארחומצת thylenediaminetetraacetic (EDTA) (מ"ג 90, 0.31 מילימול), ולטהר את המוצר הגולמי עם עמודת הרחקת גודל לתת את המוצר הסופי CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 (169 מ"ג, 57%).
2. אפיון של סוכנים בניגוד
- מדוד תוכן האלוקים (III) עם ספקטרוסקופית פליטת פלזמה אופטית מצמידים אינדוקטיבי.
- רכישת ספקטרום בסיוע מטריקס לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה (MALDI-TOF) מסה במצב ליניארי עם חומצת 2,5-dihydroxybenzoic (2,5-DHB) כמטריצה.
- למדוד זמני הרפיה של התמיסה המימית של הסוכנים בניגוד לCLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 וסוכן שליטת nontargeted sCLT1-DL-(ה'-DOTA) 4 עם ריכוזים שונים ב60 MHz (1.5 T) עם relaxometer ב 37 ° C. השתמש ברצף דופק היפוך התאוששות למדוד T 1 ורצף קאר-פרסל-Meiboom-גיל עם 500 הדים למדוד T 2. חישוב T 1 ו-T 2 relaxivities של הסוכני דואר מהמדרונות של החלקות של 1 / T 1 ו 1 / T 2 לעומת ריכוזי הקב"ה.
3. תא תרבות ופיתוח של בעלי החיים דגם עם גידול Orthotopic PC3 ערמונית
- תאי סרטן ערמונית PC3 תרבות עם ביטוי מכונן חלבון ירוק הקרינה (GFP) של במדיום RPMI בתוספת 5% בסרום שור העובר ופניצילין / סטרפטומיצין / fungizone, קציר על ידי trypsinization ו resuspend בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים / μl PBS.
- לשמור על עכברי זכרי NIH athymic עירום (4-5 שבועות) במתקן athymic בעלי החיים Core, אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב (CWRU) על פי פרוטוקול של בעלי חיים אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית CWRU.
- המשטחים כירורגית רוססו עם פתרון 2% כלורהקסידין ולאחר מכן מכוסה בסדינים סופגים. כפפות מנתחים סטרילית נלבשו במהלך ההליך. לפני הניתוח של בעלי החיים, IP להזריק Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) לanesthetizדואר העכברים. לחלופין, קטמין / xylazine / acepromazine ניתן להשתמש בריכוז של 50/5/1 מ"ג / קילוגרם. משחת עיניים היה מוחל על העכבר כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההרדמה.
- להתחיל את הניתוח על ידי חיתוך חתך קטן דרך העור והצפק לאורך קו האמצע התחתון באורך של כ 1 סנטימטר באמצעות אזמל סטרילי. וילון כירורגי סטרילי היה מכוסה סביב אתר החתך במהלך ניתוחי הישרדות.
- בעדינות exteriorize ולייצב את האונות הגבי ערמונית לחשוף את הערמונית. הזרק ההשעיה של תאי PC3-GFP ב-PBS (20 μl) לתוך הערמונית בעזרת מחט 30 מד. לבסוף לסגור את החתך עם פצע autoclip 12.
- לניטור שלאחר ההליך, לפקח על בעלי חיים פעמיים ביום במשך שבוע 1. סימני המחלה כוללים חוסר האכילה, איסוף שתן כהה סביב שופכה, והליכה לא יציבה שיכול להצביע על זיהום או חסימה של שלפוחית השתן בסיכות.
- לאחר 10 ימים, להסיר tהוא סיכות באמצעות מסיר מצרך. לפקח על בעלי החיים מדי יום כדי להעריך את גודל גידול וכל ראיה של כאב, כגון ירידה במשקל, סטיות התנהגותיות וליקויים מוטוריים. להרדים בעלי החיים אשר הראו גודל גידול העולה על המגבלה מוותרת מבחינה אתית או עדות לכאב במהלך גידול.
