Summary
Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.
Abstract
Studium der Zellen in Kultur (in vitro-Analyse) hat wichtige Einblicke in komplexe biologische Systeme zur Verfügung gestellt. Herkömmliche Verfahren und Anlagen für die in vitro-Analyse sind gut geeignet, um einer großen Anzahl von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Skala Volumina (≥ 0,1 ml) zu untersuchen. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen es notwendig oder wünschenswert sein, Kultur Größe verkleinern, um den Verbrauch der Zellen von Interesse und / oder Reagenzien für die Kultur, Stimulation oder der Verarbeitung zu reduzieren. Leider haben konventionelle Ansätze nicht unterstützt präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und die Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit verfügbar sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors. In Mikro-Maßstab Volumen - Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine einfache und vielseitige Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (2000 Zellen 100) entwickelts (1 - 20 ul). Die Plattform besteht aus einer Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren ("cell Perfusionskammern"), in dem Mikro-Maßstab Kulturen etabliert, werden beibehalten und angeregt, eine digitale Mikrofluidik (DMF)-Gerät mit "Transfer" Mikrokapillaren ("zentrale Drehscheibe ausgestattet "), die Strecken Zellen und Reagenzien zu und von den Perfusionskammern; eine hochpräzise Spritzenpumpe, die Befugnisse Transport von Materialien zwischen den Perfusionskammern und der zentralen Nabe und eine elektronische Schnittstelle, die Kontrolle über den Transport von Materialien bietet, das ist koordiniert und automatisiert via vorgegebenen Skripten. Als Beispiel haben wir die Plattform zur Untersuchung der transkriptionellen Reaktionen hervorgerufen in Immunzellen auf Herausforderung mit Bakterien zu erleichtern. Die Nutzung der Plattform konnten wir den Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu reduzieren, minimieren Experiment zu Experiment Variabilität und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es verleiht, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, our Plattform sollte den Einsatz in einer Vielzahl von Laboren und Anwendungen zu finden, und als besonders nützlich erweisen bei der Erleichterung der Analyse von Zellen und Stimuli, die in nur begrenzten Mengen sind.
Introduction
Das Studium der Zellen in Kultur gehalten (in vitro-Analyse) hat einen wertvollen Einblick in die grundlegenden Prinzipien und molekularen Mechanismen, die komplexen biologischen Systemen und der menschlichen Gesundheit zur Verfügung gestellt. Die herkömmlichen Methoden für die Kultur, Anregung und Sammlung von Zellen für die Analyse, die Petrischalen und Mikrotiterplatten nutzen, wurden für die Studie von großen Populationen von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Maßstab Kulturvolumina (≥ 0,1 ml) ausgelegt. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen nur geringe Mengen von Zellen zur Verfügung stehen (z. B. primäre Zellen) oder kleine Zellpopulationen sind wünschenswert (zB Zell-zu-Zell-Variabilität in der Bevölkerung zu verringern), oder erforderlichen Reagenzien sind schwierig zu erhalten oder unerschwinglich teuer (zB gereinigte Zellen sezernierten Faktoren). Solche Probleme erfolgreich durch Verkleinerung Kultur Größe angesprochen werden, hat das den zusätzlichen Vorteil der Reduzierung des Verbrauchs allerReagenzien für die in-vitro-Analyse 1,2 erforderlich. Leider herkömmliche Geräte und Methoden unterstützen nicht präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen und Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit zur Verfügung 3-11 sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors.
