Summary
アーカイブホルマリン固定し、パラフィンに包埋（FFPE）の臨床試料は、病気の調査のための貴重な資料である。ここでは、顕微解剖FFPE組織の詳細なプロテオーム解析を可能にする試料調製のワークフローを示す。
Abstract
プリザーブドフラワー臨床材料はヒトの疾患のプロテオミクス研究のためのユニークなソースです。ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）組織の大規模定量分析を可能にする最適化されたプロトコルを記述します。手順は4つの別個のステップを含む。最初のものは、目的の細胞のFFPE材料およびマイクロダイセクションからの切片の調製である。第二工程において、単離された細胞を溶解し、 'フィルタ支援試料調製'（FASP）技術を使用して処理される。このステップでは、タンパク質は、サンプル溶解に使用される試薬から枯渇され、エンドプロテイナーゼのLysC及びトリプシンを用いて2段階で消化される。
各消化後、ペプチドは、別々の画分に回収され、それらの内容は、高感度の蛍光測定を用いて決定される。最後に、ペプチドは、「ピペットチップ」マイクロカラムで分画している。のLysC-ペプチドは、トリプシン、PEに対し、4画分に分離されているptides 2画分に分離される。このようにして調製したサンプルは、10,000のタンパク質の深さまで材料の微量からプロテオームの分析を可能にする。このように、説明したワークフローは、潜在的なバイオマーカーおよび薬物標的の同定のためだけでなく、システム全体のファッション疾患を研究するための強力な手法です。
Introduction
ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン（FFPE）に埋め込むこと保全と臨床組織材料のpathomorphologic調査のための標準的な方法である。保存された組織の顕微鏡検査は、疾患に関連する形態学的変化の同定を可能にし、疾患関連抗原の発生の検出およびスコアリング。典型的には、FFPEサンプルの小さな部分のみがこれらの分析で使用されるので、臨床材料の大量のアーカイブされたままと研究の他のタイプで利用することができる。
最近の十年の間、生命科学の研究は、強力なプロテオミクス技術によって強化されている。この技術は、複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の何千もの同定および定量を可能にします。技術の重要な特徴は、大規模分析のための材料の分だけ量が必要とされることである。最近のプロテオミクス研究は、タンパク質がほぼカンプの規模で研究することができることを実証デリートプロテオーム1、2。調査のこのタイプは、細胞の組成物および疾患において異常なレベルで存在するタンパク質のグループの同定におけるシステム全体の洞察を可能にします。これらの研究は、大質量分析能力を必要とし、一方、最近の研究は、特定の類似の程度は、測定3の一日以内に達成することができることを実証した。
比較的低いサンプル量の要件、保存の臨床サンプルの幅広い利用可能性は、（レビュー4を参照してください）FFPE材料のプロテオミクス探査を可能にする方法を開発するために、私たちと他の人を誘惑。我々は5固定組織からのタンパク質の定量的抽出を可能にするプロトコルを開発した熱処理下でホルマリン固定の可逆性を利用すること。我々は、固定手順は、タンパク質だけでなく、少なくともいくつかの翻訳後修飾だけを保存することが示されている。ホスホorylationおよびN-グリコシル化は、FFPEサンプル5を用いて研究することができるが、そのための前提条件は、十分に制御された組織の収集、記憶および固定条件である。次に、固定組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションおよびプロテオミクスのための反応器ベースの検体処理6,7のための方法を最適化した。大腸がんでの大規模な研究では、臨床材料8からマイクロダイセクションからの7500のタンパク質の定量分析を可能にした。最後に、我々は連続した、二段階のタンパク質消化プロトコル9を適用することにより、顕微解剖材料の探査方法を改善している。