Summary
الفورمالين الأرشيفية ثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) العينات السريرية هي مادة قيمة للتحقيق من الأمراض. نحن هنا يبرهن على وجود إعداد سير العمل عينة مما يتيح تحليل متعمق البروتين من الأنسجة FFPE microdissected.
Abstract
المواد السريرية الحفاظ هو مصدرا فريدا للتحقيق البروتين من اضطرابات الإنسان. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل مما يسمح التحليل الكمي على نطاق واسع من الفورمالين الثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة. ويتألف الإجراء أربع خطوات متميزة. أول واحد هو إعداد الأبواب من المواد FFPE وتسليخ مجهري للخلايا الفائدة. في الخطوة الثانية هي هي lysed الخلايا المعزولة ومعالجتها باستخدام 'تصفية بمساعدة عينة إعداد' (FASP) التقنية. في هذه الخطوة، ونضبت البروتينات من الكواشف المستخدمة للتحلل العينة ويتم هضمها في يومين الخطوات باستخدام endoproteinase LysC والتربسين.
بعد كل عملية الهضم، يتم جمع الببتيدات في كسور منفصلة ويتم تحديد محتواها باستخدام قياس مضان حساسة للغاية. أخيرا، ومجزأة الببتيدات على microcolumns 'ماصة طرف'. يتم فصل LysC-الببتيدات إلى 4 كسور في حين أن المؤسسة العامة زيتيةيتم فصل ptides في 2 الكسور. بهذه الطريقة عينات أعدت تسمح تحليل proteomes من كميات ضئيلة من المواد إلى عمق 10،000 البروتينات. وبالتالي، فإن سير العمل وصفها هي تقنية قوية لدراسة الأمراض في نطاق المنظومة الموضة فضلا عن تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف المخدرات.
Introduction
تحديد مع امتصاص العرق وتضمينها في البارافين (FFPE) هو الأسلوب القياسي لحفظ والتحقيق pathomorphologic المواد الأنسجة السريرية. المجهري للأنسجة المحفوظة يسمح تحديد المرض المرتبطة تغيرات شكلية، وكشف وسجل وقوع المرض مستضدات ذات الصلة. منذ يستخدم عادة سوى جزء صغير من العينة FFPE في هذه التحليلات، لا تزال كميات كبيرة من المواد السريرية أرشفة ويمكن استغلالها في أنواع أخرى من الدراسات.
خلال العقد الأخير تم تعزيز البحوث في علوم الحياة عن طريق التكنولوجيا البروتين قوية. يسمح هذا تقنية التعرف على الهوية والكميات الآلاف من البروتينات في مخاليط معقدة البروتين. سمة هامة من التكنولوجيا هو أن هناك حاجة إلى كميات ضئيلة فقط من المواد ليحلل نطاق واسع. أظهرت دراسات حديثة أن البروتينات البروتين يمكن دراستها على مقياس من شركات تقريباوليته proteomes 1، 2. هذا النوع من التحقيقات تمكن نظام رؤى واسعة في تكوين الخلايا وتحديد مجموعات من البروتينات التي تحدث في مستويات الشاذة في الأمراض. في حين أن هذه الدراسات من القدرات اللازمة الطيفي كتلة كبيرة، وقد أثبتت أعمال حديثة أن مدى مماثلة لتحديد الهوية لا يمكن أن يتحقق في غضون يوم واحد من قياس 3.