In diesem Bericht beschreiben wir die Montage und Verwendung eines einfachen und vielseitigen Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (100 - 2.000 Zellen) in Mikro-Maßstab Bände (1 - 20 ul). Die Plattform-Architektur (Abbildung 1) ist modular aufgebaut: eine Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren ("cell Perfusionskammern" Modul) dient als Standort für die Errichtung, Wartung und Stimulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und ein digitaler Mikrofluidik (DMF ) 12,13 Gerät mit "Transfer" Mikrokapillaren ("zentrale Drehscheibe" Modul) 14,15 Routen Zellen ausgestattetund Reagenzien zu und von den Perfusionskammern. DMF ermöglicht dem Anwender individuell ansprechen mehrere Tröpfchen gleichzeitig und zu ändern oder neu zu ordnen die Manipulationen (dh neu Probenaufbereitung Züge), ohne dass die Geräte-Hardware. Seine enorme Flexibilität in seiner jüngsten Entstehung als Schlüsseltechnologie in einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Zellkultur 16,17, Enzymassays 18,19, 20,21 Immunoassays, DNA-Analyse 22,23, Eiweiß Verarbeitung, 24,25 evident und klinischen Probe Verarbeitung. 26,27 Unsere zentrale Drehscheibe nutzt die inhärente Flexibilität DMF Geräte und weiter verbessert sie durch die Zugabe von mikrokapillaren Schnittstellen, die Möglichkeit zur Durchführung einer Teilmenge von Manipulationen (zB Zellkultur) in spezialisierten peripheren bietet Module, und nicht auf der DMF Gerät. Kompartimentierung der Verarbeitung Züge auf diese Weise vereinfacht auch Design der plaTForm Architektur (keine Notwendigkeit, ein Gerät, das DMF durchführen können alle Bearbeitungsschritte zu bauen) und erleichtert seine Entwicklung als neue Funktionen erforderlich sind (einfach Integration neuer Peripherie-Module je nach Bedarf). Transport von Zellen und Reagenzien innerhalb der zentralen Nabe wird durch Elektrobenetzung Kräfte durch sequentielle Aktivierung der Elektroden innerhalb des DMF Gerät erzeugt 13,28 angetrieben, Verkehr nach, von und innerhalb der Perfusionskammern wird von Druckänderungen, die durch eine hochpräzise Spritze erzeugten Strom versorgt Pumpe. Alle diese Bewegungen Fluid über eine einfache elektronische Schnittstelle gesteuert und automatisiert durch Verwendung von vorbestimmten Script.
Als repräsentatives Beispiel zeigen wir die Verwendung der Plattform für die Untersuchung der Transkriptionsaktivität hervorgerufenen Reaktionen in Immunzellen auf Provokation mit Bakterien (Abbildung 2). Die Durchführung dieser Experimente auf der Plattform konnten wir mit einer kleinen Anzahl von Zellen (~ 1.000 pro experimentell arbeitental Bedingung), zu minimieren Experiment zu Experiment Variabilität, konservieren Reagenzien und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es überträgt, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, sollte diese Plattform in einer Vielzahl von Laboratorien und Anwendungen finden und doch besonders nützlich erleichtert Analyse von Zellen und Impulse, die in nur geringe Mengen sind.
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Protocol
Diese allgemeine Protokoll wurde entwickelt, um Anwendung der Plattform für eine Vielzahl von Studien zu unterstützen; Aspekte spezifisch für die repräsentative Studie in diesem Bericht beschrieben sind in Klammern getrennt Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Studie durchgeführt unter Verwendung des Protokolls.. Beachten Sie, dass in dem Protokoll, alle "anweisen"-Befehle durch die Verwendung von vorgegebenen Script automatisiert. Beachten Sie auch, dass Schritt 2 kann in parallel mit Schritt 1 (z. B. während der Schritte 1.7 und 1.8) durchgeführt werden, und dass Schritt 2.1 ist oft umgangen (weil gemustert / beschichtete DMF Gerät Platten können gewaschen und wieder verwendet werden, siehe Schritt 5.2) .
1. Montieren und Bestücken Sie die Zelle Perfusionskammern
- Bestreichen Sie die Innenflächen sterilisiert (autoklaviert) Mikrokapillaren (Fused-Silica; 679 od um, 534 um id; 15 cm lang) mit Fibronektin, durch Anweisen der Spritzenpumpe, um eine sterile Fibronektin-Lösung (30 ul von 50 ug / ml) zu ziehen in jedemmikrokapillaren, Inkubation (37 ° C für 2 Stunden), instruiert die Spritzenpumpe um die Lösung zu entziehen, und lassen die Mikrokapillaren trocken (Raumtemperatur (RT) für 6 Stunden).
