Summary
Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.
Abstract
Étude des cellules en culture (analyse in vitro) a fourni des informations importantes sur les systèmes biologiques complexes. Méthodes et équipements conventionnels pour analyse in vitro sont bien adaptés à l'étude d'un grand nombre de cellules (≥ 10 5) des volumes millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il ya de nombreux cas dans lesquels il est nécessaire ou souhaitable de réduire la taille de la culture pour réduire la consommation des cellules d'intérêt et / ou de réactifs nécessaires à leur culture, stimulation, ou de transformation. Malheureusement, les approches conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle, et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 - 2.000 cellules) en volume à micro-échelles (1 - 20 pi). La plate-forme se compose d'un ensemble de microcapillaires revêtues de fibronectine («chambres de perfusion de cellules"), dans lequel les cultures de micro-échelle sont établis, maintenus et encouragés; un appareil numérique microfluidique (DMF) équipé de «transfert» microcapillaires ("hub central "), dont les cellules itinéraires et des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion; une pompe à seringue à haute précision, qui transportent des puissances de matériaux entre les chambres de perfusion et le moyeu central, et une interface électronique qui permet de contrôler le transport de matières, ce qui est coordonné et automatisé via des scripts préétablis. À titre d'exemple, nous avons utilisé la plate-forme pour faciliter l'étude des réactions suscitées transcription dans les cellules immunitaires lors de défi avec des bactéries. L'utilisation de la plate-forme nous a permis de réduire la consommation de cellules et de réactifs, de minimiser la variabilité expérience à l'expérience, et de réorienter les mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et sa polyvalence, our plate-forme doit trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications, et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.
Introduction
L'étude des cellules maintenues en culture (analyse in vitro) a fourni de précieuses informations sur les principes fondamentaux et les mécanismes moléculaires qui régissent les systèmes biologiques complexes et la santé humaine. Les méthodes conventionnelles de culture, la stimulation et la collecte de cellules d'analyse, qui utilisent des boîtes de Pétri et les plaques de microtitration, ont été conçus pour l'étude de grandes populations de cellules (≥ 10 5) dans des volumes de culture millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il existe de nombreux cas où des quantités limitées de cellules sont disponibles (par exemple des cellules primaires), ou de petites populations de cellules sont souhaitables (par exemple pour réduire la variabilité de cellule à cellule dans la population), ou réactifs nécessaires sont difficiles à obtenir ou trop coûteux (par exemple les facteurs cellulaires sécrétées purifiées). Ces problèmes peuvent être résolus avec succès par révision à la baisse la taille de la culture, qui a l'avantage supplémentaire de réduire la consommation de tous lesréactifs nécessaires à l'analyse 1,2 vitro. Malheureusement, le matériel et les méthodes conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles 3-11 sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires.
Dans ce rapport, nous décrivons l'assemblage et l'utilisation d'une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 - 2.000 cellules) dans des volumes micro-échelle (1 - 20 pi). L'architecture de la plate-forme (figure 1) est de conception modulaire: un ensemble de fibronectine revêtu microcapillaires («chambres de perfusion de cellules" du module) sert de site pour l'établissement, l'entretien et la stimulation des cultures de micro-échelle et une microfluidique numérique (DMF ) 12,13 appareil équipé de "transfert" microcapillaires (module "central hub") 14,15 Cellules itinéraireset des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion. DMF permet à l'utilisateur de régler individuellement plusieurs gouttelettes simultanément et modifier ou réorganiser les manipulations (c. trains de traitement des échantillons de reconfigurer) sans altérer le matériel de l'appareil. Sa grande flexibilité est évidente dans sa récente apparition comme une technologie clé dans un large éventail d'applications, y compris la culture de cellules 16,17, 18,19 dosages enzymatiques, immunologiques 20,21, 22,23 analyse de l'ADN, la transformation des protéines, 24,25 et le traitement des échantillons cliniques. 26,27 Notre hub central tire parti de la flexibilité inhérente aux dispositifs DMF, et améliore encore ce grâce à l'ajout d'interfaces microcapillaires, qui offre la possibilité de réaliser un sous-ensemble de manipulations (par exemple, la culture de cellules) dans les zones périphériques spécialisés modules, plutôt que sur l'appareil lui-même DMF. Cloisonnement des trains de traitement de cette manière simplifie également la conception de l'APLtform architecture (pas besoin de construire un dispositif de DMF qui peut effectuer toutes les étapes de transformation) et facilite son évolution en tant que de nouvelles fonctions sont nécessaires (il suffit d'intégrer de nouveaux modules périphériques que nécessaire). Transport des cellules et des réactifs à l'intérieur du moyeu central est entraîné par électromouillage forces engendrées par l'activation séquentielle des électrodes à l'intérieur du dispositif DMF 13,28, le transport à destination, et à l'intérieur des chambres de perfusion est effectuée par des changements de pression générés par une seringue à haute précision pompe. Tous ces mouvements fluides sont contrôlés via une interface électronique simple et automatisée grâce à l'utilisation de scripts préétablis.