単一の酵素を用いて消化共通の戦略と比較して、この手順は、よりユニークなペプチド配列の生成を可能にし、その結果として、タンパク質同定のより高い深さをもたらす。マイクロダイセクションヒト結腸腺腫の分析は、サンプル3当たり9500タンパク質の深さにプロテオーム解析が可能になった。このスタッド中yは、我々は、少なくとも2つのペプチドと88から89パーセントのタンパク質の同定を可能にするサンプルあたり55,000ペプチドをマッピングした。ここでは、LC-MS/MS分析のためのFFPE材料からのサンプルの調製のために最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルは、反応器形式（FASP）6に顕微解剖、単離された細胞の溶解、および試料処理のための組織切片の調製を含む。その後、我々は、ペプチドの収量の分光蛍光定量について説明し、質量分析による最適なペプチドを同定するための重要度の高いタスク。最後に、我々は強力な陰イオン交換体（サックス）ベースのペプチド分画用分離技術を実証する。この方法では、ペプチド分離および最終的なクリーンアップの両方を、ピペットチップ·マイクロカラム10、11を用いて行われる。この手順はオプションですが、マイクログラムを超える数のペプチドは、単一のサンプルから得ることができる研究にお勧めします。 SAX-分画は、実質的にidentの数とダイナミックレンジを増加させることができるificationsとは、タンパク質配列カバー3,10を拡張する。
Protocol
1。計装必須
- マイクロダイセクションとサンプル溶解のための組織切片の作製
- サーモブロック99℃以下沸騰水と一緒にお風呂に設定。
- レーザ動作microdissector（例えばヤシ、ツァイス、ゲッティンゲン、ドイツ）。
- 温度自動調節ベンチトップ遠心分離機、温度は20℃に設定
- エッペンドルフ型処分チューブ用ラックで濡れ室（箱）。
- 37℃に設定したインキュベーター
- マイクロスケール石英キュベット（0.1〜0.2ミリリットル）で近紫外光励起された蛍光の測定を可能にする蛍光光度計。
2。ソリューション
- 「組織溶解緩衝液」（TLB）：0.1 Mトリス-HCl、pH8.0、0.1 M DTT、0.5％（w / v）のポリエチレングリコール20,000、4％SDSである。
- UA液：0.1Mのトリス-HCl、8.5での8 M尿素。 1サンプル当たり1ミリリットルを準備します。 UAおよびIAA溶液は新たに調製日以内に使用しなければならない。
- IAAソリューション：0.05 M IUAにodoacetamide。 1サンプルあたり0.1ミリリットルを用意します。
- エンドプロテアーゼのLys-Cの原液。
- トリプシン、保存溶液。
- 「消化緩衝液」（DB）：0.05 Mトリス-HCl、8.5。 1サンプルあたり0.25ミリリットルを用意します。
- 「トリプトファン標準ソリューション '：1ミリリットル脱イオン水に0.1μgのトリプトファン。
- 「アッセイ緩衝液B '（ABB）：10mMトリス-HCl、pHは7.6。
- ブリットン·ロビンソン広域緩衝液（BRUB）の原液。 0.1 M CH 3 COOH、0.1 MH 3 PO 4、及び0.1 MH 3 BO 3を含有する溶液を調製し、必要なpHを1M NaOHで調整し、（2、4、5、6、および11）。使用前に脱イオン水で5倍に希釈する。
- 脱イオン水中に1％（v / v）のCH 3 COOH：緩衝液。
- 緩衝液B：脱イオン水60％（v / v）のCH 3 CN、1％（v / v）のCH3COOH。
3。ピペットチップと 'StageTip'列
- 共同でEMPOREアニオン膜の6層を積層して、SAXチップ·カラムを準備MMON 0.2ミリリットルピペットチップ。サンプルあたり2 SAXチップの列を作る。
- 0.2ミリリットルピペットチップでEMPORE-C 18の3層を積層して「StageTip」を準備します。各サンプルの6段階のヒントを作る。
4。マイクロダイセクションのための組織切片の調製とサンプル溶解
- ミクロトームでセクションをカット（スライスの厚さはサンプルによって異なります。通常マイクロダイセクションは、7月10日程度のスライスとよく動作します）。