4. אישור ספציפי מחייב גידול של פפטידים עם דימות פלואורסצנטי והיסטולוגיה
- לאחר חיסון תאים סרטניים, מאפשר כ 4 שבועות של גידול לפני תחילת עם ההדמיה. לפני ההזרקה של בדיקות פפטיד, לרכוש תמונות הקרינה GFP עם עכברים חיים בתרמי הקרינה כדי לוודא את הנוכחות של גידול.
- Iv להזריק טקסס האדומה שכותרתו פפטידים לנושאת גידול עכברים במינון של 10 nmol / עכבר.
- להקריב שעות 2 העכברים מאוחר יותר על ידי נקע בצוואר הרחם, לאסוף את הגידול ואיברים גדולים, ומייד תמונה על תרמי הקרינה. להשתמש במסנני אור ירוקים עבור ה-GFP (עירור: 444-490 ננומטר; פליטה: 515 מסנן ארוך לעבור ננומטר; הגדרות רכישה: 500-720 ב10 צעדים ננומטר) ומסנני אור האדום לטקסס אדומה (עירור: 576-621 ננומטר; פליטה: 635 מסנן ארוך לעבור ננומטר; רכישה הגדרות: 630-800 ב10 צעדים ננומטר). 10 זמן חשיפה אלפיות שני עבור ה-GFP ו150 אלפיות שניים לטקסס אדומה.
- מייד לאחר המדידה של הקרינה ברקמות שלמה, לאסוף רקמות גידול, לתקן עם פורמלין, וcryosection לפרוסות 5-מיקרומטר.
- לאחר שטיפה עם PBS, הר עם 1 טיפה של מדיום הרכבה המכילה 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), תמונה באופן מיידי בליזר סריקה מיקרוסקופ confocal.
5. הדמיית תהודה מגנטית (MRI)
- כ 4 שבועות לאחר חיסון תאים סרטניים, מאפשר הגידולים לגדול עד 0.3-0.6 ס"מ קוטר. השתמש בסורק 7 T-MRI עם תדר רדיו נפח סליל (RF) למחקר MRI.
- להרדים את העכבר עם 2% תערובת isoflurane חמצן בתא האינדוקציה isoflurane. Ophהמשחה thalmic הייתה מוחלת על העכבר כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההרדמה.
- הכנס מחט 30 מד לתוך צינורות ארוכים 1.0 מ 'מלאים מלוח heparinized. מניחים את הקטטר מתוצרת העצמית בוריד זנב עכבר.
- מניחים את העכבר לתוך המגנט ולשמור תחת הרדמה משאיפת עם 1.5% isoflurane חמצן באמצעות חרטומו.
- הנח חיישן נשימה מחובר למערכת ניטור על הבטן כדי לפקח על קצב ועומק הנשימה. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ° C על ידי נשיפת אוויר חם לתוך המגנט באמצעות מערכת בקרת משוב.
- תתחיל עם תמונות סעיף sagittal תוך שימוש ברצף לוקליזציה לזהות את מיקום הגידול (TR / TE = 200/3.7 אלפיות שני, FOV = 3.0 סנטימטר, עובי פרוס = 2.2 מ"מ, מספר פרוסה = 16, = 2, זווית להעיף ממוצעת = 45 °, מטריצה = 128 x 128).
- השתמש ברצף דיכוי T1-משוקלל 2D שיפוע שומן לרכוש תמונות צירי 2D עבור CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msec, FOV = 3.0 סנטימטר x 3.0 סנטימטר, יםעובי כינים = 1.2 מ"מ, מספר פרוסה = 12 = 1, זווית, בממוצע להעיף = 80 °, מטריצה = 128 x 128).
- לאחר רכישת תמונת MR בסיס טרום הזרקה, מתחיל להזריק את הסוכן הממוקד או סוכן שליטה במינון של 0.03 מילימול אלוקים / קילוגרם על ידי שטיפה עם 200 μl של תמיסת מלח.
- תמשיך לרכוש תמונות CE-MRI בנקודות זמן שונים עד 30 דקות.
