Summary
Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.
Abstract
Per facilitare gli studi strutturali e dinamiche di G protein-coupled recettore (GPCR) complessi di segnalazione, sono necessari nuovi approcci per introdurre sonde informativi o etichette in recettori espressi che non perturbano la funzione del recettore. Abbiamo usato ambra tecnologia di soppressione codone geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina (AZF) in diverse posizioni mirate nei GPCR eterologamente espressi in cellule di mammifero. La versatilità del gruppo azido è illustrato qui in applicazioni diverse per studiare GPCR nel loro ambiente nativo cellulare o detergenti in condizioni solubilizzate. In primo luogo, abbiamo dimostrato una tecnologia photocrosslinking mirata basata celle per identificare i residui nella tasca di legame del ligando di GPCR dove una piccola molecola ligando marcato con trizio viene reticolato di un acido ammino azido geneticamente codificati. Abbiamo poi Dimostriamo sito-specifica modifica del GPCR dal bioorthogonal Staudinger-Bertozzi legatura reazionizione che gli obiettivi del gruppo azido mediante derivati fosfina. Discutiamo di una strategia generale per la mirata peptide-epitopo tagging delle proteine di membrana espresse in-cultura e la sua individuazione utilizzando un metodo ELISA basato whole-cell. Infine, dimostriamo che AZF-GPCR possono essere selettivamente contrassegnati con sonde fluorescenti. Le metodologie sono discusse generale, in quanto possono in principio essere applicate a qualsiasi posizione amminoacido in qualsiasi espresso GPCR interrogare complessi di segnalazione attive.
Introduction
Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR Heptahelical) comprendono una superfamiglia di proteine di membrana altamente dinamici che mediano i segnali extracellulari importanti e diverse. Nel paradigma classico, l'attivazione del recettore è accoppiato con i cambiamenti conformazionali ligando-indotta. 1, 2 recenti progressi nel campo della biologia strutturale di GPCR hanno fornito informazioni significative sui meccanismi molecolari della segnalazione transmembrana. 3-5 Tuttavia, per comprendere con maggiore precisione chimica meccanismo funzionale e dinamica strutturale della segnalazione GPCR, un toolkit di approcci sono necessari per incorporare sonde molecolari e chimiche informativi per interrogare complessi di segnalazione attiva.
A tal fine, abbiamo adattato un metodo per sito-specifico di introdurre non o poco sonde perturbanti nella recettori espressi sulla base di aminoacidi innaturale (SAU) mutagenesi con ambra codone tecnologia di soppressione precedentemente introdotta da Schultz ecoworkers. 6 Abbiamo ottimizzato la metodologia mutagenesi SAU per ottenere una espressione ad alto rendimento e sistema di mutagenesi per proteine come GPCR, che sono difficili da esprimere in sistemi eterologhi più diversi dalle cellule di mammifero. L'utilizzo di un silenziatore costruito ortogonale tRNA e si è evoluta-tRNA sintetasi pair per una specifica SAU, noi del sito specificamente introdotto UAAs in GPCR bersaglio espresse. L'incorporazione di successo UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (ACF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) è stata dimostrata nei nostri GPCR modello - rodopsina e umana recettore CC chemochine, CCR5. 7, 8
In linea di principio, una SAU può essere geneticamente codificato in qualsiasi posizione all'interno della sequenza della proteina e questa proprietà è uno strumento biochimico prezioso in quanto consente la scansione singolo codone di un GPCR bersaglio. Ci concentriamo qui in particolare sulla versatilità della SAU, AZF, che ha una azi reattivafare parte. Oltre a servire come infrarossi (IR) sonda unico, 8, 9 AZF può anche servire come un photoactivatable reticolante per reazione con ammine primarie vicini o idrogeni alifatici. Inoltre, il gruppo azido biologicamente inerte può partecipare come un manico chimica selettiva nelle reazioni di etichettatura bioorthogonal. Qui vi presentiamo esempi che illustrano le applicazioni utili del sito-specifica incorporazione di AZF in GPCR, come photocrosslinking mirato ad intrappolare un complesso recettore-ligando, e la modifica dei GPCR da bioorthogonal codifica epitopo e le strategie in materia di etichettatura fluorescenti.
