Summary
För att visa MR cancer molekylär avbildning med en liten peptid riktade MRI kontrastmedel specifika för clotted plasmaproteiner i tumör stroma i en mus prostatacancer modell.
Abstract
Tumör extracellulärmatrix har överflöd av cancerrelaterade proteiner som kan användas som biomarkörer för cancer molekylär avbildning. I detta arbete visade vi effektivt MR cancer molekylär avbildning med en liten molekylär peptid riktade Gd-DOTA monoamid komplicerat som en riktad MRI kontrastmedel specifika för clotted plasmaproteiner i tumor stroma. Vi utförde experimentet för att utvärdera effektiviteten av medlet för icke-invasiv detektion av prostatatumör med MRI i en mus ortotop PC-3 prostatacancer modell. Den riktade kontrastmedel var effektivt för att producera betydande tumörkontrastförstärkning vid en låg dos av 0,03 mmol Gd / kg. Peptiden riktade MRI kontrastmedel är lovande för MR molekylär avbildning av prostatatumör.
Introduction
Effektiv avbildning av cancerrelaterad molekylära mål är av stor betydelse för att förbättra noggrannheten i tidigare upptäckt av cancer och diagnos. Magnetisk resonanstomografi (MRT) är en kraftfull klinisk avbildning modalitet med hög rumslig upplösning och ingen jonisering strålning 1. Dock finns för klinisk MR cancer molecular imaging ingen riktad kontrastmedel. Innovativ design och utveckling av riktade MRI kontrastmedel skulle avsevärt påskynda tillämpningen av MR cancer molekylär avbildning. Betydande insatser har gjorts för att utveckla målinriktade kontrastmedel för MR-avbildning av de biomarkörer som uttrycks på ytan av cancerceller. På grund av relativt låg känslighet för MRI och låg koncentration av dessa biomarkörer, är det en utmaning att generera tillräcklig kontrastförstärkning för effektiv MR molekylär avbildning med små molekylära riktade kontrastmedel 2,3. För att få tillräcklig förstärkning, olika leveranssystem framgångsh som liposomer, nanopartiklar och polymer konjugat med en hög nyttolast av paramagnetiska Gd (III) kelat har upprättats för att öka den lokala koncentrationen av kontrastmedel vid målställena 4,5. Även om dessa leveranssystem kunde generera betydande tumör förbättring i djurmodeller, deras stora storlekar ledde till långsam och ofullständig eliminering från kroppen, vilket resulterar i långvarig ansamling av farliga Gd (III) joner, som kan orsaka allvarliga biverkningar 6. Nyligen har vissa studier visat att begränsningarna av MRT för molekylär avbildning kan övervinnas genom att välja lämpliga molekylära biomarkörer med hög lokal uttryck i skador och använda småmolekylära ämnen som lätt kan utsöndras 7,8. Den viktigaste funktionen av dessa medel är att de riktar molekylära markörer högst närvarande i sjuka vävnader med liten närvaro i normal vävnad. En hög koncentration av kontrastmedel kan binda till dessa mål, vilket resulterar i tillräckligt kontrastförbättring för effektiv MR molekylär avbildning. Eftersom deras storlek är mindre än den njurfiltrationen tröskeln, kan obundna kontrastmedel lätt utsöndras från kroppen med minskad bakgrundsljud. Vi har valt en universell cancerrelaterad biomarkör, koagulerade plasmaproteiner, som rikligt förekommer i tumör stroma, och är sällan förekommer i normala vävnader 9. Vi syntetiserade en riktad kontrastmedel innehållande en liten targeting peptid CGLIIQKNEC (CLT1), vilket visade stark specifik bindning till PC3 prostatatumörmodellen 10, och fyra Gd-DOTA monoamid kelat. Här ger vi en metod för MR cancer molekylär avbildning för att upptäcka tumörer hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll anpassas från en tidigare studie 11.
1. Konjugering av Gd-DOTA till CLT1 peptid
- Med konventionell fastfas-peptidsyntes, syntetisera CLT1 peptid (CGLIIQKNEC) från Fmoc-skyddade aminosyror på en 2-klorotritylkloridharts (1,0 mmol).
- Efter tillsats av slutlig aminosyra, cykliseras den linjära peptiden på hartset med tallium (III)-trifluoracetat (1,09 g, 2,0 mmol, 2 ekvivalenter) i DMF (20 ml) vid 0 ° C under 2 timmar.