6. עיבוד תמונה וניתוח
- השתמש בתוכנת הדמיה לניתוח תמונה.
- צייר את האזורים של עניין (ROIs) על כל הגידול ואת הכליות במטוס ההדמיה דו ממדי ולמדוד עוצמת אות ממוצעת.
- כדי לכמת את נתוני CE-MRI, למדוד גידול או שיפור בכליות ניגוד (ΔSNR) על ידי חישוב של הגידול בהודעת הניגוד-SNR מעל SNR מראש ניגוד באמצעות המשוואה הבאה: ΔSNR = (t S / σ t) - (S 0 / Σ 0), שבו 0 S ו-S לא לציין את האות בקיבהאו או הכליות לפני ואחרי ניגוד לכך, וσ 0 ו t σ הן סטיית התקן של רעש שנמדדה מאוויר הרקע לפני ואחרי הניגוד.
- לחשב את ערכי p באמצעות מבחן t שני זנבו של התלמיד, בהנחת מובהקות סטטיסטיות p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג סינתזת הסוכן הממוקד ניגוד CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 והתכנית הכוללת של הניסוי של. CLT1-DL-(ה '-DOTA) relaxivity הגבוה הרבה יותר מאשר 4 תוכניות קלינית האלוקים-DOTA (טבלת 1). ב1.5 T, T relaxivity 1 לגדוליניום של CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 ב PBS (pH 7.4) גבוה בכ 3 פעמים יותר מזה של ה'-DOTA 10. הדמיה מאסטרו מאשרת ספציפית החזקה המחייב של טקסס האדומה שכותרתו CLT1 (CLT1-TR) לגידול עם מעט מחייב לאיברים ורקמות נורמלים, בעוד שאינו ספציפי מקושקשת פפטיד (sCLT1-TR) מציג גידול קטן מאוד מחייב (איור 2). איור 3 מציג מראש טיפוסיים וניגוד לאחר ההזרקה המשופרת T (CE) תמונות 1 משוקללת. הסוכן הממוקד תוצאה גדול יותר וארוך יותר שיפור ברקמת גידול בהשוואה למים שאינם ממוקדים סוכנים מקושקשות. השיפור לעומת בשלפוחית השתן עולה בהדרגה על פניזמן, מצביע על כך שהסוכנים בניגוד היו מופרשים באמצעות סינון הכלייתי. ניתוח אותות כמותי מגלה כי הסוכן הממוקד המיוצר שיפור אות משמעותי יותר ברקמת הגידול מסוכן הביקורת (p <0.05) עד 30 דקות. מחקר biodistribution תערוכות יש סוכן שימור הקב"ה מינימאלי באיברים העיקריים ורקמות 2 ימים לאחר ההזרקה. נתונים הראשוניים שלנו מראה כי CLT1 ממוקד סוכנים בניגוד MRI יכולים להיות מועברים באופן ספציפי לגידול במינון נמוך יחסית (כשליש ממינון קליני).
| r 2 (מ"מ -1. s -1) | r 1 (מ"מ -1. s -1) | תוכן ה '(מילימול האלוקים / g) | |||
| לאלוקים | לכל מולקולה | לאלוקים | עמ 'מולקולת er | ||
| CLT1-(ה '-DOTA) 4 | 10.1 ± 1.0 | 40.4 ± 3.0 | 13.0 ± 3.1 | 52.0 ± 9.6 | 1.05 ± 0.10 |
| sCLT1-(ה '-DOTA) 4 | 11.5 ± 1.4 | 46.0 ± 5.0 | 12.4 ± 0.3 | 49.6 ± 1.3 | 0.97 ± 0.08 |
| הקב"ה-DOTA 4 | 2.9 * | 2.9 * | 3.2 * | 3.2 * | |
טבלת 1. מאפייני physicochemical של הסוכנים בניגוד MRI הממוקדים ומקושקשים ב1.5 T, 37 מעלות צלזיוס (* Relaxivities לאלוקים-DOTA במים על 37 מעלות צלזיוס הן מהתייחסות 10).