متطلبات منخفضة نسبيا كمية العينة، ومدى توافر واسعة من العينات السريرية الحفاظ إغراء لنا وللآخرين لتطوير أساليب تمكين استكشاف البروتين من المواد FFPE (لاستعراض رؤية 4). الاستفادة من عكس اتجاه التثبيت الفورمالين تحت المعالجة الحرارية وضعنا بروتوكولا يسمح استخراج كمية من البروتينات من الأنسجة الثابتة 5. لقد أظهرنا أن الإجراء تثبيت يحفظ البروتينات فحسب، ولكن أيضا على الأقل بعض التعديلات ما بعد النقل. Phosphorylation وN-ارتباط بالغليكوزيل يمكن دراستها باستخدام عينات FFPE 5، ومع ذلك شرطا أساسيا لأنها تسيطر تماما جمع الأنسجة وتخزين وتثبيت الأوضاع. المقبل، ونحن قد اشتركا في تطوير طريقة لالتقاط الليزر تسليخ مجهري للأنسجة الثابتة وللمفاعل على أساس عينة البروتين تجهيز 6، 7. دراسة على نطاق واسع على سرطان القولون والمستقيم يسمح التحليل الكمي من 7،500 البروتينات من microdissected من المواد السريرية 8. أخيرا، فقد قمنا بتحسين طريق استكشاف المواد microdissected من خلال تطبيق مرتين متتاليتين البروتين خطوة الهضم بروتوكول 9. في مقارنة لاستراتيجيات مشتركة باستخدام انزيم الهضم واحد، وهذا الإجراء يمكن توليد المزيد من الببتيدات تسلسل فريدة من نوعها، وبالتالي يؤدي إلى عمق أكبر من تحديد البروتين. تحليل microdissected غدي القولون الإنسان يسمح تحليل البروتين إلى عمق 9،500 البروتينات في عينة 3. في هذا عشيقذ نحن تعيينها 55،000 الببتيدات لكل عينة مما يتيح تحديد 88-89٪ بروتينات مع لا يقل عن 2 الببتيدات. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لإعداد عينات من المواد لتحليلها FFPE LC-MS/MS. ويتألف هذا البروتوكول إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري، تحلل الخلايا المعزولة، وتجهيز العينات في شكل مفاعل (FASP) 6. ثم نحن تصف تقرير spectrofluorometric من غلة الببتيد؛ مهمة ذات أهمية عالية لتحديد الببتيد الأمثل من قبل مطياف الكتلة. أخيرا، علينا أن نظهر مبادل أنيون قوية (ساكس) القائمة على تقنية فصل للتجزئة الببتيد. في هذه الطريقة يتم تنفيذ كل من الفصل الببتيد وتنظيف النهائي خارج باستخدام microcolumns ماصة طرف 10 و 11. هذه الخطوة اختيارية ولكن ينصح في الدراسات التي أكثر من عدد قليل ميكروجرام الببتيدات يمكن الحصول عليها من عينة واحدة. وSAX-تجزئة يمكن زيادة كبيرة في عدد ومجموعة ديناميكية من الايدنتifications وتوسيع نطاق تغطية تسلسل البروتين 3، 10.
Protocol
1. الأجهزة المطلوبة
- إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري وتحلل العينة
- تعيين Thermoblock إلى 99 درجة مئوية أو حمام مع الماء المغلي.
- الليزر microdissector التشغيل (على سبيل المثال النخيل، زايس، غوتنغن، ألمانيا).
- Thermostated مقعد بين كبار الطرد المركزي، ودرجة الحرارة لتعيين 20 ° C.
- غرفة الرطب (المربع) مع رف للإيبندورف من نوع أنابيب التخلص منها.
- تعيين الحاضنة إلى 37 درجة مئوية.
- الطيفي تمكين قياس مضان متحمس بالقرب من ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع cuvettes الكوارتز الصغيرة الحجم (0.1-0.2 مل).
2. حلول
- 'الاحتياطي تحلل الأنسجة "(TLB): 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 M DTT، 0.5٪ (ث / ت) البولي ايثيلين جلايكول 20،000 و 4٪ SDS.
- UA الحل: 8 M اليوريا في 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5. إعداد 1 مل لكل 1 العينة. UA IAA والحلول يجب أن تكون طازجة وتستخدم في غضون يوم واحد.
- الحل IAA: 0.05 M طodoacetamide في UA. إعداد 0.1 مل لكل 1 العينة.
- Endoproteinase ليز-C، محلول المخزون.
- التربسين، محلول المخزون.
- 'الهضم العازلة "(DB): 0.05 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5. إعداد 0.25 مل لكل 1 العينة.
- 'تريبتوفان ستاندرد الحل ": 0.1 ميكروغرام التربتوفان في 1 مل من الماء منزوع الأيونات.
- "الفحص العازلة B '(ABB): 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6.
- محلول المخزون من بريتون وروبنسون العالمي العازلة (BRUB). تحضير محلول يحتوي على 0.1 M CH 3 COOH، 0.1 MH 3 ص 4، و 0.1 MH 3 BO 3 وضبط مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة المطلوبة (2، 4، 5، 6، و 11). قبل الاستخدام تمييع 5 أضعاف مع الماء منزوع الأيونات.