Photoactivatable reagenti sono stati utilizzati per studiare i sistemi biologici dal 1960. 10 In questo periodo, l'abbondanza di esperimenti reticolazione recettore-ligando sono stati segnalati per studiare complessi GPCR, la maggior parte dei quali ha coinvolto l'uso di leganti fotoaffinità. 11, 12 Tuttavia, questi applicazioni sono tecnicamente limitati, in quanto Require sintesi di leganti recanti un gruppo reticolante. 13-15 Inoltre, con la frazione di reticolante nel ligando, è impegnativo per identificare la posizione della reticolazione sul GPCR. Sito-specifico introducendo photocrosslinking gruppi come UAAs in proteine utilizzando la tecnologia di soppressione ambra codone è un avanzamento importante. 16, 17 Abbiamo sviluppato una tecnica photocrosslinking per identificare l'interfaccia di legame su un recettore che è coinvolto nella formazione di un complesso recettore-ligando in cellule vive introducendo gruppi fotolabili in GPCR. 18, 19 Qui si descrive il protocollo sperimentale e metodo di analisi dei dati per applicare questa tecnologia photocrosslinking mirato per identificare il sito di legame di un ligando piccola molecola, maraviroc triziata, su CCR5. Questo metodo sfrutta la quantificazione precisa del manico sul ligando radioattivo, oltre ad avere la struttura chimica nativa del ligando.
Tecniche basate fluorescenza supportano la precisa comprensione della base strutturale del recettore sondando direttamente lo stato conformazionale del recettore. 20, 21 Tuttavia, le tecniche che hanno la flessibilità necessaria per introdurre etichette fluorescenti in GPCR sito-specifica sono limitati. Siamo interessati a impiegare strategie di modificazione chimica bioorthogonal per facilitare l'individuazione singola molecola (SMD) di complessi di segnalazione GPCR. 22 Il gruppo azido può partecipare a chimiche bioorthogonal come Staudinger-Bertozzi legatura, 23, 24 strain-promosso azide-senza rame cicloaddizione alkyne (SpAAC) 25 e azide-alchino cicloaddizione rame-catalizzato (CuAAC) 26. Ci concentriamo qui sulla reazione legatura Staudinger-Bertozzi che coinvolge la reazione specifica tra un azide e fosfina. Abbiamo dimostrato l'utilizzo di due differenti derivati fosfina, coniugati ad un epitopo peptide (peptide FLAG) o un'etichetta fluorescente(Fluoresceina) per raggiungere sito-specifica modifica del GPCR.
Abbiamo già ottimizzato le condizioni per l'etichettatura sito-specifica della rodopsina varianti AZF utilizzando la struttura cristallina ai raggi X e simulazioni dinamiche di scegliere siti di destinazione che sono solventi esposte. 27, 28 Abbiamo anche illustrato la possibilità di conseguire l'etichettatura libero-background da Staudinger- Bertozzi legatura. 29 dimostriamo qui la procedura generale impiegato per raggiungere marcatura fluorescente di un recettore detergente-solubilizzato che viene immobilizzato su una matrice immunoaffinità e seguito evidenziata in-gel fluorescenza. Inoltre, abbiamo dimostrato un utile estensione di questa strategia di etichettatura per identificare le posizioni suscettibili di etichettatura su un recettore di struttura sconosciuta, CCR5. Questo avviene tramite una mirata strategia di codifica-peptide epitopo che si basa sulla modificazione bioorthogonal di AZF-GPCR varianti in un formato semi-high throughput base cellulare. 30 Questometodo sfrutta le proprietà di rilevamento multi-step di un ELISA superficie cellulare per monitorare gli eventi di etichettatura.