Comme un exemple représentatif, nous démontrons l'utilisation de la plate-forme pour l'étude des réponses transcriptionnelles suscité dans les cellules immunitaires à défi avec des bactéries (Figure 2). La réalisation de ces expériences sur la plate-forme nous a permis de travailler avec de petits nombres de cellules (~ 1000 par expérimentationétat mental), minimiser la variabilité expérience à l'expérience, les réactifs de conserver et re-direct-mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et polyvalence, cette plate-forme devrait trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.
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Protocol
Ce protocole général est conçu pour appuyer l'application de la plate-forme pour un large éventail d'études, les aspects spécifiques à l'étude représentative décrite dans le présent rapport sont séparés entre parenthèses figure 2 illustre une étude représentative réalisée à l'aide du protocole.. Notez que dans le protocole, toutes les commandes "instruire" sont automatisées grâce à l'utilisation de scripts préétablis. Notez aussi que l'étape 2 peut être effectuée en parallèle avec l'étape 1 (par exemple pendant les étapes 1.7 et 1.8), et que l'étape 2.1 est souvent contournés (car les plaques de l'appareil DMF motifs / revêtement peuvent être lavés et réutilisés; voir l'étape 5.2) .
1. Assembler et Remplir les Chambres de perfusion portables
- Enduire les surfaces intérieures de stérilisation (autoclave) microcapillaires (silice fondue; 679 um od, 534 Identifiant du um; 15 cm de long) avec la fibronectine, en demandant à la pompe à seringue pour aspirer une solution de fibronectine stérile (30 pl de 50 pg / ml) dans chaquemicrocapillaires, l'incubation (37 ° C pendant 2 heures), ordonnant la pompe à seringue pour prélever la solution, et en laissant le microcapillaires sec (température ambiante (RT) pendant 6 heures).
- Connecter chaque microcapillaire fibronectine revêtu (chambre de perfusion) à un tube de polycarbonate (500 um de diamètre extérieur, 100 ° du um) et de la tubulure de la pompe à seringue à ports multiples, utilisant des raccords CapTite (6 chambres de perfusion, 8 ports pompe de seringue).
- Utilisation de ruban adhésif, fixer le corps de chaque chambre de perfusion à un bloc de chaleur fixé à la température désirée (37 ° C).
- Plonger les extrémités ouvertes des chambres de perfusion à un réservoir (tube de microcentifuge ou une plaque de microtitrage) des cellules contenant (P388D.1 macrophages murins) en suspension dans du milieu de croissance frais (milieu RPMI-1640, 10% FBS, 500 unités / ml de pénicilline, 500 ug / ml de streptomycine) à une concentration souhaitée (10 6 cellules / ml).
- Demandez à la pompe de la seringue pour dessiner des cellules (10 ul, 10 4 cellules) dans chaque chambre de perfusion suivie d'assez intérimr pour déplacer le bouchon de liquide (~ 4,5 cm) de la partie solidaire du bloc de chauffage.
- Permettre aux cellules d'adhérer aux surfaces intérieures revêtues de fibronectine des chambres de perfusion (37 ° C pendant 1 - 2 h). Dans l'intervalle, transférer les extrémités ouvertes des chambres de perfusion à partir du réservoir de cellules à un nouveau réservoir contenant un milieu de croissance frais.