- العازلة ج: 1٪ (ت / ت) CH 3 COOH في الماء منزوع الأيونات.
- العازلة B: 60٪ (ت / ت) CH 3 CN، 1٪ (ت / ت) CH3COOH في الماء منزوع الأيونات.
3. تلميح ماصة وأعمدة "StageTip '
- إعداد ساكس طرف عمود بواسطة التراص 6 طبقات من غشاء Empore-انيون في التعاونmmon 0.2 مل طرف ماصة. جعل عمودين ساكس طرف في العينة.
- إعداد 'StageTip من خلال التراص 3 طبقات من Empore-C 18 في تلميح ماصة 0.2 مل. جعل 6 نصائح لمرحلة كل عينة.
4. إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري وتحلل عينة
- قطع المقاطع مع مشراح (سمك شرائح يعتمد على العينة. عادة تسليخ مجهري يعمل بشكل جيد مع شرائح من 7-10 ميكرون).
- أشرق الشرائح الغشاء (MembraneSlide 1.0 PEN) مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 45 دقيقة.
- تحميل المقاطع على الشرائح الغشاء أشرق وجافة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- Deparaffinize المقاطع التي شنت من قبل اثنين من حضانات المتعاقبة في الزيلين لمدة 2.5 دقيقة و 1.5 دقيقة. ترطيب أقسام حضانات بواسطة التوالي في الإيثانول المطلق، و 70٪ من الإيثانول، والمياه، ولكل لمدة 1 دقيقة.
- وصمة عار المقاطع مع الهيماتوكسيلين ماير لمدة 20 ثانية، وشطف مع الماء لمدة 1 دقيقة، والهواء الجاف.
- جمع populati الخليةعلى الاهتمام باستخدام نظام تسليخ مجهري التقاط الليزر. عند استخدام أداة النخيل (زايس) جمع عينات في أغطية لاصقة (لاصق CAP 200).
- ماصة قسامة من TLB على المواد microdissected في الحد الأقصى. إغلاق أنبوب وجمع تعليق من قبل الطرد المركزي قصيرة. ليز الأنسجة microdissected في 99 درجة مئوية في كتلة التدفئة مع الإثارة (600 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة. استخدام 3 ميكرولتر من العازلة لمدة 10 NL من الأنسجة microdissected.
- توضيح استخراج النفط الخام بواسطة الطرد المركزي في 16،000 XG في 18 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يمكن تخزين المحللة المجمدة في -20 درجة مئوية.
5. تجهيز العينة
- خلط ما يصل الى 50 ميكرولتر من المحللة أوضح مع 200 ميكرولتر من UA في وحدات الترشيح الفائق (30K الشرعي) وأجهزة الطرد المركزي في XG 14،000 حتى أقل من 10 ميكرولتر من الحل ستبقى في التصفية. عادة هذه الخطوة يتطلب 10-15 دقيقة الطرد المركزي.
- ماصة 200 ميكرولتر من UA إلى وحدة الترشيح الفائقوأجهزة الطرد المركزي كما في 5.1. تفريغ أنبوب جمع.
- ماصة 50 ميكرولتر من الحل IAA وتخلط في 600 دورة في الدقيقة في خلاط الحرارية لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي كما في 5.1.
- ماصة 100 ميكرولتر من UA إلى وحدة الترشيح الفائق وأجهزة الطرد المركزي كما في 5.1. كرر هذه الخطوة مرتين
- ماصة 100 ميكرولتر من DB إلى وحدة الترشيح الفائق وأجهزة الطرد المركزي في في 5.1. كرر هذه الخطوة مرتين.
- نقل وحدات الترشيح لأنابيب جمع جديدة. ماصة 40 ميكرولتر DB مع endoproteinase ليز-C (بروتين لنسبة البروتين الكلي 1:100) وتخلط في 600 دورة في الدقيقة في خلاط الحرارية لمدة 1 دقيقة. احتضان الوحدات في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي وحدات التصفية في 14،000 XG مثل 5.1.
- ماصة 160 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات وأجهزة الطرد المركزي وحدات التصفية كما في 5.1. وتجمع التدفق من خلال (5.7 و 5.8 الخطوات) يحتوي على الببتيدات الصادرة عن endoproteinase ليز C.