- Härnäst konjugat PEG och lysin i sekvens till N-terminalen av CLT1 peptid (1,0 mmol) på hartset genom reaktion i följd med Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3,0 mmol), och en andra sats av Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
- Ta bort Fmoc med piperidin. Lägg DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 ekvivalenter till varje aminogrupp) för att reagera med de fyra fria aminer från lysin dendrimer på hartset under 2 timmar.
- Slutligen klyva och deprotektera produktenfrån hartset genom behandling med en blandning av trifluorättiksyra, vatten, och triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) och 8 h vid RT. Avlägsna hartset genom filtrering följt av tvättning med trifluorättiksyra (TFA). Tillsätt de kombinerade filtraten droppvis till kall etyleter (200 ml), centrifugera och tvätta med etyleter 4x. Torka under vakuum för att ge ett färglöst fast ämne (1,99 g, 61% utbyte).
- Rena den råa produkten med preparativ HPLC med användning av en gradient av 0-40% lösningsmedel B (0,1% TFA i acetonitril) i lösningsmedel A (0,1% TFA vattenhaltig lösning) under 20 min och från 40 till 90% lösningsmedel B i lösningsmedel A under 10 min .
- Lös CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) i avjoniserat vatten (15 ml) och justera pH till 6 med användning av 1 M NaOH. Lägg Gd (OAc) 3 0,4 H2O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 ekvivalenter till DOTA monoamid) i portioner till lösningen, under det att pH hölls vid 6 med användning av 1 M NaOH. Rör om reaktionslösning vid RT under 48 timmar.
- Komplexa rest Gd (III) med ethylenediaminetetraacetic ättiksyra (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), och rena den råa produkten med en storleksuteslutningskolonn för att ge den slutliga produkten CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).
2. Karakterisering av kontrastmedel
- Mät Gd (III)-halt med induktivt kopplad plasma optisk emissionsspektroskopi.
- Skaffa matrisassisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight (MALDI-TOF) mass-spektra i linjärt läge med 2,5-dihydroxibensoesyra (2,5-DHB) i form av en matris.
- Mät relaxationstider för den vattenhaltiga lösningen av kontrastmedlen enligt CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 och en icke-målbestämd kontrollmedel sCLT1-DL-(Gd-DOTA) fyra olika koncentrationer vid 60 MHz (1,5 T) med en relaxometer vid 37 ° C. Använd en inversion-recovery pulssekvens för att mäta T 1 och en Carr-Purcell-Meiboom-Gill sekvens med 500 ekon att mäta T2. Beräkna T 1 och T 2 relaxiviteter av the agenter från sluttningarna av tomter på 1 / T 1 och 1 / T 2 kontra Gd-koncentrationer.
3. Cell Culture och utveckling av djurmodell med Orthotopic PC3 Prostata tumör
- Kultur PC3-prostatacancerceller med konstitutivt uttryck av grönt fluorescens protein (GFP) i RPMI-medium kompletterat med 5% fetalt bovint serum och penicillin / streptomycin / fungizon, skördades genom trypsinering och återsuspendera vid densitet av 2,5 x 10 4 celler / | il PBS.
- Upprätthålla manliga NIH atymiska nakna möss (4-5 veckor) på atymiska Animal Core Facility, Case Western Reserve University (CWRU) enligt en djurprotokoll som godkänts av CWRU Institutional Animal Care och användning kommittén.
- De kirurgiska ytor besprutades med 2% klorhexidin lösning och sedan täckt med absorberande draperier. Sterila operationshandskar var slitna under förfarandet. Innan djur kirurgi, ip injicera Avertin (250 mg / kg) till anesthetize mössen. Alternativt kan ketamin / xylazin / acepromazin användas vid en koncentration av 50/5/1 mg / kg. Oftalmisk salva applicerades på mus för att upprätthålla tillräcklig fukt under anestesi.
- Börja operationen genom att skära ett litet snitt genom huden och peritoneum längs den nedre mittlinjen vid en längd av ca 1 cm med användning av en steril skalpell. En steril operationslakan täcktes runt snittet webbplatsen under överlevnad operationer.
- Försiktigt exteriorize och stabilisera prostata rygg lober att exponera prostatan. Injicera suspensionen av PC3-GFP-celler i PBS (20 | il) in i prostatan med en 30 gauge nål. Slutligen stänger snitt med sår AutoClip 12.
- För post-övervakningsförfarande, övervaka djuren två gånger per dag i 1 vecka. Tecken på sjukdom inkluderar brist på att äta, mörk urin samla runt urinröret, och ostadig gång, som kan tyda på infektion eller ocklusion av urinblåsan i klammer.