- Verbinden Sie jeden fibronektinbeschichtete mikrokapillaren (Perfusionskammer) zu Polycarbonat-Schlauch (500 um od 100 um ID) und der Schlauch mit dem Multi-Port-Spritzenpumpe mit CapTite Armaturen (6 Perfusionskammern, 8-Port-Spritzenpumpe).
- Mit Klebeband, sichern den Körper jedes Perfusionskammer zu einem Heizblock auf gewünschte Temperatur (37 ° C).
- Tauchen die offenen Enden der Perfusionskammern in einem Behälter (microcentifuge Rohr oder Mikrotiterplatte) enthaltenden Zellen (P388D.1 murine Makrophagen) in frischem Wachstumsmedium suspendiert (RPMI-1640, 10% FBS, 500 Einheiten / ml Penicillin, 500 ug / ml Streptomycin) bei gewünschten Konzentration (10 6 Zellen / ml).
- Weisen Sie die Spritzenpumpe an Zellen (10 ul, 10 4 Zellen) in jede Perfusionskammer von genügend ai gefolgt ziehenr, um die Flüssigkeit Stecker (~ 4,5 cm) auf den Abschnitt, der an der Wärme Block bewegen.
- Lassen Sie die Zellen an der mit Fibronectin beschichteten Innenflächen der Perfusionskammern (37 ° C für 1 - 2 Stunden) zur Verfügung. In der Zwischenzeit, übertragen die offenen Enden der Perfusionskammern aus den Zellen Reservoir zu einem neuen Behälter mit frischem Wachstumsmedium.
- Nach dem Festhalten Zeitraum, weisen die Spritzenpumpe, um die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien und ungebunden Zellen) zu senden, um zu verschwenden, zurückzutreten frischem Medium (10 ul), und folgen Sie mit genügend Luft, um die neuen flüssigen Steckern (frisches Medium) über die Haftposition Zellen.
- Weiter zur Durchführung von mittel-Börsen (dh wiederholen Sie Schritt 1.7) in regelmäßigen Abständen (alle 2 Stunden), bis die Zellpopulationen ausreichend äquilibriert und erweiterte (16 - 24 h von Mikro-Maßstab Kultur erzeugten Populationen von ~ 1.000 Zellen / Kammer) sind.
2. Fabricate die DMF Geräte-und zusammenbauen Hub Architektur
- Mit Metalldruckfeder Rahmen fixieren DMF Platten in eine Polymergussfolie 14,30 mit Ausnehmungen, die eine 400 um Abstand zwischen den Platten zu halten; dieser Abstand mit dem Aktivierungselektrode Größe (2,5 mm 2) kombiniert, definiert das Tropfenvolumen (2,5 ul pro Elektrode). Beachten Sie, dass DMF Montage mit einfacheren Mitteln 24 erreicht werden kann.
- Einfügen teflonbeschichteten Übertragung Mikrokapillaren (360 um od, 100 um id; 3.5 - 4.0 cm) in den Raum zwischen den Platten DMF, Positionieren jeder an den Rand der zugehörigen Betätigung Elektrode erstrecken.
- Um die entgegengesetzte end von jedem Transfer mikrokapillaren Anbringung eines CapTite Montage.
- Rasten Sie die elektrischen Anschlüsse nach Spannung an die ITO-Elektroden liefern. Elektrode Aktivierung Sequenzen durch Verwendung eines computergesteuerten elektronischen Schnittstelle ausgeführt vorbestimmten Script automatisiert.
- Optional: Den zusammengesetzten DMF Nabe auf die Translationsbewegung eines Mikroskops (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) mit einer Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) ausgestattet, um zu ermöglichen Tracking von Tröpfchen . 31.