- 45分間のUV光で膜スライド（MembraneSlide 1.0 PEN）を照射します。
- 2時間37℃で照射した膜スライドや乾燥のセクションをマウントします。
- 2.5分、1.5分、キシレン中で2連続したインキュベーションによってマウントされたセクションを脱パラフィン。連続した無水エタノールでインキュベーションし、70％エタノール、および水、1分間ずつ切片を再水和。
- 、20秒間、マイヤーのヘマトキシリンを持つセクションを染色1分、空気乾燥、水で洗い流してください。
- 細胞を収集populatiレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムを用いて、目的の上で。 PALM装置（Zeiss）を使用する場合は、接着剤のキャップ内のサンプル（接着剤キャップ200）を収集。
- キャップ内のマイクロダイセクション材料の上に、TLBの分量をピペット。チューブを閉じて、短い遠心分離によりサスペンションを収集します。溶解1時間攪拌しながら加熱ブロック中で99℃での顕微解剖した組織（600回転）。マイクロダイセクション組織の10 NLのためのバッファの3μlを使用する。
- 10分間18℃で16,000×gでの遠心分離により粗抽出物を明確にする。溶解物を-20℃で凍結保存することができる
5。試料処理
- 液10μl未満がフィルターに残るまで、200限外濾過単位でのUAの液（法医学30K）および14,000×gで遠心分離して明確に溶解液を50μlまで混ぜる。通常、このステップでは、10〜15分の遠心分離を必要とします。
- 限外濾過ユニットにUAの200μlのピペットおよび5.1のように遠心分離します。コレクションチューブを空にします。
- ピペット50 IAA溶液をμLおよび5.1のように、1分遠心のためのサーモミキサーで600rpmで混合します。
- 5.1のように限外濾過ユニットと遠心分離機にUA100μlのピペット。二回、この手順を繰り返します
- 5.1での限外濾過装置や遠心分離機にDBを100μLを加える。二回、この手順を繰り返します。
- 新しいコレクションチューブに濾過ユニットを転送します。ピペット40μL、DBエンドプロテアーゼのLys-C（1:100の総タンパク質比プロテイナーゼ）で、1分間サーモミキサーで600rpmで混合します。 18時間37℃で湿ったチャンバ内でユニットをインキュベートする。
- このような5.1のように、14,000×gでフィルタユニットを遠心分離する。
- 5.1のように、脱イオン水、遠心フィルターユニットのピペット160μL。プールされたフロースルー（5.7および5.8のステップは）エンドプロテイナーゼLysのCでリリースされたペプチドが含まれています
- 新しいコレクションチューブに限外濾過ユニットを転送します。 40μLを追加トリプシンでのDB（タンパク質比1:100酵素）と1分間サーモミキサーで600rpmで混合します。 4時間37℃で湿ったチャンバ内でユニットをインキュベートする。繰り返しますトリプシンペプチドを収集するために5.7と5.8を繰り返します。
6。ペプチドの定量
- トリプトファン残基は溶媒に十分にアクセス可能であるため、タンパク質消化物中のペプチド含量の測定は、希釈緩衝液中で行うことができる。
- 石英キュベットにABBの0.2ミリリットルをピペット「ブランク」のための発光スペクトルを記録します。
- ABBとキュベットと穏やかなミックスに、TSSの1μlをを追加することにより、0.1μgのステップを使用して検量線を作成。
- キュベットを清掃してください。
- サンプルをピペットスペクトル（サンプル）を記録。
- タンパク質およびペプチド濃度の計算
0.1μgのトリプトファンは、B得られたタンパク質の混合物中のトリプトファン含有量の平均1.1％を基準にして約9μgタンパク質（に対応するのでヒト細胞を溶解y）の消化物中のペプチド試料またはコンテンツ内のタンパク質含量は等しい。
ここで、F（標準1）は0.1μgのトリプトファン標準の蛍光である。ペプチド含有量は、消化手順の収率の計算を可能にし、ペプチド分画および質量分析を以下に不可欠な情報を提供する。
7。のLys-Cおよびトリプシンペプチドの分画