Le metodologie di cui parliamo qui sono generali e in linea di principio può essere applicato a qualsiasi GPCR incorporata con AZF usando l'ambra codone tecnologia di soppressione. Nei protocolli qui presentati dettaglio i passi necessari per l'espressione cellulare di mammifero di recettori incorporato con UAAs come AZF utilizzando il metodo di mutagenesi amminoacido non naturale e successive applicazioni di facilitare studi strutturali e dinamiche di GPCR.
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Protocol
1. Site-specific Costituzione genetica di Innaturale Aminoacidi in GPCR
- Mantenere HEK293T cellule in DMEM (4,5 g / L di glucosio, glutammina 2 mM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5%.
- Trasfezione delle cellule cresciute al 60-80% di confluenza in una piastra da 10 cm usando Lipofectamine Plus. reagente.
- A 750 microlitri DMEM, aggiungere 10 microlitri Plus. reagente, 3,5 pg di GPCR cDNA (pMT4. Rho o pcDNA 3.1. CCR5) contenenti l'ambra codone di stop in una posizione desiderata, 3,5 pg di tRNA soppressore cDNA (pSVB.Yam) e 0,35 mg di mutante amino-acil tRNA sintetasi cDNA per p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Effettuare anche una trasfezione simile usando l'wt GPCR cDNA (non contenente un codone di stop ambra) per servire come controllo. Aggiungi questa miscela a 750 ml di DMEM con 17 microlitri Lipofectamine. Dopo equilibrazione 15 minuti a temperatura ambiente, portare lavolume totale di 4 ml.
- Aspirare il terreno di 10 cm piastra, si applicano miscela di trasfezione per le cellule, e tornare a 37 ° C in 5% di CO 2 nell'atmosfera. Dopo 4-6 ore, integrare le celle con 4 ml di DMEM contenente 20% FBS e 1 AZF mm.
- Il giorno seguente, sostituire i mezzi di crescita con DMEM contenente 10% FBS e azf 0,5 mM.
- Celle di raccolta 48 ore dopo la trasfezione, per analizzare l'espressione o procedere procedure photocrosslinking o etichettatura descritti nelle sezioni seguenti.
- Confermare espressione del mutante ambra GPCR in presenza della SAU nel mezzo di crescita. Facciamo questo rilevamento immunoblot occidentale. Lyse il pellet cellulare in 1% (w / v) dodecil-β-D-maltoside (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM per 1 ora a 4 ° C. Centrifugare il lisato a 16.000 xg e risolvere il supernatante in condizioni riducenti mediante SDS-PAGE. Trasferimento a una membrana PVDF e effettuare analisi immunoblot per rilevare l'espressione del recettore full-length usando the 1D4 mAb (Cell Nazionale Culture Center), che riconosce un epitopo ingegnerizzato al C-terminale del recettore. 31
2. Mappatura di rilegatura sito Ligand Uso mirata Photocrosslinking
- 48 ore dopo la trasfezione, mezzi di aspirare da cellule e sostituirlo con 4 ml di 1x tampone fosfato (PBS). Rientro a 37 ° C per 15 min.
- Risospendere le cellule con PBS 1x e trasferire in una provetta Falcon. Centrifugare a 1500 rpm per 2 minuti per far sedimentare le cellule e aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in soluzione salina tamponata di Hank 1x contenente HEPES 20 mM, pH 7,5, 0,2% BSA e il ligando triziato a concentrazioni saturanti vincolante per il periodo di tempo e la temperatura richiesta per garantire recettore-ligando formazione del complesso.
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti o 96 pozzetti per fotoattivazione del AZF a 365 nm (per esempio utilizzare un lampada UV-A) per 15 min a 4 ° C. Manten la piastra sul ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione e lisi cellulare.