- نقل وحدة الترشيح الفائق إلى أنبوب المجموعة الجديدة. إضافة 40 ميكرولترDB مع التربسين (انزيم البروتين إلى نسبة 1:100) وتخلط في 600 دورة في الدقيقة في خلاط الحرارية لمدة 1 دقيقة. احتضان الوحدات في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة. كرر الخطوات من 5.7 و 5.8 لجمع الببتيدات زيتية.
6. الكميات من الببتيدات
- قياس محتوى الببتيد في هضم البروتين يمكن أن يؤديها في المخزن المخفف لأن بقايا التربتوفان يمكن الوصول إليها بشكل جيد للمذيب.
- ماصة 0.2 مل من ABB في كفيت الكوارتز وتسجيل طيف الانبعاث لل'فارغ'.
- إعداد منحنى المعايرة باستخدام 0.1 ميكروغرام الخطوات بإضافة 1 ميكرولتر مأخوذة من خدمات الدعم التقني لكفيت ومزيج لطيف مع ABB.
- تنظيف كفيت.
- ماصة العينة وتسجيل الطيف (عينة).
- حساب من البروتين والببتيد تركيز
منذ 0.1 ميكروغرام التربتوفان يعادل حوالي 9 ميكروغرام من البروتين (على أساس متوسط 1.1٪ من المحتوى التربتوفان في مخاليط البروتين الحصول عليها بذ lysing الخلايا البشرية) محتوى البروتين من العينة في محتوى أو الببتيد في هضم يساوي:
حيث F (Standard1) هو مضان من 0.1 ميكروغرام مستوى التربتوفان. محتوى الببتيد يسمح حساب العائد من الإجراء الهضم ويوفر المعلومات الضرورية لمتابعة تجزئة الببتيد والتحليل الطيفي الشامل.
7. تجزئة من ليز-C والببتيدات زيتية
- تمييع الحلول الببتيد التي حصلت عليها الهضم مع ليز-C والتربسين مع 0.2 مل من BRUB درجة الحموضة ودرجة الحموضة 5 11، على التوالي.
- تجميع ساكس طرف عمود في أنبوب الطرد المركزي محول الغطاء.
- غسل ويوازن ساكس بلاغ العمود تباعا مع 0.1 مل من الميثانول، 0.1 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 1، و 3 مرات مع 0.1 مل من BRUB، ودرجة الحموضة 11 لفصل ليز-C peptiقصر ومع BRUB، ودرجة الحموضة 5 لالببتيدات زيتية. ومما يسهل تدفق الحلول من خلال المواد عمود بواسطة الطرد المركزي في 4000 ز س.
- غسل ويوازن C 18 - 'StageTips' في وقت لاحق مع، 0.05 مل من الميثانول، ثم مع 0.05 مل من العازلة B ومع 0.05 مل من العازلة A. إعداد ستة C 18 - 'StageTips'؛ 4 للفصل اليس الببتيدات C واثنين لفصل الببتيدات زيتية.
- تجميع ساكس تلميح عمود في ال 18 C - 'StageTip'. تحميل الحلول العينة إلى معايرتها ساكس تلميح الأعمدة والأعمدة في أجهزة الطرد المركزي 5،000 x ج لمدة 3 دقائق.
- تتوازن الأعمدة 'ماصة طرف' مع 0.1 مل من BRUB، ودرجة الحموضة ودرجة الحموضة 11 أو 5 على التوالي إلى LYC-C وعينات زيتية. تسهيل تدفق بواسطة الطرد المركزي في 5000 ز س.
- نقل ساكس تلميح عمود C إلى 18 المقبل - 'StageTip'.
- مواصلة يبلغ حجمه من الببتيدات مع BRUB درجة الحموضة 6، 4، و 2 للعينة ليز C ومع BRUB 2 درجة الحموضة للعينة مع الببتيدات زيتية. لكل خطوة شطف استخدام منفصلة C 18 - 'StageTip'.
- غسل C 18 - 'StageTips' مع 0.05 مل من العازلة A.
- أزل الكسور مع 0.05 مل من العازلة B في قارورة تستخدم مباشرة لحقن العينات في نظام LC تجميعها مع مطياف الكتلة.