3. Verbinden Sie die Perfusionskammern der DMF Hub und Stimulieren der Zellpopulationen
- Entfernen Sie die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Medium Reservoir (siehe Schritt 1.6) und fügen Sie sie in die CapTite Armaturen angebracht, um die Enden der Übertragung Mikrokapillaren der DMF-Hub (siehe Schritt 2.4).
- Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien) in den Perfusionskammern zu verschwenden senden.
- Inst.ruct die DMF-Hub an Reiz ziehen (E. coli Biopartikel bei 100 ug / ml in frischem Medium mit 0,1% Pluronic F127 w / v) aus einer On-Board-Speicher und liefern ein Tröpfchen von geeigneter Größe (10 ul) zu jedem Transfer Mikrokapillare . Die On-Board-Reservoire von zylinderförmigen Kammern (1,5 x 1,5 cm je) besteht und mit dem DMF Hub über einen Schlauch.
- Weisen Sie die Spritzenpumpe zu zeichnen der Stimulus-Stecker in den Transfer Mikrokapillaren und folgen mit genügend Luft, um die Stecker in den Zellpopulationen in den Perfusionskammern positionieren.
- Inkubieren der Zellen mit Stimulus (37 ° C für 1 - 4 Stunden). Optional: Exchange für neue Impulse (dh wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4) in regelmäßigen Abständen.
4. Beenden Stimulation und Recover Zelllysate für Analysis
- Optional: Wenn ein Post-Stimulation Zeitraum erforderlich ist, tauschen die Stimulus-haltigen Flüssigkeit Stecker für frisches Medium (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3.4, Substitution frischem Medium für Stimulus) und weiter inkubieren und nach Bedarf austauschen.
- Austausch der Flüssigkeit in den Stecker Perfusionskammern für Waschpuffer (Prelude Direkte Lysis Buffer Modul B) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Waschpuffer für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min).
- Tauschen Sie die Flüssigkeit Stecker (Waschpuffer) für die Lyse-Lösung (Prelude Direkte Lysemodul Puffer A mit 0,1% Pluronic F127 w / v) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Lyselösung für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min) .
- Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (Zelllysate) mit dem DMF-Hub senden.
- Demontieren Sie die DMF-Hub, entfernen Sie die obere Platte des DMF-Gerät (mit Pflege nicht auf die Platte seitlich kippen, da dies in Tropfenform Durchmischung führen kann), und sammeln Sie die Lysate mit einem Pipetman oder Spritze für off-Plattform Analyse (Genexpressionsanalysen über qPCR).
5. Saubere Plattform für HardwareRe-use
- Tauchen Sie den Transfer Mikrokapillaren und CapTite Armaturen in 10% Bleichmittel (v / v in Wasser) für 10 min bei RT, gut mit deionisiertem Wasser abspülen und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas.
- Tauchen Sie die DMF Gerät Platten in 10% Bleichmittel für 10 min bei RT, gründlich mit Isopropanol gefolgt von deionisiertem Wasser und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas durch Backen bei 160 ° C für 10 min folgte.
- Die Spritze Pumpe Polycarbonat Schläuche, und der DMF Geräts Polymer Besetzung und Kompression Rahmen kann ohne Reinigung wieder verwendet werden. Die Perfusionskammer Mikrokapillaren werden nach jedem Experiment verworfen.
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Representative Results
Als Demonstration der automatisierten Plattform, haben wir es für die Durchführung einer Studie, in der kleinen Populationen von Immunzellen im Mikro-Maßstab gezüchtet wurden, mit Bakterien herausgefordert, und lysiert für off-Plattform Analyse von pro-inflammatorischen Reaktionen (Abbildung 2 ).