- Trasferire le cellule in una provetta Eppendorf, centrifugare per agglomerare le cellule, rimuovere il supernatante e procedere all'analisi. I pellet possono essere conservati a -20 ° C per un uso futuro.
- Risospendere il pellet di cellule in tampone di lisi contenente 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 e inibitori della proteasi. Dopo 1 ora di incubazione a 4 ° C, centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 16.000 xg, e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Aggiungere 1D4 mAb-Sepharose resina 2B al supernatante e incubare una notte a 4 ° C per immunopurify GRCP usando l'ingegnerizzato C-terminale 1D4 mAb epitopo. Il giorno dopo lavare le perline più volte con tampone di lisi. Campioni Eluire con 1% SDS a 37 ° C per 1 ora con agitazione.
- Trasferire una porzione dell'eluente in una fiala contenente 15 ml di liquido di scintillazione e contare su un contatore a scintillazione beta per quantificare la quantità di legame specifico del ligando triziato al secoloe recettore.
- Risolvere il restante 1D4 mAb eluente purificato mediante elettroforesi su gel standard. Utilizziamo un 4-12% SDS-PAGE gel e poi trasferimento semi-dry ad una membrana di PVDF per immunoblotting. Abbiamo anche una corsia con scaletta proteine standard per guidare l'approssimazione visiva di peso molecolare.
- Bloccare la membrana PVDF con 5% di latte in tampone TBS contenente 0,05% Tween-20. Sondare la membrana per confermare l'espressione del recettore full-length con 1D4 mAb seguito da anticorpo secondario anti-topo IgG HRP-coniugato.
- Trattare con chemiluminescenza (ECL) Reattivo ed esporre membrana per autoradiografia pellicola per visualizzare bande.
- Tagliare la membrana con una lama di rasoio di separare ogni corsia campione e quindi tagliato a specifici marcatori di peso molecolare. Trasferimento segmenti di membrana di flaconi contenenti liquido di scintillazione. Quantificare la quantità di trizio in ogni segmento membrana contando su un contatore beta-scintillazione.
- Identificare il positivophotocrosslink con il rilevamento di trizio alla massa molecolare apparente pari alla somma di quella del GPCR e il ligando.
3. Mirata epitopi Tagging e Cell Surface immunoenzimatico Assay (ELISA)
- 24 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule con 1 ml di PBS 1X e trypsinize con 1 ml 0,25% tripsina per 3 min. Integrare con 9 ml DMEM contenente 10% FBS e AZF 0,5 mm. Risospendere le cellule e contare la densità cellulare. Usiamo un emocitometro standard.
- Pre-trattare una, chiara-bottom piastra a 96 pozzetti alto legame con 100 ml di 0,01 mg / ml poli-D-lisina per pozzetto. Incubare per 30 minuti alla temperatura ambiente, lavate ripetutamente con PBS 1x e aria secca.
- Piastra 200 ml di cellule trasfettate con una densità di 6 x ottobre 04-08 x 10 4 cellule / pozzetto di piastra a 96 pozzetti e ritorno a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
- Il giorno dopo preparare le cellule per l'etichettatura. Lavare delicatamente tre volte con 100 microlitri / pozzetto 1x PBS to rimuovere AZF contenente terreno di coltura. Assicurarsi che le cellule rimangono attaccati, per esempio, utilizzando PBS contenente Ca 2 + e Mg 2 +.
- Preparare 50-200 micron FLAG-triarylphosphine etichettatura reagente in 1x HBSS / PBS da uno stock mantenuto a 5-20 mM in PBS. Applicare 60 ml in ciascun pozzetto (in triplicato per ogni mutante ambra) e ritorno a 37 ° C per 30 min a 4 ore. Mantenere una serie di pozzi senza trattamento etichetta in 1x HBSS / PBS. Anche un controllo peso GPCR confrontare con varianti AZF-GPCR.