- それぞれBRUB pHが11とpHが5の0.2ミリリットルでのLys-Cおよびトリプシンで消化して得られたペプチド溶液を希釈する。
- 遠心チューブ·アダプターのふたにおけるSAXチップカラムを組み立てる。
- BRUB、のLys-C peptiの分離のためのpH 11の0.1ミリリットルを、メタノール0.1ミリリットルで順次、1M NaOHを0.1ミリリットル、3回のSAXチップ·カラムを洗浄し、平衡化DESとBRUB、トリプシンペプチドのためのpHは5で。カラム材料を通る溶液の流れは、4,000×gでの遠心分離によって促進される。
- のLysの分離のための4; 'StageTips' -ウォッシュとC 18平衡化-そしてその後で「StageTips '、メタノール0.05ミリリットル、緩衝液Bの0.05ミリリットルとし、緩衝液Aの0.05ミリリットル6〜18を準備したがCペプチドおよびトリプシンペプチドの分離のため2。
- 「StageTip ' - C 18におけるSAXヒント列を組み立てます。平衡化SAXヒント - 列にサンプル溶液をロードし、3分間5000×gでカラムを遠心する。
- それぞれLYC-Cおよびトリプシンのサンプルに、BRUB、pHが11以上のpH 5の0.1ミリリットルで「ピペットチップ」のカラムを平衡化させます。 5000×gで遠心分離することにより流れを促進。
- 次のC 18にSAXヒント列を転送- 'StageTip」。
- LysのCサンプルおよびBRUでBRUB pHが6,4、および2を有するペプチドの溶出を続けるトリプシンペプチドを含むサンプルのためのB型pHは2。 「StageTip ' -各溶出ステップは、別々のC 18を使用してください。
- 緩衝液Aの0.05ミリリットルと「StageTips ' - C 18を洗う
- 質量分析計を用いて組み立てられたLCシステムへのサンプルの注入のために直接使用バイアルに緩衝液Bを0.05 mlの画分を溶出する。
Representative Results
FFPE材料のプロテオーム解析は、サンプル調製のための堅牢で再現性のある方法が必要になります。この公報では、効果的な固定された材料からの細胞集団の単離および直接LC-MS/MS分析のために使用することができる高純度のペプチド画分が得られるそれらの化学的処理を可能にするプロトコルを示す。 FFPEサンプルとその顕微解剖、MED FASPアプローチを用いて、タンパク質の試料と処理（2）の溶解、および（3）定量および（4）の分画のセクション（1）の調製：手順を4つの部分から構成されペプチド（ 図1）。
手順の最初のステップでは、FFPEサンプルは、ミクロトームで区画され、膜に覆わスライド上にマウント。組織切片スライド膜の表面との密着性を高めるためにUV光でスライド表面を照射する必要がある。この目的のために、我々は、UVランプの光を使用する細胞培養ベンチには統合されています。このステップの後、スライドを試料のパラフィン及び再水和の除去を可能にするの洗浄を受ける。再水和物質を短時間ヘマトキシリンで染色される。これは、サンプルの弱い染色をもたらすしかし顕微解剖用試料領域の可視化のために十分である。染色プロセスは、過剰の水でスライドをリンスすることにより迅速に停止されなければならない。貧しいペプチド利回りのサンプル結果の長期にわたる染色。
次の工程で乾燥した切片を、顕微解剖に供される。個々の細胞の組織領域の選択は、調査の種類に依存し、常に組織学や病理形態に特別な知識を必要とします。レーザ放出された物質は、試料回収チューブの接着面に集光される。接着材料の結合能力が限られているので、それはtまで蓋から顕微解剖材料を転写することが必要であるサンプルのすべての3〜5 平方ミリメートルの解剖の後、彼は、チューブ。これは簡単にふた遠心チューブの短い回転に組織溶解バッファー（LTB）の数マイクロリットルのピペッティングすることによって行うことができる。試料をチューブの底に集められた後、蓋の上顕微解剖及び試料収集を継続することができる。全サンプルが収集されると、チューブは、さらに、パラフィルムで栓をし、1時間連続的に撹拌しながら約99℃の水浴中でインキュベートされなければならない。インキュベーション水の間に蓋の上に凝縮しているので、15分毎にチューブがすぐにチューブコーンで水をバック収集するために遠心分離されなければならない。