- Efter 10 dagar, ta bort tHan klamrar använder en klammerborttagare. Övervaka djuren dagligen för att bedöma tumörens storlek och tecken på smärta såsom viktminskning, beteendeavvikelser, och motorskador. Euthanize djur som visade en tumörstorlek överskrider etiskt tillåtna gränsen eller tecken på smärta vid tumörtillväxt.
4. Bekräftelse av tumör bindningsspecificiteten av peptiderna med fluorescens avbildning och histologi
- Efter tumörcells ympning, tillåter ca 4 veckor av tumörtillväxt innan du börjar med avbildning. Före injektion av peptidsonder, förvärva fluorescensbilder GFP med levande möss på en fluorescens-avbildare för att verifiera närvaron av tumören.
- Iv injicera Texas Red märkta peptider till tumörbärande möss vid en dos av 10 nmol / mus.
- Offra mössen 2 timmar senare genom halshuggning, samla tumören och viktigaste organ, och genast bilden på en fluorescens Imager. Använd grönt ljusfilter för GFP (excitation: 444-490 nm, emission: 515 nm långpassfilter, förvärvs inställningar: 500-720 i 10 nm steg) och röd ljusfilter för Texas Red (excitation: 576 till 621 nm, emission: 635 nm långpassfilter, förvärv inställningar: 630-800 i 10 nm steg). 10 ms exponeringstid för GFP och 150 msek för Texas Red.
- Omedelbart efter mätning av hela vävnads fluorescens, samla in tumörvävnad, fixa med formalin, och kryosektion i 5-ìm skivor.
- Efter sköljning med PBS, Fäste med 1 droppe monteringsmedium innehållande 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), bilden direkt på en konfokala laserskanning mikroskop.
5. Magnetisk resonanstomografi (MRT)
- Cirka 4 veckor efter tumörcells ympning, låta tumörerna att växa upp till 0,3 till 0,6 cm i diameter. Använd en 7 T magnetkamera med en volym radiofrekvens (RF) spole för MRI undersökning.
- Bedöva musen med en 2% isofluran-syreblandning i en isofluran induktionskammare. Ophthalmic salva applicerades på mus för att upprätthålla tillräcklig fukt under anestesi.
- Sätt i en 30 gauge nål i en 1,0 m lång slang fylld med hepariniserad koksaltlösning. Placera den självgjorda katetem i musens svansven.
- Placera musen i magneten och hålla i inhalationsanestesi med 1,5% isofluran-syre via en noskon.
- Placera en andningssensor som är ansluten till ett övervakningssystem på buken för att övervaka hastigheten och djupet på andningen. Hålla kroppstemperaturen vid 37 ° C genom blåsning av varm luft in i magnet genom ett återkopplingsstyrsystem.
- Börja med sagittalsnitt bilder med hjälp av en lokaliserande sekvens för att identifiera tumörens läge (TR / TE = 200/3.7 msek, FOV = 3,0 cm, skiva tjocklek = 2,2 mm, skiva nummer = 16, medelvärde = 2, flip vinkel = 45 °, matris = 128 x 128).
- Använd en 2D T1-viktade lutning fett dämpning sekvens att förvärva 2D axiella bilder för CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msek, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, slöss tjocklek = 1,2 mm, skiva nummer = 12, medelvärde = 1, flip vinkel = 80 °, matrix = 128 x 128).
- Efter pre-injektion baslinjen MR bild förvärv, börjar att injicera det målinriktade medlet eller kontrollmedel i en dos av 0,03 mmol Gd / kg genom spolning med 200 | il koksaltlösning.
- Fortsätt att skaffa CE-MRI-bilder vid olika tidpunkter i upp till 30 minuter.
6. Bildbehandling och analys
- Använd imaging programvara för bildanalys.
- Rita regioner av intresse (ROI) över hela tumören och njurarna i den tvådimensionella avbildningsplanet och mäta genomsnittliga signalintensiteten.
- För att kvantifiera CE-MRI data, mäta tumör eller njurkontrastförbättring (ΔSNR) genom beräkning av ökningen i post-kontrast SNR över pre-kontrast SNR hjälp av följande ekvation: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), där S 0 och S t betecknar signalen i sin tureller eller njurarna före och efter kontrast och σ 0 och σ t är standardavvikelsen för bruset mätas från den bakgrund luft före och efter kontrast.