- Lavare le cellule 3 volte con 100 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio, BB (1x PBS, 0.5% BSA), per rimuovere completamente l'etichetta che non ha reagito.
- Applicare 100 microlitri / pozzetto del 4% paraformaldeide (preparato da uno stock di 16% in PBS 1x) alle cellule. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con BB.
- Eseguire protocollo ELISA superficie cellulare standard per rilevare recettore etichettati e l'espressione del recettore. Incubare con anticorpo primario per 1,5 ore su ghiaccio seguita da una secondariatibody incubazione a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiungere 100 ml di anticorpi anti-FLAG M2 (es. 1:2.000 diluizione di anticorpo fatto in BB) per rilevare FLAG peptide epitopo di etichettatura reagente FLAG-triarylphosphine. Sondare anche non-label pozzetti trattati come controllo negativo. Aggiungi anti-CCR5 2D7 (usiamo una diluizione 1:500) anticorpo ad una serie separata di pozzi per determinare in peso o superficie cellulare espressione AZF-GPCR.
- Lavare le cellule tre volte con BB, e incubare con 100 ml di HRP-coniugato anticorpo secondario anti-topo IgG (1:2.000 diluizione).
- Lavare accuratamente le cellule cinque volte con BB. Aggiungere rilevamento buffer 50 microlitri: Amplex Rosso, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 ratio) e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Raccogliere dati spettrali su un lettore di fluorescenza piatto multi-bene a λ ex = 530 e λ em = 590.
4. Bioorthogonal Etichettatura fluorescente di un GPCR
- Lyse10 7 cellule raccolte esprimono wt o AZF-Rhodopsin varianti in 1 ml di tampone di solubilizzazione contenente 1% (w / v) DM, HEPES 50 mM o Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 e inibitori della proteasi per 1 ore a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 15.000 xg per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
- Aggiungere 100 microlitri 1D4-mAb resina sepharose 2B per catturare recettore usando l'ingegneria C terminus 1D4 epitopo. Incubare per 12 ore a 4 ° C. Lavare la resina tre volte con 0,1% (w / v) DDM in 0,1 M tampone fosfato di sodio, pH 7,3.
- Aggiungere 0,1 mM fluoresceina-fosfina in un volume totale di 0,3 - 0,5 etichettare recettore immobilizzato sulla matrice immunoaffinità (1D4-mAb sefarosio 2B). Incubare per 12 ore a temperatura ambiente. Centrifuga e si preleva il surnatante. Lavare la resina per rimuovere etichetta non reagito.
- Eluire il recettore marcato con tampone di eluizione 100 ml contenente 0,1% (w / v) DDM e 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide contro l'epitopo 1D4)in 2 mM tampone fosfato, pH 6,0 mediante incubazione in ghiaccio per 1 ora.
- Risolvere campioni etichettati mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti. Lavare gel brevemente in PBS e quindi visualizzare l'etichettatura di AZF-GPCR da in-gel fluorescenza. Ad esempio, utilizzare uno scanner a fluorescenza confocale con un laser di lunghezza d'onda 488 nm per rilevare recettore modificato con fluoresceina.
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Representative Results
Abbiamo utilizzato la metodologia mutagenesi amminoacido non naturale al sito-specifico introdurre sonde molecolari in un GPCR usando l'ambra codone tecnologia di soppressione. Lo schema in figura 1 illustra le fasi salienti della metodologia e le varie applicazioni di incorporare la versatile UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), in GPCR. Espressione di AZF-GPCR in cellule di mammifero permette mirato photocrosslinking ai ligandi, e mirata peptide-epitopo codifica o modifiche fluorescenti di un GPCR via chimiche etichettatura bioorthogonal.