> איור 1. תיאור גרפי של הליך הסינתזה וניסוי כולל. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. גידול המחייב של CLT1-TR. ממוקד CLT1-TR () והלא ממוקד sCLT1-TR (ב ') הוזרקו לוריד כדי athymic עכברים בעירום נושאות ערמונית PC3-GFP orthotopic במינון של 10 nmol / עכבר. לאחר 2 שעות, גידולים ואיברים שונים נאספו ו צילם. תמונות הקרינה ירוקה הן מתאי גידול PC3-GFP. תמונות הקרינה אדומות הן מCLT1-TR () וsCLT1-TR בדיקות (ב '). 1. גידול; 2. טחול: 3. לב: 4. כליות; 5. אשך; 6. כבד; 7. ריאות; 8. שרירים; 9. מוח."Target =" _blank 565fig2highres.jpg "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 3. נציג תמונות T1-משוקלל צירי 2D שיפוע של גידול בערמונית orthotopic PC-3 אדם לפני ואחרי ההזרקה תוך ורידית של CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 (א) ו sCLT1-DL-(ה'-DOTA) 4 (ב ') בשעה 0.03 אלוקים / קילוגרם מילימול בעכברים נו / נו. גידול שכותרתו עם המעגל ושלפוחית שתן שכותרתו עם העיגול ירוק אדומים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים
מבחר של סמנים ביולוגיים נכון ומיקוד פפטיד הקטן
לפתח חומר ניגוד ממוקד עם גודל קטן בהצלחה, שתי נקודות מרכזיות צריכים להילקח בחשבון. ראשית, חשוב לבחור סמנים ביולוגיים מולקולריים נכון שהם בשפע נוכח ברקמות חולות עם נוכחות קטנה ברקמות נורמליות. הסמן הביולוגי שלנו נבחר הקשורים לסרטן, חלבוני פלזמה קרוש, עונה על דרישה זו. שנית, צריכים שנבחרו הסוכנים המולקולריים הקטנים הממוקדים זיקה מחייבת לסמנים הביולוגיים גבוהה, כך שסוכנים בניגוד מספיק יכולים להיקשר למטרות אלה, וכתוצאה מכך השיפור לעומת מספיק. במחקר זה, בחרנו CLT1 פפטיד מחייב קריש שמראה ספציפי חזק מחייבים לחלבוני הפלזמה קרוש בגידול 11.
השוו את סוכן סינתזה
סינתזת פפטיד כרוכה שורidizing שתי קבוצות תיאול במולקולת הפפטיד ליניארי ליצירת פפטיד CLT1 מחזורי סופי. בעוד cyclisation פפטיד הוא נערך בדרך כלל בפתרון בריכוז נמוך כדי למזער צבירה פוטנציאלית, dimerization וoligomerization, cyclization על השרף מנצל את התופעה פסאודו הדילול כמו גם את ההסרה של חומרים כימיים על ידי שטיפה וסינון 13 פשוטים. בהליך הסינתזה שלנו, אנו מוצאים כי cyclization על השרף באמצעות תליום (III) trifluoroacetate עובד היטב עם תשואה גבוהה וdimerization הקטן, אם כי תליום trifluoroacetate (III) הוא רעיל מאוד ויש להקפיד בעת הטיפול בו. גישה שנייה משתמשת DMSO 20% בתמיסה בריכוז הפפטיד נמוך. עם זאת יש צורך בצעדים נוספים כדי להסיר את DMSO, וlyophilizing פתרון הנפח הגדול לוקח יותר זמן. על ידי שימוש בכל אחת מהשיטות, חשוב לוודא של היווצרות של אג"ח דיסולפיד intramolecular המלאה. כאשר complexing יגנד פפטיד עם הקב"ה, thiols החופשי יכול לגרוםמצבורים משמעותיים משום שעקבות מתכות בחיץ לזרז חמצון אוויר, וכתוצאה מכך overoxidation של ציסטאין כדי ליצור פילמור 14. בדרך כלל זה מקטין באופן דרמטי את התשואה וטוהר של מוצר סופי. כדי להפוך את היווצרות להקת דיסולפיד מלאה בטוחה, ראשון שאנחנו צריכים להשתמש בתנאי חמצון קלים, כדי למנוע היווצרות של קשר דיסולפיד מולקולאריים וכתוצאה מכך דימר או היווצרות oligomer גבוהה יותר. שנית, זמן תגובה ארוכה מספיק יש לשמור על מנת לוודא כי כל קבוצות תיאול הם מתחמצנים לפני שלב נטיית הקב"ה.