Jeder der sechs Zellen Perfusionskammern wurde mit 10 4 Immunzellen (P388D.1 murine Makrophagen) in 10 ul Wachstumsmedium resuspendiert ausgesät. Nach einer Einhaltung Zeitraum (37 ° C für 2 Stunden) und einem Austausch des Mediums blieb ~ 500 Zellen, die an den Innenflächen der jeweiligen Kammer (3A), wie durch die Analyse der Replikation mikro Kulturen (Zellen über Chelator Behandlung entlassen und gezählt gemessen über Hämazytometer und Lichtmikroskopie). Weitere Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden, mit mittlerer Austausch auf 2 Stunden-Intervallen, erweitert die Zellpopulationen auf ~ 1.000 Zellen pro Kammer (3B) (gemessen thgrobe Analyse replizieren Mikrobereich Kulturen, wie oben beschrieben). In vier der sechs Perfusionskammern wurden die Zellpopulationen mit E. herausgefordert coli-Bakterien (pHrodo Biopartikel), in Wachstumsmedium resuspendiert und verkündet in einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 (dh jede Zelle in der Bevölkerung wurde mit 20 Biopartikel herausgefordert, im Durchschnitt). In den verbleibenden zwei Kammern erhielten die Zellpopulationen ein Mock Herausforderung (dh Nährmedium nur). Nach Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde (zwei Bakterien herausgefordert Kulturen) oder 4 Stunden (zwei Bakterien herausgefordert und zwei mock-herausgefordert, Kulturen) wurden die Zellen gewaschen und lysiert und die Lysate von DMF Nabe gewonnen. Konventionelle Labormaßstab Methoden wurden verwendet, um vorbereitet von den Lysaten cDNA, und Transkripte für Entzündungsmediatoren messen: Chemokine MIP-1β (CCL4) und RANTES (CCL5), induzierbare Cyclooxygenase COX-2 (PTGS2) und Zytokin TNF (TNF ).
Abbildung 4 fasst die Ergebnisse von drei unabhängig repliziert Experimente. Wir fanden, dass Immunzellen gewachsen und herausgefordert in Mikro-Maßstab Kulturen (rote Balken) montiert pro-inflammatorischen transkriptionellen Reaktionen, die im Wesentlichen identisch mit denen in den Zellen ausgelöst gewachsen und herausgefordert in konventionellen Kulturen (blaue Balken) waren. Darüber hinaus zeigten die on-Plattform (Mikro-Skala) Experimente weniger Variabilität (wie von kleineren Fehler Balken angezeigt) und verbraucht geringere Mengen an Zellen und Reagenzien (Tabelle 1).
Abbildung 1. Fotografie automatisierte Plattform für Mikro-Maßstab Handy Stimulation Experimente.
Abbildung 2. Überblick über eine repräsentative Plattform-Enabled Experiment: Transcriptional Profiling von Immunzellen mit Bakterien in Micro-Maßstab Kulturen herausgefordert.
Abbildung 3. Fotografien von Immunzellen in einem Micro-Skala Perfusionskammer kultiviert. Murine Makrophagen (P388D.1 Zelllinie) in Wachstumsmedium wurden bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml resuspendiert und 10 ul (10 4 Zellen) verwendet, um einen Samen Fibronektin beschichteten mikrokapillaren (Perfusionskammer). Hellfeld-Aufnahmen wurden mit einem Mikroskop MVX10 (Olympus) mit einer CCD-Kamera (QImaging) ausgestattet. Um Bevölkerungszahl zu messen, wurden Zellen aus replizieren Mikro-Maßstab Kulturen aus den Perfusionskammer Oberflächen mit Handy Stripper freigegeben, gefärbt mit Trypanblau und zählte mit einem Hämazytometer und Lichtmikroskop. A. B. Nach 16 h Kultur (Inkubation bei 37 ° C mit Medium Austausch alle 2 Std.), war die Bevölkerung auf ~ 1.000 Zellen erweitert.