La tecnica photocrosslinking può essere usato per studiare gli aspetti strutturali complessi GPCR-ligando in cellule vive (Figura 1A). Dati rappresentativi ottenuti da uno di questi esperimenti è mostrato in Figura 2. 19 Qui abbiamo usato un ligando radioattivo marcato piccola molecola, maraviroc triziata, per identificare il suo sedere vincolantee su CCR5. In questo esempio, l'irradiazione UV su cellule esprimenti AZF-CCR5 varianti pre-incubate con risultati maraviroc triziato in complessi in modo covalente reticolati che possono essere identificati utilizzando il tag radioattivo sensibile sul ligando. Tra le varie posizioni sul CCR5 testato, I28azF e W86azF erano in grado di photocrosslink di maraviroc triziata come illustrato con conta significativamente superiori a scintillazione (barre rosse, pannello inferiore, Figura 2). Il recettore wt mostrato alcuna reticolazione al ligando radioattivo.
Chimiche etichettatura Bioorthogonal possono essere utilizzati al sito specificamente modificare varianti AZF-GPCR. Abbiamo impiegato la legatura chimica Staudinger-Bertozzi per etichettare due GPCR: CCR5 e rodopsina tramite derivati fosfina (Schema 1). Una strategia implica l'epitopo codifica mirata di un GPCR in cellule vive usando un'etichetta peptide coniugato (Figura 1b). Dimostriamo uno di questi esperimenti, in cui un Peptid FLAGe-triarylphosphine etichettatura reagente viene utilizzato al sito specificamente e selettivamente modificare varianti AZF-CCR5. In figura 3 mostriamo dati rappresentativi di una strategia di rilevazione ELISA sensibile e multi-step utilizzato per identificare le posizioni che sono contrassegnati con il peptide FLAG. 30 Tra le posizioni sul CCR5 indagato, tutte le varianti AZF-CCR5 sono state espresse sulla superficie cellulare (rosso bar, Figura 3) e circa la metà di essi ha subito con successo epitopo bersaglio tagging (barre blu, Figura 3). wt CCR5 servito come controllo negativo per l'epitopo tagging, esposto dalla mancanza di segnale anti-FLAG. In una strategia alternativa, abbiamo etichettato detergenti-solubilizzato azf-GPCR immobilizzati su una matrice di immunoaffinità, come anti-1D4 mAb coniugati a Sepharose resina 2B, con un'etichetta fluoroforo-coniugato (figura 1c). L'immagine in-gel fluorescenza mostrato in Figura 4 illustra la fluorescente successoetichettatura del GPCR, rodopsina, in tre diverse posizioni incorporato con AZF dalla legatura Staudinger-Bertozzi utilizzando un derivato fosfina di fluoresceina 29. Come previsto, la rodopsina peso non ha mostrato alcuna etichettatura sfondo come si vede dalla mancanza di una banda fluorescente al previsto peso molecolare del recettore.
Schema 1. La reazione di ligazione Staudinger-Bertozzi tra un triarylphosphine e un azide per formare un addotto ammide-linked stabile.