בעלי החיים דגם וCannulation של וריד זנב עכבר
הכנת cannulation וריד מודל הגידול של בעלי החיים והזנב גם הן היבטים חשובים מאוד של הליך זה. במהלך הניתוח, יש לשמור את הכלים / הספסל נקי וסטרילי כדי למנוע זיהום פוטנציאלי שעלולה לפגוע או להרוג את העכברים. על מנת להימנע מהזזת העכבר לפני ואחרי injection, יש צורך cannulate וריד זנב עכבר. כדי להכין את הקטטר לcannulation, לשבור מחט 30 מד מהרכזת והכנס את הקצה הקהה לתוך צינורות ארוכים 1.0 מ ', וחבר קצה אחר של הצינור למזרק עמוס 1% מלוחים heparinized. לדחוף את המזרק כדי למלא את צינורות. להרחיב את הזנב עם מים חמים (~ 105 ° F). הכנס את המחט לתוך הווריד. backflow דם לתוך צינורות מציין החדרה מוצלחת של קטטר. כדי לוודא שהמחט נמצאת בתוך הווריד, דחף בעדינות את המזרק ומי מלח יכול להיות מוזרק בצורה חלקה, הווריד מנוקה עם ההזרקה של כמות קטנה של מלח. תקן את הקטטר במקום עם קלטת לפני הזזת העכבר לסורק.
מגבלות ושינויים אפשריים
ישנן מספר מגבלות במחקר הנוכחי שלנו. ראשית, מהתוצאות הראשוניות ניתן להבחין כי CLT1 שוטף החוצה מהר מאוד מאתר המיקוד למרות שזה shows מצוין מחייב לגידול. בvivo השפלה פרוטאוליטי צפוי גורמת לחוסר היציבות של CLT1. השינוי של CLT1 כדי להגן מפני השפלה פרוטאוליטי צריך לשפר את יציבותה ולהאריך את הזמן לשטוף אותה בגוף חי. שימוש בחומצות אמינו מסוג D-להחליף חומצות אמינו L-סוג טבעיים היא אסטרטגיה אפשרית להשגת מטרה זו. שנית, המחקר הנוכחי אינו מבהיר אילו רכיבים מדויקים בחלבוני הפלזמה קורשים פפטיד CLT1 נקשר. לבסוף, אנו לסנתז את הסוכנים בניגוד בעיקר באמצעות סינתזת שלב מוצקה עם תשואה נמוכה יחסית ועלות גבוהה. פיתוח שיטת סינתזת שלב נוזלית צריכה להגדיל את התשואה ולהקטין את העלות.
יישומים
אנחנו מפתחים טכניקות לזיהוי מדויק של גידולים ממאירים קטנים עם MRI חומר הניגוד. MRI עם הסוכן הממוקד מספק אלטרנטיבה יעילה יותר ובטוחה יותר עבור הדמיה מולקולרית בסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי איגוד לב האמריקאי GRA אביב 09 פוסט דוקטורט המלגה (09POST2250268) וNIH R01 CA097465. אנחנו מאוד מעריכים את ד"ר וון לי וד"ר יקאס Gulani לבדיקת MRI בפרוטוקול והתקנה, והגב 'איבון פרקר על סיועה בהשתלת גידול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
- Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
- Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
- Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
- Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
- Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
- Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
- Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
- Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
- Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
- Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
- Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
- Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
- McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
- Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).