Representative Results
تحليل البروتين من المواد FFPE يتطلب أساليب قوية وقابلة للتكرار لإعداد العينة. في هذا المنشور علينا أن نبرهن على بروتوكول يسمح العزلة فعالة من السكان الخلية من المواد الثابتة والمعالجة الكيميائية مما يؤدي إلى كسور عالية النقاء الببتيد التي يمكن استخدامها مباشرة لتحليل LC-MS/MS. تتكون الإجراء من أربعة أجزاء منفصلة: (1) إعداد المقاطع من العينات FFPE وتسليخ مجهري لها، (2) تحلل العينة وتجهيز البروتينات باستخدام نهج MED FASP، و (3) تحديد الكميات و (4) من تجزئة الببتيدات (الشكل 1).
في الخطوة الأولى من الإجراء يتم مقطوع العينات FFPE مع مشراح والتي شنت على غشاء تغطية الشرائح. لزيادة التصاق بين أقسام الأنسجة وسطح الغشاء الشريحة من الضروري أن أشرق على سطح الشريحة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لهذا الغرض نستخدم ضوء مصباح الأشعة فوق البنفسجيةمتكاملة في لمقعد ثقافة الخلية. بعد هذه الخطوة التي يتعرض لها الشرائح ليغسل السماح إزالة البارافين والإماهة من العينات. اتسخت المواد ممهى مع hematoxilin لفترة قصيرة. هذه النتائج في تلطيخ ضعيفة من العينة ولكن يكفي لتصور من مناطق العينة لتسليخ مجهري. عملية تلطيخ لابد من توقف بسرعة قبل الشطف الشرائح مع وجود فائض من المياه. وتلطيخ لفترات طويلة من نتائج العينة في غلة الببتيد الفقراء.
في الخطوة التالية التي يتعرض لها أقسام المجففة لتسليخ مجهري. اختيار المناطق الأنسجة من الخلايا الفردية يعتمد على نوع من التحقيق ويتطلب دائما معرفة محددة في الأنسجة أو المورفولوجيا المرضية. يتم جمع المواد صدر الليزر على الأسطح لاصقة للأنابيب جمع العينات. منذ القدرات ملزم من المواد اللاصقة يقتصر فمن الضروري لنقل المواد microdissected من غطاء لروقال انه بعد تشريح أنبوب من كل 3-5 مم 2 العينة. وهذا يمكن أن يتم بسهولة من قبل pipetting بضع ميكرولتر من العازلة تحلل الأنسجة (LTB) على الغطاء والغزل قصيرة من الأنبوب في جهاز للطرد المركزي. بعد جمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب، ويمكن أن تستمر لتسليخ مجهري وجمع العينات على الغطاء. مرة واحدة ويتم جمع العينة كلها الأنابيب يجب أن تكون مقفول بالإضافة إلى ذلك مع parafilm وحضنت في حمام مائي عند حوالي 99 درجة مئوية مع الإثارة مستمرة لمدة 1 ساعة. منذ خلال المياه الحضانة يتكثف على الغطاء، كل 15 دقيقة الأنابيب يجب أن طرد قريبا لجمع الظهر الماء في أنبوب مخروط.