Figura 1. Schema che illustra l'integrazione sito-specifica di una SAU (AZF) e le sue applicazioni per s . tudy GPCR sito-specifica SAU mutagenesi si ottiene co-trasfezione di plasmidi tre distinte in cellule di mammifero che portano: un evoluto amino ortogonale acil-tRNA sintetasi specifica per la SAU, una ortogonali tRNA soppressore che riconosce un ambra codone di stop (UAG) , e il gene codificante la GPCR contenente una mutazione TAG in una posizione desiderata. Le cellule cresciute in presenza della SAU esprimono un GPCR full-length con una AZF sito-specifico introdotto. Queste cellule possono quindi essere (a) incubati con ligando e attivate con luce UV per identificare legami crociati tra un GPCR e il suo ligando, (b) usati per sito-specifico epitopo-tag un GPCR in coltura con un'etichetta chimica peptide coniugato, o (c) solubilizzati per purificare GPCR, che vengono poi bioorthogonally modificato con un marcatore fluorescente in condizioni in cui il recettore è immobilizzato su una resina Sepharose anticorpo coniugato.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita
Figura 2. Photocrosslinking mirata di un GPCR ad un ligando triziato. Qui esposti sono i risultati rappresentativi di un esperimento di reticolazione tra le varianti AZF-CCR5 e una piccola molecola ligando marcata con tritio, maraviroc. Pannello superiore: Il Western immunoblot generato dopo un esperimento tipico, con l'espressione delle varianti AZF-CCR5 testati. I segmenti colorati evidenziano in cui la membrana PVDF è stata tagliata per il conteggio in scintillazione e corrispondono ai conteggi di scintillazione rilevati tracciati nel grafico a barre nel pannello in basso. Il segmento rosso rappresenta la massa molecolare atteso (circa 40 kDa) del complesso reticolato covalente tra il recettore e ligando. Ilrefore, ci si aspetterebbe di rilevare trizio nei segmenti solo quando azf viene introdotto in una posizione nel recettore che si trova in prossimità della tasca di legame del ligando e possono formare una reticolazione covalente con il ligando. Ristampati (adattato) con il permesso di Grünbeck, A., et al. Geneticamente codificate foto-cross-linker una mappa del sito di legame di un farmaco allosterico su un recettore accoppiato a proteina G. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita
Figura 3. ELISA individuazione di mirati epitopi-tagging di un pannello GPCR Top:. Espressione di superficie delle cellule di HEK 293T cells esprimono varianti AZF-CCR5 e controlli trasfettate wt e finti sondato con anti-CCR5 mAb 2D7 utilizzando tutta a base di cellule ELISA (barre rosse). Pannello inferiore: Cellule della stessa trasfezione sono state trattate con 0,05 mm FLAG-triarylphosphine per 1 ora in cellule vive e poi quantificati dalla successiva ELISA utilizzando anticorpi anti-FLAG M2 mAb per determinare l'entità del peptide-epitopo codifica in ogni posizione (barre blu) . Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media per due o più insiemi di dati replicati. Ristampato (adattato) con il permesso di Naganathan, S., et al. Site-specific epitopo tagging delle GPCR per modificazione bioorthogonal di un amminoacido non naturale geneticamente codificato Biochimica DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita
Figura 4. Etichettatura fluorescente della rodopsina AZF incorporato in diverse posizioni. WT e mutanti AZF-rodopsina immobilizzati su una matrice immunoaffinità marcato con fluoresceina fosfina. Campioni purificati sono stati separati da 4-12% SDS-PAGE e l'immagine in-gel fluorescenza mostrata è stata scattata con un scanner confocale a fluorescenza laser a 488 nm utilizzando un set di filtri di emissione ottimizzato per il rilevamento fluoresceina. Figura adattato da Huber, T., et al. Etichettatura Bioorthogonal di funzionali G recettori accoppiati a proteine a gruppi azido geneticamente codificati. presentato (2013). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita
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Discussion
Descriviamo qui una solida metodologia per site-specific inserimento di una sonda reattiva, AZF, in GPCR e dimostriamo tre applicazioni utili di questo strumento per studiare la struttura e la dinamica dei GPCR. Il nostro metodo al sito-specifico incorporano UAAs elude un problema fondamentale con una strategia alternativa basata sulla etichettatura chimicamente 32, 33 o allegando photocrosslinkers 34 per una singola cisteina mutante accessibile. Sebbene, chimiche che colpiscono gruppi tiolo della cisteina sono stati utilizzati per collegare sonde fluorescenti, tale strategia richiede la generazione di una proteina sfondo senza cisteina. Questo può essere limitante poiché tutti i GPCR possiedono più di una cisteina, molte delle quali possono essere essenziali per mantenere la funzione del recettore corretta. Pertanto, la possibilità di introdurre un SAU che è suscettibile di modificazione chimica o può essere attivato dalla luce UV è estremamente attraente.