- Après la période d'adhésion, charger le pousse-seringue pour envoyer les bouchons liquides (milieux conditionnés et les cellules seules) à perdre, retirer du milieu frais (10 pi), et suivre avec assez d'air pour positionner les nouveaux bouchons liquides (milieu frais) sur la adhéré cellules.
- Continuer à mener des échanges moyens (c.-à répéter l'étape 1.7) à intervalles réguliers (toutes les 2 h) jusqu'à ce que les populations cellulaires sont suffisamment équilibrée et étendue (16 à 24 h de culture à petite échelle des populations d'affaires de ~ 1000 cellules / chambre).
2. Fabriquer le dispositif de DMF et assembler l'architecture Hub
- L'utilisation des trames de compression en métal, fixer les plaques de DMF dans un moule polymère 14,30 avec des évidements qui maintiennent un espacement de 400 pm entre les plaques; cet espacement, combinée avec la taille de l'électrode d'actionnement (2,5 mm 2), qui définit le volume de la gouttelette (2,5 pl par électrode). Notez que l'assemblage DMF peut être accompli par des moyens plus simples 24.
- Insert revêtu de Téflon transfert microcapillaires (360 um de diamètre extérieur, 100 ° du um; 3,5 à 4,0 cm de long) dans l'espace entre les plaques DMF, le positionnement de chaque pour s'étendre vers le bord de l'électrode d'actionnement apparenté.
- À la salle opposéd de chaque transfert apposer microcapillaires un raccord CapTite.
- Engager les connecteurs électriques pour fournir une tension aux électrodes d'ITO. séquences d'activation des électrodes sont automatisées grâce à l'utilisation d'une interface électronique commandé par ordinateur exécutant des scripts préétablis.
- En option: Déplacer la plaque tournante du DMF assemblé sur la scène de translation d'un microscope (SZ-6145TR (Olympus, Japon)) équipé d'un dispositif à couplage de charge (CCD) (DCR-HC96 (Sony, Japon)) pour faciliter le suivi de gouttelettes 31.
3. Relier les chambres de perfusion au Hub DMF et stimuler les populations cellulaires
- Retirez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion du réservoir de fluide (voir l'étape 1.6) et insérez-les dans les raccords CapTite fixés aux extrémités du transfert microcapillaires du moyeu DMF (voir l'étape 2.4).
- Demandez à la pompe de la seringue pour envoyer les bouchons liquides (milieux conditionnés) dans les chambres de perfusion à perdre.
- InstRUCT le moyeu du DMF pour dessiner stimulus (E. coli particules biologiques à 100 pg / ml dans du milieu frais contenant 0,1% de Pluronic F127 p / v) à partir d'un réservoir embarqué et délivrer une gouttelette de taille appropriée (10 pl) pour chaque transfert microcapillaire . Les réservoirs de bord sont composés de compartiments de forme cylindrique (1,5 x 1,5 cm chacune) et reliée au moyeu par l'intermédiaire de tubes de DMF.
- Demandez à la pompe à seringue pour aspirer le stimulus se branche sur le transfert microcapillaires, et suivre avec assez d'air pour positionner les bouchons sur les populations de cellules dans les chambres de perfusion.
- Incuber les cellules avec des mesures de relance (37 ° C pendant 1-4 heures). Facultatif: Échange de relance frais (c. répétez les étapes 3,2-3,4) à intervalles réguliers.
4. Mettre fin à la stimulation et récupérer Lysats cellulaires pour l'analyse
- Facultatif: si une période post-stimulation est nécessaire, échanger les bouchons liquides stimulus contenant de milieu frais (c. répétez les étapes 3,2 à 3.4, En remplaçant un milieu frais de relance), et continuer à incuber et échanger si nécessaire.
- Echange les bouchons liquide dans les chambres de perfusion pour le tampon de lavage (Prelude Direct Lysis Buffer Module B) (c. répétez les étapes 3.2 à 3.4, en remplaçant le tampon de lavage de relance), et incuber au besoin (5 min).
- Bourse Les bouchons liquides (tampon de lavage) pour la solution de lyse (Prelude Direct tampon du module de lyse A avec 0,1% de Pluronic F127 w / v) (c. répétez les étapes 3.2 à 3.4, en remplaçant la solution de lyse de relance), et incuber au besoin (5 min) .