- Beräkna de p-värden med användning av studentens tvåsvansade t-test under antagande statistisk signifikans vid p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar syntesen av den riktade kontrastmedlet CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 och den övergripande planen för experimentet. CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 visar mycket högre relaxivitet än klinisk Gd-DOTA (tabell 1). Vid 1,5 T, är T en relaxivitet per gadolinium av CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 i PBS (pH 7,4) ca 3 gånger högre än den hos Gd-DOTA 10. Maestro avbildning bekräftar en stark specifik bindning av Texas Red-märkt CLT1 (CLT1-TR) till tumören med liten bindning till normala organ och vävnader, samtidigt som den icke-specifika kodade peptiden (sCLT1-TR) visar väldigt lite tumör-bindning (fig 2). Figur 3 visar typiska pre och post-injektionskontrastförstärkt (CE) T 1-viktade bilder. Den målinriktade medlet resulterar i större och längre förbättring i tumörvävnad jämfört med icke-målinriktade kodade medel. Kontrastförstärkning i urinblåsan ökar gradvis övertid, vilket indikerar att de kontrastmedel utsöndrades via njurfiltrering. Kvantitativ signalanalys avslöjar att det målinriktade medlet producerade mer betydande signalförstärkning i tumörvävnaden än kontrollmedlet (p <0,05) upp till 30 min. Biodistribution Studien visar agenten har minimal Gd retention i de viktigaste organen och vävnaderna 2 dagar efter injektion. Våra preliminära data visar att CLT1 riktade MRI-kontrastmedel specifikt kan levereras till tumören vid relativt låg dos (en tredjedel av den kliniska dosen).
| r 2 (mM -1. n -1) | r 1 (mM -1. s -1) | Gd innehåll (mmol-Gd / g) | |||
| per Gd | per molekyl | per Gd | pER-molekylen | ||
| CLT1-(Gd-DOTA) 4 | 10,1 ± 1,0 | 40,4 ± 3,0 | 13,0 ± 3,1 | 52,0 ± 9,6 | 1,05 ± 0,10 |
| sCLT1-(Gd-DOTA) 4 | 11,5 ± 1,4 | 46,0 ± 5,0 | 12,4 ± 0,3 | 49,6 ± 1,3 | 0,97 ± 0,08 |
| Gd-DOTA 4 | 2,9 * | 2,9 * | 3,2 * | 3,2 * | |
Tabell 1. Fysikalisk-kemiska egenskaper hos de målinriktade och scrambled MRI kontrastmedel vid 1,5 T, 37 ° C (* relaxiviteter för Gd-DOTA i vatten vid 37 ° C är från referens 10).
> Figur 1. Grafisk skildring av syntesförfarandet och övergripande experiment. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Tumör bindning av CLT1-TR. Riktad CLT1-TR (A) och icke-målinriktade sCLT1-TR (B) injicerades intravenöst till atymiska nakna möss bärande orthotopic PC3-GFP prostata vid en dos av 10 nmol / mus. Efter 2 timmar fick tumörer och olika organ uppsamlades och avbildas. Grön fluorescensbilder är från PC3-GFP-tumörceller. Röd fluorescens bilder är från CLT1-TR (A) och sCLT1-TR (B)-prober. 1. tumör; 2. mjälte, 3. hjärta, 4. njure, 5. testikel, 6. lever; 7. lunga; 8. muskel, 9. hjärnan.565fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Representativa T1-viktade axiella 2D gradient bilder av orthotopic PC-3 human prostatatumör före och efter intravenös injektion av CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (A) och sCLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (B) vid 0,03 mmol Gd / kg i nu / nu möss. Tumör märkt med röd cirkel och blåsa märkt med grön cirkel. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Val av Korrekt Biomarkör och Targeting liten peptid
För att framgångsrikt utveckla ett målinriktat kontrastmedel med liten storlek, två viktiga punkter måste beaktas. För det första är det viktigt att välja lämpliga molekylära biomarkörer som är högst närvarande i sjuka vävnader med liten närvaro i normala vävnader. Vår valda cancerrelaterad biomarkör, clotted plasmaproteiner, uppfyller detta krav. För det andra bör de utvalda riktade småmolekylära ämnen har hög bindningsaffinitet för biomarkörer så att tillräckligt med kontrastmedel kan binda till dessa mål, vilket resulterar i tillräcklig kontrastförstärkning. I denna studie valde vi koagulering-bindande peptid CLT1 som uppvisar stark specifik bindning till den koagulerade plasman proteiner i tumören 11.