La reazione covalente di un photreticolante oactivatable con una molecola bersaglio dipende dalla distanza e catene laterali confinanti. Pertanto, queste sonde possono essere utilizzate per identificare le interazioni che si trovano all'interno di una determinata distanza dal crosslinker, per esempio, reticolanti a base di benzofenone-sono suggeriti per avere una dipendenza distanza di 3 Å 35. Precedenza, abbiamo introdotto sia AZF e BZF, una SAU contenente un gruppo reattivo benzofenone, per identificare i residui in un GPCR che si trovano entro una distanza definita da un fluoresceina o trizio etichettato ligando. 18, 19 L'applicabilità generale di questa tecnologia dipende esclusivamente dalla disponibilità di tali ligandi marcati e la generazione di mutanti ambra di un GPCR bersaglio. Inoltre, in teoria questa tecnica photocrosslinking mirata può essere applicato per identificare interazioni tra GPCR e da altri partner di legame, come una proteina G o β-arrestina. I dati ottenuti da questi studi reticolanti possono essere usati per creare mo più accuratamodelli lecular di complessi di segnalazione GPCR.
Diverse reazioni chimiche bioorthogonal sono state descritte in letteratura che permettono la modifica sito-specifica dei residui SAU. La SAU, ACF, per esempio, possiede un gruppo cheto che può partecipare a reazioni idrazonici o oxime legatura. 36, 37 Abbiamo già confrontato la modifica dei gruppi chetonici e gruppi azido con reagenti coniugati biotinilate e fluoresceina. 29 Le nostre osservazioni hanno indicato che il azido gruppo di AZF è davvero più bioorthogonal rispetto al suo omologo cheto. Quindi, abbiamo successivamente concentrata sull'uso della legatura Staudinger-Bertozzi modificare due GPCR con un tag peptide epitopo o un'etichetta fluorescente. È interessante notare, tuttavia, che la legatura Staudinger-Bertozzi presenta sub-stechiometriche 38 e scarse proprietà cinetiche di etichettatura. Inoltre, fosfine sono altamente sensibili all'ossidazione dell'aria. 25 abbiamo osservato che il Staudinger-Belegatura rtozzi raggiunge soltanto un'etichettatura 30% dopo incubazione per 12 ore a temperatura ambiente. 29 Per questi motivi, stiamo attualmente valutando chimiche etichettatura alternativi come CuAAC e SpAAC al sito-specifica etichetta AZF-GPCR.
Sebbene gli inconvenienti di reazioni di ligazione Staudinger-Bertozzi, dimostriamo qui l'uso di un peptide epitopo strategia codifica live-cell per identificare posizioni su un GPCR bersaglio che sono accessibili per marcatura fluorescente futuro. Inoltre, questa strategia marcatura epitopo ha numerose altre applicazioni utili, ad esempio, l'introduzione di un epitopo in un singolo residuo modificato in contrasto con l'inserimento dell'intero epitopo sostituendo sequenze native. Questa caratteristica è di importanza specifica con GPCR da variare la lunghezza e la sequenza di segmenti ad anello altamente conservate potrebbe alterare drammaticamente funzione. Infine, abbiamo anche illustrato qui gli esperimenti proof-of-concept per etichettare GPCR con fluorofori, mare li rende adatti per esperimenti di rivelazione di singola molecola.
In conclusione, azf è uno strumento versatile per lo studio della struttura e della funzione di GPCR. Abbiamo dimostrato che AZF è il sito-specifico incorporata in GPCR espressi in cellule di mammifero utilizzando l'ambra codone sistema di soppressione. Questo permette la modifica di un GPCR in una sola posizione singola. La struttura e la funzione del recettore marcato possono quindi essere analizzati sia in ambiente nativo membrana plasmatica o in una soluzione detergente. Siamo ora pronti a indagare i complessi di segnalazione GPCR con la flessibilità della sonda AZF.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il generoso sostegno di numerose fondazioni e filantropi (vedi SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
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