- Demandez à la pompe de la seringue pour envoyer les bouchons liquides (lysats cellulaires) au moyeu DMF.
- Démonter le moyeu DMF, retirez la plaque supérieure de l'appareil DMF (en prenant soin de ne pas incliner la plaque de côté, car cela peut entraîner des gouttelettes de mélange), et de recueillir les lysats en utilisant un Pipetman ou une seringue pour une analyse hors-plate-forme (profilage de l'expression génique par qPCR).
5. Propre plate-forme matérielle pourRéutiliser
- Plonger le transfert microcapillaires et raccords CapTite en Javel à 10% (v / v dans l'eau) pendant 10 min à température ambiante, bien rincer avec de l'eau déminéralisée et sec en utilisant de l'azote gazeux.
- Plonger les plaques d'appareils DMF en Javel à 10% pendant 10 min à température ambiante, bien rincer avec de l'isopropanol puis de l'eau déminéralisée et sec en utilisant de l'azote gazeux suivie d'une cuisson à 160 ° C pendant 10 min.
- Le tube de polycarbonate de la seringue pompe, et la fonte de polymère de l'appareil DMF et le cadre de compression, peut être réutilisée sans nettoyage. La perfusion chambre microcapillaires sont jetés après chaque expérience.
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Representative Results
Comme une démonstration de la plate-forme automatisée, nous l'avons utilisé pour réaliser une étude dans laquelle de petites populations de cellules immunitaires ont été cultivées dans des cultures de micro-échelle, contesté par des bactéries, et lysées pour l'analyse hors plate-forme de réponses pro-inflammatoires (Figure 2 ).
Chacune des six chambres de perfusion de cellules a été ensemencé avec 10 4 cellules immunitaires (macrophages murins P388D.1) remises en suspension dans 10 pl de milieu de croissance. Après une période d'adhésion (37 ° C pendant 2 heures) et un moyen d'échange, ~ 500 cellules sont restées attachées aux surfaces intérieures de chaque chambre (figure 3A), telle que mesurée par l'analyse des cultures microscopique répétés (cellules libérées par traitement chélateur et comptés via hémacytomètre et la microscopie optique). En outre incubation à 37 ° C pendant 16 heures, avec des échanges milieu à intervalles de 2 h, a élargi les populations de cellules à ~ 1000 cellules par chambre (figure 3B) (e mesuréeanalyse sommaire des cultures microscopique répétés, comme décrit ci-dessus). Dans quatre des six chambres de perfusion, les populations de cellules ont été exposées à E. bactéries E. coli (bioparticules pHrodo), remises en suspension dans un milieu de croissance, et livrés à une multiplicité d'infection (MOI) de 20 (chaque cellule de la population a été contestée avec 20 bioparticules, en moyenne). Dans les deux chambres restantes, les populations de cellules ont reçu un défi maquette (ie milieu de croissance seulement). Après incubation à 37 ° C pendant 1 heure (deux cultures de bactéries contestées) ou 4 heures (deux bactéries en cause, et deux maquettes contesté, cultures), les cellules ont été lavées et lysées et les lysats récupérés à partir du hub DMF. Méthodes échelle du laboratoire conventionnels ont été utilisés pour préparer des ADNc à partir des lysats, et pour mesurer les niveaux de transcription de médiateurs de l'inflammation: chimiokines MIP-1β (CCL4) et RANTES (CCL5), inductible cyclooxygénase COX-2 (PTGS2), et cytokine TNF (TNF ).
Figure 4 résume les résultats de trois expériences répétées de façon indépendante. Nous avons constaté que les cellules immunitaires cultivés et contestés dans les cultures de micro-échelle (barres rouges) monté réponses transcriptionnelles pro-inflammatoires qui étaient essentiellement identiques à celles obtenues dans des cellules cultivées et contesté dans les cultures conventionnelles (barres bleues). Par ailleurs, les expériences sur les plates-formes (micro-échelle) ont moins de variabilité (comme indiqué par les barres d'erreur plus petits) et consommés petites quantités de cellules et de réactifs (tableau 1).