Abbildung 4. Transcriptional Profile von Immunzellen kultiviert und in konventionelle Schiffe gegenüber Micro-Skala Perfusionskammern stimuliert. Murine Makrophagen (P388D.1 Zelllinie) in Wachstumsmedium wurden bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml resuspendiert. Für konventionelle Kulturen, 50 ul (5 x 10 4 Zellen) wurden auf Saatgut 150 ul Nährmedium in eine Vertiefung einer 96-well Mikrotiterplatten verwendet, für Mikro-Maßstab Kulturen wurden 10 ul (10 4 Zellen) wurden verwendet, um Saatgut ein fibronektinbeschichtete microcapilLary (Perfusionskammer). Nach Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden wurden die Zellen (ca. 5 x 10 4 pro herkömmlichen Kultur ~ 10 3 pro Mikromaßstab-Kultur) mit E. herausgefordert coli-Bakterien (pHrodo Biopartikel) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 (das heißt, 20 Biopartikel für jede Zelle in der Kultur); negative Kontrolle (Mock-herausgefordert) Kulturen erhielten nur frisches Medium. Nach weiterer Inkubation bei 37 ° C für 1 bis 4 Stunden wurden die Zellen gewaschen und lysiert unter Verwendung von Reagenzien aus der Auftakt Direkt Lysemodul. Lysate RNA wurde verstärkt und in cDNA mit Ovation PicoSL WTA, die größeren (≥ 200 nt) cDNA-Produkte unter Verwendung Agencourt RNAClean XP, und diese Produkte als Matrize in TaqMan qPCR-Assays auf Transkript-Gehalte für MIP-1β (CCL4) zu messen, RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2) und TNF (TNF), sowie GAPDH (zur Normalisierung von cDNA Ebenen zwischen Lysate). Jedes qPCR Assay wurde dreifach durchgeführt, und die Ergebnisse gemittelt. Each Experiment wurde dreimal wiederholt unabhängig. Bars zeigen Durchschnittswerte fachen Anstieg der Transkript-Gehalte in konventionellen Kulturen (blau) oder Mikro-Maßstab Kulturen (rot) mit Bakterien herausgefordert, als negative Kontrolle (Mock-herausgefordert) Kulturen verglichen; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung in den drei Experimenten.
| Voraussetzung | Konventionelle Experiment | Micro-Maßstab Experiment |
| Cells | 3.000.000 | 60.000 |
| Growth Medium | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Biopartikel | 200 ug | 4 ug |
| Wash & Lysereagenzien | 300 ul jeder | 60 ul jeder |
Tabelle 1. Anforderungen für konventionelle gegenüber Micro-Wägezelle Stimulation Experiments. Zahlen werden von der repräsentativen Experiment in diesem Bericht beschrieben (Abbildung 2), in dem Mäuse-Makrophagen (P388D.1 Zelllinie) in sechs konventionellen (96-well Mikrotiterplatten) gewachsen waren, wurden im Vergleich zu Mikro-Skala (Perfusionskammer) Kulturen gezogen , forderte mit E. coli-Bakterien (pHrodo Biopartikel) bei einer MOI von 20 und für qPCR Analyse lysiert.
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Discussion
Wir haben eine einfache und vielseitige automatisierte Plattform für die Mikro-Maßstab Zellkultur und Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform ermöglicht es uns, mit kleinen Mengen und Kultur Zellpopulationen (1 - 20 ul und 100 - 2.000 Zellen pro Kammer) arbeiten; Kultur Größen weiter durch Verwendung von Mikrokapillaren von kleineren Durchmesser reduziert werden konnte. Arbeiten bei diesen Skalen reduziert die Kosten für Routine-Untersuchungen und Studien, die machbar macht Gebrauch von wertvollen Reagenzien und / oder Zellen benötigen. Plattform ausgeführten Experimente zeigen auch weniger Variabilität, vermutlich aufgrund der Präzision und Reproduzierbarkeit, mit der Zellen und Flüssigkeiten durch die automatisierte Plattform abgewickelt werden.
