Summary
Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.
Abstract
Estudio de las células en cultivo (análisis in vitro) ha proporcionado datos importantes en los sistemas biológicos complejos. Métodos y equipos convencionales para el análisis in vitro son muy adecuadas para el estudio de un gran número de células (≥ 10 5) en volúmenes de escala ≥ mililitro (0,1 ml). Sin embargo, hay muchos casos en los que es necesario o deseable que reducir el tamaño cultura para reducir el consumo de las células de interés y / o reactivos necesarios para su cultura, estimulación, o de procesamiento. Desafortunadamente, los enfoques convencionales no soportan una manipulación precisa y reproducible de cultivos de micro-escala, y los sistemas automatizados de microfluidos basados actualmente disponibles son demasiado complejas y especializadas para el uso rutinario por la mayoría de los laboratorios. Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado una plataforma de tecnología simple y versátil para el cultivo automatizado, estimulación, y la recuperación de pequeñas poblaciones de células (100 - 2000 células) en el volumen de micro-escalas (1 - 20 l). La plataforma consta de un conjunto de microcapilares recubiertos de fibronectina ("cámaras de perfusión de células"), dentro de la cual se establecieron cultivos de micro-escala, mantienen, y se estimularon; un dispositivo digital de microfluidos (DMF) equipado con "transferencia" microcapilares ("cubo central "), el cual las células rutas y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión; una bomba de jeringa de alta precisión, que alimenta el transporte de materiales entre las cámaras de perfusión y el eje central, y una interfaz electrónica que proporciona control sobre el transporte de materiales, que es coordinado y automatizado a través de scripts predeterminados. Como un ejemplo, se utilizó la plataforma para facilitar el estudio de las respuestas transcripcionales provocados en las células inmunes al reto con bacterias. El uso de la plataforma nos ha permitido reducir el consumo de las células y los reactivos, minimizar la variabilidad experimento a experimento, y re-directos práctica laboral. Dadas las ventajas que ésta confiere, así como su accesibilidad y versatilidad, Oplataforma ur debe encontrar uso en una amplia variedad de laboratorios y aplicaciones, y ser especialmente útil para facilitar el análisis de las células y los estímulos que están disponibles sólo en cantidades limitadas.
Introduction
El estudio de las células se mantuvieron en cultivo (análisis in vitro) ha proporcionado valiosa información sobre los principios fundamentales y los mecanismos moleculares que regulan los complejos sistemas biológicos y la salud humana. Los métodos convencionales para el cultivo, la estimulación, y colección de las células para el análisis, que utilizan placas de Petri y las placas de microtitulación, se han diseñado para el estudio de grandes poblaciones de células (≥ 10 5) en volúmenes de cultivo escala ≥ mililitro (0,1 ml). Sin embargo, hay muchos casos en los que sólo cantidades limitadas de células están disponibles (por ejemplo, células primarias), o pequeñas poblaciones de células son deseables (por ejemplo, para reducir la variabilidad de célula a célula a través de la población), o reactivos requeridos son difíciles de obtener o prohibitivamente caro (por ejemplo, factores secretados por células purificadas). Estos temas pueden ser abordados con éxito por la escala hasta el tamaño cultura, que tiene el beneficio adicional de reducir el consumo de todos losreactivos necesarios para el análisis en 1,2 vitro. Desafortunadamente, el equipo y los métodos convencionales no soportan la manipulación precisa y reproducible de las culturas micro-escala y los sistemas automatizados de microfluidos basadas actualmente disponibles 3-11 son demasiado complejos y especializados para el uso habitual en la mayoría de los laboratorios.
En este reporte se describe el montaje y el uso de una plataforma de tecnología simple y versátil para el cultivo automatizado, el estímulo y la recuperación de las pequeñas poblaciones de células (100 - 2000 células) en los volúmenes de micro-escala (1-20 l). La arquitectura de la plataforma (Figura 1) es de diseño modular: un conjunto de fibronectina recubierto microcapilares ("cámaras de perfusión de células" módulo) sirve como el sitio para el establecimiento, el mantenimiento, y la estimulación de cultivos de micro-escala, y un microfluídica digital (DMF ) 12,13 14,15 dispositivo equipado con células de rutas "transferencia" microcapilares (módulo central "hub")y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión. DMF permite al usuario resolver individualmente varias gotas al mismo tiempo y cambiar o volver a ordenar las manipulaciones (es decir, volver a configurar los trenes de procesamiento de la muestra) sin alterar el hardware del dispositivo. Su gran flexibilidad es evidente en su reciente aparición como una tecnología clave en una amplia gama de aplicaciones, incluido el cultivo celular 16,17, 18,19 ensayos enzimáticos, inmunoensayos 20,21, 22,23 análisis de ADN, el procesamiento de proteínas, 24,25 y procesamiento de la muestra clínica. 26,27 Nuestro cubo central toma ventaja de la flexibilidad inherente a los dispositivos de DMF, y se mejora aún más mediante la adición de interfaces de microcapilares, lo que proporciona la oportunidad de llevar a cabo un subconjunto de manipulaciones (por ejemplo, cultivo celular) en periférica especializada módulos, en lugar de en el dispositivo de DMF en sí. La compartimentación de los trenes de procesamiento de esta manera también simplifica el diseño de la plaArquitectura TForm (sin necesidad de construir un dispositivo de DMF que pueden llevar a cabo todas las etapas de elaboración) y facilita su evolución como nuevas funciones se requieren (simplemente integrar nuevos módulos periféricos, según sea necesario). Transporte de las células y los reactivos dentro del cubo central es accionado por electrohumectación fuerzas generadas por la activación secuencial de electrodos dentro del dispositivo de DMF 13,28; transporte hacia, desde y dentro de las cámaras de perfusión es impulsado por los cambios de presión generados por una jeringa de alta precisión bomba. Todos estos movimientos fluidos son controlados a través de una interfaz electrónica simple y automatizado a través del uso de secuencias de comandos predeterminados.