ペプチドを得るために、組織溶解物を、MED-FASPアプローチを使用して処理される。この方法では、溶解したタンパク質はシステイン残基でcarboamidomethylated洗剤および他の低分子量物質から除去され、その後、連続して二つの酵素で消化DIFそれらの切断特異性fering：のLysCおよびトリプシンをエンドプロテイナーゼ。各消化工程後にペプチドを、別々の画分に回収される。試料調製のこの部分では、最初に、膜を通過した濾過装置に装填溶液の95％以上になるまで遠心分離工程の各々を継続することが重要である。我々はマイクロダイセクション材料（ 表1）の100 NL（100μgの組織または10ミクロンセクションの10ミリメートル2）あたりのペプチドのこの手順の利回り3-6μgのことを観察した結腸組織とその癌を分析する。組織からの抽出可能な全タンパク質抽出および消化手順は一緒に元の新鮮な組織に対して30〜60％の収率をもたらす組織重量の約10％であるからである。これらの値は、脱水、染色、マイクロダイセクション、および限外濾過単位で未消化サンプルの一部の保持時のタンパク質の損失を反映している。理由なしの抽出と処理n型顕微解剖FFPE組織は、それが重要なサンプルの損失がMED-FASP前工程中に発生する可能性がある75％5のタンパク質からペプチド変換収率をもたらした。この手順で得られたペプチド混合物の重要な特徴は、それらのさらなる分画ペプチド分画工程を容易にし、高純度および質量分析同定である。これは、最近結腸直腸腺腫試料3の分析によって示されている。その研究では、MS / MSのイベントの約40％は、FFPE組織からのペプチドが同定された単一のLC-MS/MSの実行ごとに最大17000ペプチドのマッピングされた。より高い識別率は、 インビトロ培養細胞3 のみ凍結の分析において達成された。
全体の手順の2の最後の部分に単離されたペプチドは、定量化されると、ピペットチップ·マイクロカラムで分画し。マイクロダイセクション組織から単離されたペプチドの量があることなので低10μgの彼らは一般的に使用される染料ベースのタンパク質アッセイを用いて定量化することはできません。また、これらの濃度でのA 280 UV-スペクトル測定は、光散乱効果に有用ではない。これとは対照的に、トリプトファン残基の蛍光の測定は、ペプチド含量を測定するための信頼できる方法を提供します。
最近、我々は、培養細胞から最大5,000のタンパク質は「シングルショット」4時間のLC-MS/MS分析7で同定することができることを示している。しかしネイティブの組織に適用されるこの種の分析はほとんど3,000以上の千のタンパク質の同定を可能にしない。分析の深さの増大にMED FASPで生成されたペプチドは、LC-MS/MS前に事前分画されなければならない。 SAXベースのマイクロカラム分離は、簡単で効率的な画法10です。これは、既に固定組織5,8,9を分析ものを含むいくつかのプロテオミクス研究に適用されている。 SAX-'ピペットチップ」microcoluMNS、およびC 18 - 'StageTip'脱塩カラム9は、調製が容易である。カラムは、プラグの積層して組み立て、SAXからカットまたはC 18膜、200μlのピペットチップ11内にある。 SAX-画しFFPEサンプルの分析の例を表1に示す。
図1。手順の概要 。 FFPEサンプルとその顕微解剖、MED FASPアプローチを用いて、タンパク質の試料と処理（2）の溶解、および（3）定量および（4）の分画のセクション（1）の調製：手順を4つの部分から構成されペプチド。
| サンプル | サンプル前分画/消化 | 使用される質量分析計 | ペプチド降伏NG / nLのサンプル（±SD） | 単一のサンプルごとに固有のタンパク質同定 | リファレンス |
| •Adenonocarcinoma •正常な結腸粘膜 | SAX / 1酵素 | オービトラップ-Velos | 36±11（n = 8）の 30±8（N = 8） | 5985±54 5868±110 | 8 |