Figure 1. Photographie de plate-forme automatisée pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire.
Figure 2. Présentation d'une expérience représentative Platform-Enabled: profil transcriptionnel des cellules immunitaires Challenged avec des bactéries dans des cultures de micro-échelle.
Figure 3. Photographies de cellules immunitaires en culture dans une chambre de perfusion micro-échelle. Macrophages murins (lignée cellulaire P388D.1) ont été remises en suspension dans un milieu de croissance à une concentration de 10 6 cellules / ml, et 10 pi (10 4 cellules) utilisés pour ensemencer un fibronectine revêtu de micro-capillaire (chambre de perfusion). Des images à champ clair ont été prises avec un microscope MVX10 (Olympus) équipé d'une caméra CCD (Qimaging). Pour mesurer la taille de la population, les cellules provenant de cultures répétées micro-échelle ont été libérés par les parois de la chambre de perfusion à l'aide Stripper cellulaire, colorées avec du bleu trypan, et comptées en utilisant un hématimètre et microscope optique. A. B. Après 16 h de culture (incubation à 37 ° C avec échanges moyenne toutes les 2 h), la population avait augmenté à ~ 1000 cellules.
Figure 4. Profils de la transcription des cellules immunitaires cultivées et stimulées in navires conventionnels contre Chambers de perfusion micro-échelle. Macrophages murins (lignée cellulaire P388D.1) ont été remises en suspension dans un milieu de croissance à une concentration de 10 6 cellules / ml. Pour les cultures conventionnelles, 50 pi (5 x 10 4 cellules) ont été utilisées pour ensemencer 150 pi de milieu de croissance dans un puits d'une microplaque de 96 puits, des cultures de micro-échelle, 10 pi (10 4 cellules) ont été utilisées pour ensemencer un microcapil fibronectine revêtuLary (chambre de perfusion). Après incubation à 37 ° C pendant 16 heures, les cellules (~ 5 x 10 4 par culture conventionnelle, ~ 10 3 par culture de micro-échelle) ont été exposés à E. bactéries E. coli (bioparticules pHrodo) à une multiplicité d'infection (MOI) de 20 (soit 20 bioparticules pour chaque cellule de la culture); contrôle négatif (maquette contesté) cultures n'ont reçu que des milieux frais. Après une incubation à 37 ° C pendant 1 ou 4 h, les cellules ont été lavées et lysées en utilisant des réactifs du module de lyse directe de Prelude. ARN lysat a été amplifié et converti en ADNc en utilisant Ovation PicoSL WTA, les plus grands (≥ 200 nt) les produits d'ADNc purifiés à l'aide Agencourt RNAClean XP, et ces produits utilisés comme modèle dans des essais qPCR TaqMan pour mesurer les niveaux de transcription pour MIP-1β (CCL4), RANTES (CCL5), la COX-2 (PTGS2), et TNFa (TNF), ainsi que la GAPDH (pour la normalisation des niveaux d'ADNc entre les lysats). Chaque essai qPCR a été réalisée en trois exemplaires, et la moyenne des résultats. Eaexpérience ch a été indépendamment répliqué trois fois. Les barres indiquent augmentation moyenne pli des niveaux de transcrits dans les cultures conventionnelles (bleu) ou de cultures de micro-échelle (rouge) contestées par des bactéries, par rapport au contrôle négatif (maquette contesté) des cultures; barres d'erreur indiquent l'écart type entre les trois expériences.
| Exigence | Expérience conventionnel | Expérience à micro-échelle |
| Cellules | 3,000,000 | 60.000 |
| Croissance moyenne | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Bioparticules | 200 ug | 4 pg |
| Lavage et Lysis Réactifs | 300 pi de chacun | 60 pi de chacun |
Tableau 1. Exigences relatives classique ou micro-échelle expérience de stimulation cellulaires. chiffres sont tirés de l'expérience représentative décrite dans le présent rapport (Figure 2), dans lequel les macrophages murins (lignée cellulaire P388D.1) ont été cultivées dans six (microplaque 96 puits) conventionnel et micro-échelle (chambre de perfusion) cultures , a contesté avec E. bactéries E. coli (bioparticules pHrodo) à une MOI de 20, et lysées pour l'analyse de qPCR.