Kontrastmedel Syntes
Den peptidsyntes innebär oxidizing två tiolgrupper i den linjära peptidmolekyl för att bilda slutlig cyklisk CLT1 peptid. Medan peptid cyklisering utföres vanligen i lösning vid låga koncentrationer för att minimera potentiell aggregation, dimerisering och oligomerisering, tar på-harts cyklisering fördel med pseudo utspädning fenomen liksom avlägsnandet av reagens genom enkel tvättning och filtrering 13. I vår syntesförfarande, finner vi att den-harts ringslutning med hjälp av tallium (III) trifluoracetat fungerar bra med hög avkastning och lite dimerisering, även om tallium (III) trifluoracetat är mycket giftig och man måste vara försiktig när du hanterar den. Ett andra tillvägagångssätt använder 20% DMSO i lösningen vid låg peptidkoncentration. Dock behövs fler åtgärder för att avlägsna DMSO, och frystorkning den stora volymen lösningen tar längre tid. Genom att använda någon av dessa metoder, är det viktigt att se till att den fullständiga bildningen av intramolekylära disulfidbindning. När komplex peptidliganden med Gd, kan de fria tiolerna inducerabetydande ansamlingar eftersom spårmetaller i bufferten katalysera luftoxidation, vilket resulterar i överoxidation av cystein för att bilda polymerisa 14. Detta minskar vanligtvis dramatiskt utbytet och renheten av slutprodukten. För att se komplett disulfid band bildning, först måste vi använda milda oxidation förhållanden för att undvika bildandet av inter disulfidbindning resulterar i dimer eller högre oligomerbildning. För det andra bör bibehållas tillräckligt lång reaktionstid för att se till att alla tiolgrupper oxideras innan Gd konjugering steget.
Djurmodell och Kanyle av Mouse Tail Vein
Beredning av djurtumörmodell och svans ven kanyle är också mycket viktiga aspekter i detta förfarande. Under operationen, måste verktyg / bänk hållas rena och sterila för att undvika potentiell infektion som kan skada eller döda mössen. För att undvika att förflytta musen före och efter injektion, är det nödvändigt att kanylera mus svansvenen. För att framställa katetem för kanylering bryta en 30 gauge nål från navet och sätt in den trubbiga änden in i en 1,0 m lång slang, och ansluta den andra änden av röret till en spruta laddad med 1% hepariniserad saltlösning. Skjut på sprutan för att fylla upp slangen. Dilate svansen med varmt vatten (~ 105 ° F). Stick in nålen i venen. Blod återflödet i slangen indikerar lyckad införing av katetern. För att kontrollera att nålen är i venen, tryck försiktigt sprutan och saltlösning kan smidigt injiceras, venen rensas med injektion av en liten mängd saltlösning. Fäst katetern på plats med tejp innan du flyttar musen till skannern.
Begränsningar och eventuella ändringar
Det finns flera begränsningar i vår nuvarande studie. Först från de preliminära resultat som vi märker att CLT1 tvättar ut mycket snabbt från den inriktning platsen även om det shows utmärkt bindning till tumören. In vivo proteolytisk nedbrytning orsakar sannolikt instabilitet CLT1. Modifiering av CLT1 att skydda mot proteolytisk nedbrytning bör förbättra sin stabilitet och förlänga dess wash-out tid in vivo. Med användning av D-typ aminosyror för att ersätta naturliga L-typ aminosyror är en potentiell strategi för att uppnå detta mål. För det andra innebär den aktuella studien inte klargöra vilka exakta komponenter i de koagulerade plasmaproteiner i CLT1 peptiden binder till. Slutligen, vi syntetisera kontrastmedel huvudsakligen använder fastfassyntes med relativt låg avkastning och höga kostnader. Utveckling av en flytande fas syntesmetod bör öka avkastningen och sänka kostnaden.
Tillämpningar
Vi utvecklar teknik för noggrann detektering av små elakartade tumörer med kontrastförstärkt MRT. MRT med det målinriktade medlet ger en effektivare och säkrare alternativ för cancer molekylär avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av American Heart Association GRA VT09 Postdoctoral Fellowship (09POST2250268) och NIH R01 CA097465. Vi uppskattar mycket Dr Wen Li och Dr Vikas Gulani för MR-protokoll testet och inställning, och Ms Yvonne Parker för hennes hjälp på tumörimplantation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fmoc protected amino acids | EMD Chemicals Inc | ||
| DOTA-tris(t-Bu) | TCI America | ||
| PyBOP, HOBt, HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS | Sigma-Aldrich Corp. | ||
| Texas Red, succinimidyl ester, single isomer | Invitrogen | T20175 | |
| EQUIPMENTS | |||
| Agilent 1100 HPLC system | Agilent | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column | Agilent | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX In Vivo Imaging System | Cambridge Research Instrumentation, Inc. | ||
| Biospec 7T MRI scanner | Bruker | ||
References
- Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
- Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
- Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
- Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
- Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
- Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
- Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
- Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
- Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
- Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
- Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
- Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
- McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
- Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).