| •大腸腺腫 | SAX / 2の酵素 | Q Exactive | 56±6.1（n = 3）で | 9501±28 | 3 |
表1。FFPEマイクロダイセクション組織のプロテオーム解析の代表的な結果。
Discussion
核酸配列決定及びマイクロアレイ技術に匹敵深さにプロテオミクス技術によりFFPE材料を研究する能力は、バイオマーカーや創薬ターゲットの発見に新しい展望を開きます。説明されたプロトコルは、特性評価および万タンパク質の規模で顕微解剖した細胞の集団のプロテオームの定量化を可能にします。顕微解剖の材料を使用する場合より少ない小さなデータセットを生成することができるが、おそらく多くの場合、それらはまた、貴重な臨床データを提供することができる。従って、試料のいずれかMED-FASP手順後、直接分析することができる以下の画分に分離することができる。 FASP手順は、プロテアーゼの任意のタイプと互換性があるので、他の酵素またはそれらの組合せは、タンパク質消化物6を用いることができる。
FFPE材料の品質は、分析の中で最も重要な問題であると思われる。私たちは、同じ起源の固定組織ことを経験したが、異なるから来ていますENTクリニックは、異なる特性を有していた。別の診療所から同様の物質がほとんど役に立たなかったのに対し、我々は高い収率でペプチドを生成することができた1のソースから組織を使用して。なお、塗布固定及び包埋手順ならびに保存条件は、臨床材料12の特性に影響を及ぼす主要な要因である可能性がある。そのためには、大規模なプロジェクトを開始する前に、いくつかのサンプルの特性を試験することをお勧めします。
多くの刊行物は、過去にFFPE材料の使用を報告した。しかしながら、これらの研究で同定されたタンパク質の数が1,000〜2,000以上のタンパク質が4を超えなかった。 10,000以上のタンパク質を含むヒト細胞特異的プロテオームの大きさを考えると、このような研究は、ほとんどのハウスキーピング機能に関与して非常に豊富なタンパク質に限ら非常に表面的な映像を提供することだけができました。我々のプロトコルは、臨床的または生物学的物質fの効率的な単離を可能にしますromは、組織を保存し、溶解、タンパク質プロセシングおよびペプチドの前分画のために最適化される。その結果、私たちのサンプル調製ワークフローは、ハイエンドの質量分析に結合されたときには、ほぼ完全なプロテオームへの洞察を可能にします。注目すべきは、これは微細なサンプル量の要件で可能です。
保存された組織を使用することの主な利点は、それらの相対的な広い利用可能性である。 FFPEサンプルを長年して数十年のためにアーカイブし、時には無用であると考え、今、プロテオミクス技術のおかげで、臨床研究のための非常に貴重な資料として表示されます。多くの病気は、FFPE材料の新鮮または凍結材料の調査を使用して研究することができるのに対し、希少疾患12を研究するために特に重要と思われる、サンプルの代表的なセットの集まりだった通常時間がかかります。
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者の方法を実証するための継続的な支援と夫人カタリーナZettlのおかげで博士マティアスマン。
この作品は、科学振興マックス·プランク協会によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
| Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
| Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
| Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
| Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
| Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
| Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |
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