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Discussion
Nous avons développé une plate-forme automatisée simple et polyvalent pour la culture cellulaire à micro-échelle et des expériences de stimulation. La plate-forme nous permet de travailler avec de petits volumes de culture et les populations cellulaires (1 - 20 pi et 100 - 2.000 cellules, par chambre); dimensions de la culture pourrait être encore réduit par l'utilisation de micro-capillaires de petit diamètre. Travailler à ces échelles de réduire le coût des études de routine et fait des études possibles qui nécessitent l'utilisation de réactifs précieux et / ou de cellules. Expériences plate-forme exécutés montrent également moins de variabilité, vraisemblablement en raison de la précision et la reproductibilité avec laquelle les cellules et les liquides sont traités par la plate-forme automatisée.
La configuration actuelle de la plate-forme s'appuie cellules et le milieu de off-board réservoirs (microtubes ou puits de plaques de microtitration) pour l'ensemencement, l'équilibre, et l'expansion des populations cellulaires dans les chambres de perfusion. C'est un moyen simple de réduire le décalage entreexigences de milieu de croissance (par exemple, 700 pl consommée dans l'expérience décrite ci-dessus représentant) et la capacité de l'appareil DMF à bord des réservoirs (24 pi chacun). Cependant, cette configuration nécessite la mi-expérience intervention manuelle, pour basculer entre les deux réservoirs (étape 1.6) et relier les chambres de perfusion sur le moyeu DMF (étape 3.1). Configurations futures pourraient comprendre de grande capacité (par exemple 1 ml) à bord des réservoirs, ce qui permettrait l'acheminement de tous les matériaux à travers le moyeu DMF, éliminant ainsi le besoin de la mi-expérience intervention manuelle.
Nos expériences nécessaires que la culture à court terme (<24 heures) de cellules sur la plate-forme. Nous avons vérifié que la viabilité des cellules sur la plate-forme est comparable à celle des cultures conventionnelles pour au moins 24 heures (données non présentées). Cependant, nous n'avons pas encore essayé de maintenir les cultures sur la plate-forme pour de plus longues périodes de temps. L'évaporation n'est pas une préoccupation majeure, car la plate-forme dechambres de perfusion et de la croissance des réservoirs de taille moyenne sont des systèmes partiellement fermés et les bouchons de liquide recouvrant les cellules sont facilement reconstituées par échange de milieu. D'autre part, pour maintenir le pH dans des cultures à long terme, il peut être nécessaire pour abriter les réservoirs de milieu de croissance en 5 - 10% de l'atmosphère de CO 2 ou de passage à un milieu de croissance qui ne comprend pas un groupe CO-tampon de pH à base de 2-bicarbonate . En outre, la culture à long terme de activement les cellules en division serait d'élargir les populations au point de confluence (soit une couverture de toutes les surfaces disponibles au sein de la chambre de perfusion), ce qui nécessiterait repiquage des cellules (libération, se laver, diluer, et re-graine) . D'autres ont accompli ce dans les régimes microfluidiques 3,5,6,9,17 et dans sa configuration actuelle la plate-forme devraient être en mesure d'effectuer toutes les manipulations nécessaires. En résumé, nous pensons que des modifications modestes (surtout aux protocoles, plutôt que matériel) notre plate-forme devrait être capable de supporter une culture de cellules de mammifère à long terme. Cela semble une direction avenir particulièrement prometteur, car les méthodes conventionnelles sont de temps et de main-d'œuvre, en ajoutant une capacité de culture à long terme pour le répertoire de notre plate-forme automatisée serait plus permettre à ses utilisateurs de réorienter leur travail de façon plus productive.
Bien que nous ayons testé seulement quelques types cellulaires différents à ce jour (par exemple la lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7; moelle macrophages dérivés d'os murins (BMDM)), la plate-forme doit être capable de s'adapter à pratiquement n'importe quel type de cellules adhérentes. Dans certains cas, il peut être nécessaire de changer le revêtement de la chambre de perfusion de la fibronectine à un autre composant de la matrice extracellulaire (ou un mélange de composants), ou de changer le milieu de croissance, mais ces modifications sont faciles à faire. Travailler avec les types de cellules non-adhérentes pourrait être plus difficile, mais les stratégies d'attache de la cellule ont été couronnés de succès dans des contextes similaires 32-34. Il shoULD être également possible de créer des cultures mixtes composées de plusieurs types de cellules, en effet, la précision avec laquelle la plate-forme gère les cellules et les fluides devrait veiller à ce que la construction de cultures mixtes est hautement reproductible.