للحصول على الببتيدات تتم معالجة الأنسجة لست] باستخدام نهج MED-FASP. في هذا الأسلوب يتم استنفاد البروتينات هي lysed من المنظفات وغيرها من المواد منخفضة الوزن الجزيئي، carboamidomethylated في بقايا cysteinyl، ومن ثم هضمها على التوالي مع اثنين من الانزيمات المتنوعةfering في خصوصيات تفككها: endoproteinase LysC والتربسين. بعد كل خطوة الهضم يتم جمع الببتيدات إلى كسور منفصلة. في هذا الجزء من إعداد العينات من المهم أن تواصل كل خطوة من الخطوات الطرد المركزي حتى أكثر من 95٪ من الحل تحميلها في البداية إلى وحدة الترشيح مرت الغشاء. تحليل الأنسجة وسرطان القولون لاحظنا أن هذا الإجراء غلة 3-6 ميكروغرام من الببتيد في 100 NL (100 ميكروغرام الأنسجة أو 10 مم 2 من المادة 10 ميكرون) من المادة microdissected (الجدول 1). منذ البروتين الكلي استخراجها من أنسجة حوالي 10٪ من وزن النسيج إجراءات استخراج والهضم تؤدي معا في العائد 30-60٪ في يتعلق الأنسجة الطازجة الأصلي. هذه القيم تعكس الخسائر من البروتين خلال الجفاف وتلطيخ، تسليخ مجهري، والإبقاء على جزء من العينة غير مهضوم في وحدات الترشيح الفائق. لأن الاستخراج ومعالجة أيأسفرت الأنسجة FFPE ن microdissected في العائد البروتين إلى الببتيد تحويل 75٪ 5 فمن المرجح أن تحدث خسائر الحرجة عينة خلال الخطوات قبل MED-FASP. سمة مهمة من الخلائط الببتيد التي حصل عليها هذا الإجراء هو النقاء العالية مما يسهل مزيد من تجزئة الببتيد عملية تجزئة وتحديد الطيف الكتلي. وقد تم مؤخرا أظهرت ذلك من خلال تحليل عينات من الورم الحميد القولون والمستقيم 3. في تلك الدراسة بقيادة حوالي 40٪ من الأحداث MS / MS لتحديد الببتيدات من الأنسجة FFPE وأسفرت عن تعيين ما يصل إلى 17،000 الببتيدات في واحدة المدى LC-MS/MS. وقد تم تحقيق معدلات أعلى تحديد فقط في تحليل المجمدة في المختبر الخلايا المستزرعة 3.
في اثنين من الأجزاء الأخيرة من الإجراء بأكمله وكميا الببتيدات المعزولة ومجزأة على microcolumns ماصة طرف. منذ كميات من الببتيد معزولة عن الأنسجة microdissected هي أن يكونانخفاض 10 ميكروغرام أنها لا يمكن قياسها كميا باستخدام استخداما قائم على الأصباغ المقايسات البروتين. أيضا القياسات الطيفية للأشعة فوق البنفسجية A 280 في هذه التركيزات ليست مفيدة نظرا لتأثير تشتت الضوء. في المقابل، قياسات مضان من بقايا التربتوفان توفر وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد محتوى الببتيد.
في الآونة الأخيرة أظهرت لنا أن ما يصل إلى 5،000 البروتينات من الخلايا المستزرعة يمكن تحديدها في "طلقة واحدة" 4 تحليل ساعة LC-MS/MS 7. ولكن هذا النوع من التحليل تطبق على أنسجة الأم نادرا ما يسمح بتحديد أكثر من 3،000 آلاف البروتينات. لزيادة عمق تحليل الببتيدات ولدت في MED FASP يجب أن تكون مجزأة مسبقا قبل LC-MS/MS. في عمود فصل الجزئي ساكس تستند هي طريقة بسيطة وفعالة تجزئة 10. وقد تم بالفعل تطبيقه في العديد من الدراسات البروتين بما في ذلك تحليل الأنسجة الثابتة 5 و 8 و 9. للساكس "ماصة طرف 'microcoluMNS، وC 18 - الأعمدة تحلية 'StageTip' 9 هي سهلة التحضير. ويتم تجميع الأعمدة بواسطة التراص من المقابس، وقطع من SAX أو C 18 الأغشية، في 200 ميكرولتر ماصة 11. وترد أمثلة لتحليل العينات FFPE-مجزأة ساكس في الجدول 1.
الشكل 1. نظرة عامة الإجراء. تتكون الإجراء من أربعة أجزاء منفصلة: (1) إعداد المقاطع من العينات FFPE وتسليخ مجهري لها، (2) تحلل العينة وتجهيز البروتينات باستخدام نهج MED FASP، و (3) تحديد الكميات و (4) من تجزئة الببتيدات.
| عينة | عينة ما قبل تجزئة / الهضم | استخدام مطياف الكتلة | العائد الببتيد نانوغرام / عينة NL (± SD) | تعريفات البروتين فريدة من نوعها لكل عينة واحدة | مرجع |
| • Adenonocarcinoma • الغشاء المخاطي للقولون عادي | SAX / انزيم واحد | Orbitrap-VELOS | 36 ± 11 (ن = 8) 30 ± 8 (ن = 8) | 5،985 ± 54 5،868 ± 110 | 8 |
| • الورم الحميد القولون | SAX / اثنين من الانزيمات | س Exactive | 56 ± 6.1 (ن = 3) | 9،501 ± 28 | 3 |
الجدول 1. نتائج الممثل التحليلات البروتين في الأنسجة microdissected FFPE.