Die aktuelle Konfiguration der Plattform zieht Zellen und Medien aus Off-Board-Reservoirs (Reaktionsgefäße oder Mikrotiterplatten) für die Aussaat, Gleichgewicht, und den Ausbau der Zellpopulationen in den Perfusionskammern. Dies ist ein einfacher Weg, um die Diskrepanz zwischen adressierenWachstumsmedium Anforderungen (z. B. 700 ul in der repräsentativen oben beschriebenen Experiment verbraucht) und die Kapazität des DMF Gerät ist on-board Reservoirs (24 ul jeder). Jedoch erfordert diese Konfiguration Mitte Experiment manuelle Eingriffe, um zwischen zwei Reservoirs (Schritt 1.6) einschalten und verbinden die Perfusionskammern der DMF-Hub (Schritt 3.1). Zukünftige Konfigurationen könnten mit großer Kapazität (z. B. 1 ml) on-board Stauseen, welche würde es ermöglichen Routing aller Materialien durch die DMF-Hub, wodurch müssen für Mid-Experiment manuelle Eingriffe.
Unsere Experimente benötigt nur kurzfristig (<24 Stunden) Kultur von Zellen auf der Plattform. Wir haben festgestellt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auf der Plattform vergleichbar mit der in herkömmlichen Kulturen für mindestens 24 h (Daten nicht gezeigt). Wir haben jedoch noch nicht versucht, Kulturen auf der Plattform für längere Zeit aufrecht zu erhalten. Verdunstung ist kein großes Problem, weil die PlattformPerfusionskammern und Wachstum mittelgroßen Stauseen sind teilweise geschlossene Systeme und die Flüssigkeit Stecker Abdeckung der Zellen werden leicht über mittel Austausch aufgefüllt. Auf der anderen Seite, auf pH in Dauerkulturen halten kann es erforderlich sein, um das Wachstumsmedium in einem Behälter untergebracht 5 - 10% CO 2-Atmosphäre oder zu einem Wachstumsmedium, das keine eine CO 2-Bicarbonat-basierten pH-Puffer . Darüber hinaus würde die langfristige Kultur aktiv teilenden Zellen Populationen bis zu dem Punkt der Konfluenz erweitern (dh Abdeckung aller zur Verfügung stehenden Flächen innerhalb der Perfusionskammer), die erfordern würden Passagieren der Zellen (release, waschen, zu verdünnen, und re-seed) . Andere haben dies in mikrofluidischen Regime 3,5,6,9,17 erreicht und in seiner aktuellen Konfiguration sollte die Plattform in der Lage, die Durchführung aller erforderlichen Manipulationen. Zusammenfassend erwarten wir, dass mit bescheidenen Modifikation (in erster Linie auf Protokolle, anstatt Hardware) unserer Plattform sollte c seinapable der Unterstützung langfristiger Säugerzellkultur. Dies wäre eine besonders zukunftsträchtige Richtung scheinen da herkömmliche Methoden zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind, indem eine langfristige Kultur Fähigkeit zum Repertoire unserer automatisierten Plattform würde weiter seinen Benutzern ermöglichen, wieder richten ihre Arbeit produktiver.
Obwohl wir nur ein paar verschiedene Zelltypen bisher (zB Maus-Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7; murine Knochenmark stammende Makrophagen (BMDM)) getestet wurden, sollte die Plattform in der Lage, nahezu jeden Zelltyp Anhänger unterzubringen. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die Perfusionskammer Beschichtung von Fibronectin an einem anderen Bestandteil der extrazellulären Matrix (oder ein Gemisch von Komponenten) zu ändern, oder auf das Wachstumsmedium zu ändern, aber diese Modifikationen leicht gemacht. Arbeiten mit nicht-adhärenten Zelltypen könnte schwieriger sein, aber Zelle Tethering Strategien wurden in ähnlichen Kontexten 32-34 erfolgreich. Es shoULD auch möglich, Mischkulturen aus mehreren Zelltypen besteht schaffen, in der Tat, die Genauigkeit, mit der die Plattform Griffe Zellen und Flüssigkeiten sollten sicherstellen, dass der Bau von Mischkulturen in hohem Maße reproduzierbar.