En ce qui concerne les stimuli, pratiquement toute substance qui peut être transporté dans un bouchon de liquide aqueux doit être compatible avec notre plate-forme 5,13,16,35. Dans le cas de grandes ou dense particules, qui peuvent se déposer au fil du temps, il peut être nécessaire pour remettre périodiquement les dans les réservoirs; dans le passé, nous avons abordé cette question par l'utilisation de haute densité fluide porteur 36 ou une simple agitation système (données non présentées), les solutions qui devraient être faciles à mettre en œuvre sur notre plate-forme.
Jusqu'à présent, notre caractérisation des cellules cultivées et stimulées sur la plate-forme s'est essentiellement concentrée sur l'analyse qRT-PCR de cachet réponses pro-inflammatoires. Comme une étape, l'analyse suivante complète de til transcriptome de population cellulaire (via des puces à ADN ou le séquençage de la génération (SGS) (c.-à-RNA-Seq 37,38)), est à notre portée, avec une modification modeste de l'étape de préparation de l'ADNc, notre plate-forme et les protocoles devraient être pleinement capable de supporter mondiale études de profilage transcriptionnel. De même, l'analyse des réponses des populations cellulaires au niveau des protéines (par ELISA, immunoprécipitation, spectrométrie de masse, ou puces à protéines) devrait exiger que la modification des étapes de préparation du lysat. La plate-forme prend également en charge l'analyse basée sur l'imagerie des réponses cellulaires. Les cellules peuvent être visualisés dans la chambre de perfusion (par exemple, la figure 3), l'utilisation de surfaces planes (plutôt arrondi) microcapillaires pour le module de chambre de perfusion faciliterait ce type d'analyse. En outre, les cellules peuvent être visualisés sur le moyeu DMF 14,15, avant le semis des chambres de perfusion et / ou après la libération de leur part. Cellules libérées peuvent également être visualisés hors dela plate-forme. Jusqu'à présent, nous avons utilisé la microscopie optique et fluorescence de cellules d'image à toutes ces étapes afin d'analyser leur morphologie, viabilité, le taux de prolifération, et les interactions physiques avec des stimuli (par exemple bioparticules) et l'autre (données non présentées). Microscopie devrait également permettre une analyse de contenu métabolite (évaluée par l'utilisation de colorants fluorescents), l'activité transcriptionnelle (évaluée par l'utilisation de constructions rapporteurs), et les taux de protéines / Localisation (évaluée par l'utilisation de constructions rapporteurs, des constructions de fusion de protéines fluorescentes, et / ou immunocytochimie ). Cellules libérées ont pu être analysés par cytométrie en flux ainsi. Beaucoup de ces analyses pourraient être réalisées entièrement sur la plate-forme dans sa configuration actuelle, d'autres exigeraient une analyse hors plate-forme ou l'intégration de modules spécialisés microfluidiques (par exemple, voir les références 36,39-41) dans la plate-forme via une connexion à la DMF moyeu. Dans l'ensemble, il semble probable tchapeau notre plate-forme se révélera précieux pour permettre une analyse multidimensionnelle des petites populations de cellules, ce qui peut être atteint autrement que par l'utilisation de systèmes robotiques très complexes et coûteux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ronald F. Renzi et Michael S. Bartsch pour leur contribution à la conception et au développement de dispositifs DMF et le moyeu DMF. Cette recherche a été entièrement pris en charge par le Laboratoire de recherche en scène et le programme de développement au Sandia National Laboratories. Sandia est un laboratoire multi-programme géré et exploité par Sandia Corporation, une filiale en propriété exclusive de Lockheed Martin Corporation, pour le ministère de l'Administration nationale de sécurité nucléaire américain de l'Énergie sous contrat DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
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