Discussion
القدرة على دراسة المواد FFPE من البروتين التكنولوجيا إلى عمق مقارنة مع تسلسل الحمض النووي وتقنيات ميكروأري يفتح آفاقا جديدة في العلامات البيولوجية واكتشاف الهدف المخدرات. بروتوكول صفها تمكن توصيف وتحديد الكميات من proteomes السكان من الخلايا microdissected على مقياس من 10،000 البروتينات. عند استخدام أقل للمواد microdissected يمكن إنشاء قواعد البيانات أصغر، ولكن ربما في كثير من الحالات يمكن أيضا أن توفر تلك البيانات السريرية قيمة. وبالتالي، إما العينات يمكن تحليلها مباشرة بعد العملية MED-FASP أو يمكن فصلها في أقل الكسور. منذ الإجراء FASP متوافق مع أي نوع من الأنزيم البروتيني، والانزيمات الأخرى أو الجمع بينهما يمكن استخدامها من الهضم من البروتين 6.
نوعية المواد FFPE يبدو أن المسألة الأكثر أهمية من التحليل. وقد عانينا من أن الأنسجة الثابتة من نفس الأصل ولكن يأتي من تختلفكان عيادات الأنف والحنجرة خصائص متميزة. استخدام الأنسجة من مصدر واحد وكنا قادرين على توليد عوائد عالية في الببتيدات، في حين كانت مواد مماثلة من عيادة أخرى عديمة الفائدة تقريبا. فمن المحتمل أن تثبيت تطبيق وإجراءات تضمين فضلا عن ظروف التخزين هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على خواص المادة 12 السريرية. وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار خصائص بعض العينات قبل البدء في مشروع أكبر.
وذكرت العديد من المنشورات استخدام المواد FFPE في الماضي. ومع ذلك، فإن عدد من البروتينات التي تم تحديدها في هذه الدراسات لا تتعدى أكثر من 1،000-2،000 البروتينات 4. النظر في حجم proteomes محددة الخلية البشرية تضم أكثر من 10،000 والبروتينات، وكانت فقط قادرة على تقديم صورة سطحية للغاية، وتقتصر تقريبا على البروتينات وفيرة للغاية المشاركة في مهام التدبير المنزلي مثل هذه الدراسات. بروتوكول لدينا تمكن العزلة الفعالة من المواد البيولوجية أو السريرية ومدمج الحفاظ على الأنسجة ويتم تحسينه لتحلل، وتجهيز البروتين والببتيد prefractionation. ونتيجة لذلك لدينا عينة إعداد سير العمل، عندما يقترن إلى مطياف الكتلة الراقية، ويتيح نظرة ثاقبة على proteomes كاملة تقريبا. ملحوظة، وهذا ممكن في متطلبات كمية عينة دقيقة.
والميزة الرئيسية لاستخدام الأنسجة المحفوظة هو توافرها واسعة نسبيا. عينات FFPE أرشفة لسنوات وعقود عديدة، وتعتبر في بعض الأحيان غير مجدية كما، والآن، وذلك بفضل التكنولوجيا البروتين، كما تظهر المواد ذات قيمة عالية للبحوث السريرية. في حين أن العديد من الأمراض يمكن دراستها باستخدام التحقيق المواد الطازجة أو المجمدة من المواد FFPE يبدو أن تكون ذات أهمية خاصة لدراسة الأمراض النادرة 12، وجمع مجموعة تمثيلية من العينة عادة ما يستغرق وقتا طويلا.
Disclosures
المؤلف ليس لديه ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلف بفضل الدكتور ماتياس مان للدعم المستمر والسيدة كاتارينا من Zettl لبيان الأسلوب.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك لتقدم العلوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
| Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
| Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
| Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
| Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
| Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
| Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |
References
- Nagaraj, N., et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Molecular systems biology. 7, 548 (2011).
- Beck, M., et al. The quantitative proteome of a human cell line. Molecular systems biology. 7, 549 (2011).
- Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics. Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).
- Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
- Ostasiewicz, P., et al. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).
- Wisniewski, J. R., et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature. 6 (5), 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers. Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).
- Wisniewski, J. R., et al. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).
- Wisniewski, J. R., Mann, M. Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis. Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome. J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
- Thompson, S. M., et al. Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Proteomics Clin. Appl. , (2012).