Im Hinblick auf Reize, sollte praktisch jeder Stoff, der in einer wässrigen Flüssigkeit Stecker transportiert werden kann kompatibel mit unserer Plattform 5,13,16,35. Im Fall von großen oder dichten Teilchen, die absetzen können im Laufe der Zeit, kann es notwendig sein, um periodisch resuspendieren sie in den Reservoirs, in der Vergangenheit haben wir dieses Problem durch den Einsatz von High-Density-Trägerflüssigkeit 36 angesprochen oder ein einfaches Rühren System (Daten nicht gezeigt), Lösungen, die leicht zu auf unserer Plattform implementieren sollte.
Bisher hat unsere Charakterisierung von Zellen kultiviert und auf der Plattform stimuliert hauptsächlich auf qRT-PCR-Analyse von Markenzeichen entzündungsfördernden Reaktionen konzentriert. In einem nächsten Schritt, umfassende Analyse ter Zelle Bevölkerung Transkriptom (via DNA-Microarrays oder Generation Sequencing (SGS) (dh RNA-Seq 37,38)), ist auch in Reichweite, mit bescheidenen Modifikation der cDNA Vorbereitung Schritt, unsere Plattform und Protokolle sollten durchaus in der Lage zur Unterstützung globaler Transkriptions-Profiling Studien. Ebenso sollte bei der Analyse der Zellpopulation Antworten auf Proteinebene (über ELISA, Immunpräzipitation, Massenspektrometrie, oder Protein-Mikroarrays) benötigen nur Modifizierung der Lysat-Zubereitung vor. Die Plattform unterstützt imaging-Analyse von Zell-Reaktionen. Zellen können innerhalb der Perfusionskammer (z. B. Abbildung 3) abgebildet werden, die Nutzung von flacher Oberfläche (anstatt gerundet) Mikrokapillaren für die Perfusionskammer Modul würde diese Art der Analyse zu erleichtern. Zusätzlich können Zellen, die auf der Nabe DMF 14,15 abgebildet werden, vor dem Aussäen der Perfusionskammern und / oder nach dem Lösen von ihnen. Veröffentlicht Zellen können auch aus der abzubildendendie Plattform. Bisher haben wir Licht-und Fluoreszenzmikroskopie zur Bildauswahl Zellen an allen diesen Phasen, um ihre Morphologie Lebensfähigkeit Proliferationsrate und physikalische Wechselwirkungen mit Stimuli (zB Biopartikel) und jede andere (Daten nicht gezeigt). Analyse Mikroskopie sollte auch eine Analyse der Metabolit-Gehalt (überprüft durch Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen) transkriptionelle Aktivität (gemessen durch Verwendung von Reporter-Konstrukte), und Proteinebene / Lokalisierung (beurteilt durch die Verwendung von Reporter-Konstrukte, fluoreszierende Protein-Fusion Konstrukte und / oder Immunzytochemie ). Veröffentlicht Zellen konnten analysiert mittels Durchflusszytometrie als gut. Viele dieser Analysen könnten gänzlich werden auf der Plattform in seiner aktuellen Konfiguration durchgeführt, andere würden off-Plattform Analyse oder Integration von spezialisierten Mikrofluidik-basierte Module benötigen (siehe zB Referenzen 36,39-41) in die Plattform über eine Verbindung zum DMF Hub. Zusammengenommen scheint es wahrscheinlich, tHut unserer Plattform wird sich in ermöglicht multidimensionale Analyse von kleinen Populationen von Zellen, die sonst nur durch den Einsatz von sehr komplexen und teuren Robot-Systeme erreicht werden kann wertvoll.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Ronald F. Renzi und Michael S. Bartsch für ihre Beiträge zur Gestaltung und Entwicklung von DMF-Geräten und dem DMF-Hub. Diese Forschung wurde vollständig durch das Laboratory Directed Forschungs-und Entwicklungsprogramm bei Sandia National Laboratories unterstützt. Sandia ist ein Multi-Programm-Labor verwaltet und von Sandia Corporation, eine hundertprozentige Tochtergesellschaft von Lockheed Martin Corporation, betrieben für das US Department of National Nuclear Energy Security Administration unter Vertrag DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
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- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
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