Como ejemplo representativo, se demuestra el uso de la plataforma para el estudio de las respuestas transcripcionales provocado en las células inmunes al reto con bacterias (Figura 2). La realización de estos experimentos en la plataforma nos permitió trabajar con un pequeño número de células ~ 1000 por la experimentación (condición de tal), minimizar la variabilidad experimento a experimento, reactivos conservar y volver a dirigir las manos-sobre el trabajo. Dadas las ventajas que ésta confiere, así como su accesibilidad y versatilidad, esta plataforma debe encontrar uso en una amplia variedad de laboratorios y aplicaciones y resultar especialmente útil para facilitar el análisis de las células y los estímulos que están disponibles sólo en cantidades limitadas.
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Protocol
Este protocolo general está diseñada para soportar la aplicación de la plataforma a una amplia variedad de estudios; aspectos específicos para el estudio representativo se describe en este informe se separan entre paréntesis Figura 2 ilustra un estudio representativo llevado a cabo utilizando el protocolo.. Tenga en cuenta que en el protocolo, todos los comandos de "instruir" se automatizan con el uso de scripts predeterminados. Tenga en cuenta también que el paso 2 puede llevarse a cabo en paralelo con el Paso 1 (por ejemplo, durante los pasos 1.7 y 1.8), y que el paso 2.1 es a menudo ignoradas (porque las placas de dispositivos DMF modelado / recubiertos se pueden lavar y volver a utilizarse; ver Paso 5.2) .
1. Ensamble y rellenar las cámaras de perfusión celular
- Escudo las superficies interiores de esterilizado (autoclave) microcapilares (sílice fundida; 679 micras OD, 534 Identificación del micras; 15 cm de largo) con fibronectina, dando instrucciones a la bomba de jeringa para extraer una solución de fibronectina estéril (30 l de 50 mg / ml) en cada unomicrocapilar, incubando (37 ° C durante 2 hr), dando instrucciones a la bomba de jeringa para extraer la solución, y dejar que el microcapilares seco (temperatura ambiente (TA) durante 6 horas).
- Conectar cada microcapilar recubiertos de fibronectina (cámara de perfusión) a un tubo de policarbonato (500 micras OD, 100 Identificación del micras) y el tubo a la bomba de jeringa multi-puerto, el uso de accesorios de CapTite (6 cámaras de perfusión, 8-puerto de la bomba de jeringa).
- Con cinta, asegure el cuerpo de cada cámara de perfusión a un bloque de calor establecidas en la temperatura deseada (37 º C).
- Sumergir los extremos abiertos de las cámaras de perfusión en un depósito (tubo de microcentifuge o placa de microtitulación de) células que contienen (P388D.1 macrófagos murinos) suspendidas en medio de crecimiento fresco (RPMI-1640, 10% de FBS, 500 unidades / ml de penicilina, 500 mg / ml de estreptomicina) a una concentración deseada (10 6 células / ml).
- Instruir a la bomba de jeringa para extraer células (10 l, 10 4 células) en cada cámara de perfusión seguido por suficiente air para mover el tapón de líquido (~ 4,5 cm) a la sección asegurada al bloque de calor.
- Permitir que las células se adhieran a las superficies interiores recubiertas de fibronectina de las cámaras de perfusión (37 ° C durante 1 - 2 h). Mientras tanto, la transferencia de los extremos abiertos de las cámaras de perfusión desde el depósito de las células a un nuevo depósito que contiene medio de cultivo fresco.
- Después del periodo de cumplimiento, instruir a la bomba de jeringa para enviar los tapones de líquido (medio condicionado y las células no unidas) a los residuos, retirar un nuevo medio (10 l), y seguir con el aire suficiente para colocar las nuevas bujías de líquido (medio fresco) sobre el adherido las células.
- Continuar llevando a cabo intercambios media (es decir, repita el Paso 1.7) a intervalos regulares (cada 2 horas) hasta las poblaciones de células son suficientemente equilibrada y amplia (16 - 24 h de cultivo a microescala generados poblaciones de ~ 1.000 células / cámara).
2. Fabrique el dispositivo DMF y Monte la Arquitectura Hub
- El uso de fotogramas de compresión de metal, fijar las placas de DMF en un molde de polímero 14,30 con rebajes que mantienen una separación de 400 m entre las placas; esta separación, combinado con el tamaño del electrodo de accionamiento (2.5 mm 2), define el volumen de la gotita (2,5 l por electrodo). Tenga en cuenta que el conjunto de DMF se puede lograr por medios más simples 24.
- Insertar transferencia revestido de teflón microcapilares (360 micras OD, 100 Identificación del micras; 3.5 - 4.0 cm de largo) en el espacio entre las placas de DMF, posicionar cada uno para extenderse hasta el borde de su electrodo de accionamiento cognado.
- Para la linea de frented de cada transferencia colocar microcapillary un accesorio CapTite.
- Enganche los conectores eléctricos para suministrar voltaje a los electrodos de ITO. Secuencias de activación de electrodos están automatizadas a través del uso de un interfaz electrónico controlado por ordenador ejecutar scripts predeterminados.
- Opcional: Mover el cubo DMF montada en la etapa de traslación de un microscopio (SZ-6145TR (Olympus, Japón)) equipado con un dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara (DCR-HC96 (Sony, Japón)) para facilitar el seguimiento de las gotitas 31.
3. Conecte las cámaras de perfusión al Hub DMF y estimular las poblaciones celulares
- Retire los extremos abiertos de las cámaras de perfusión del depósito de medio (consulte el Paso 1.6) e insertarlos en los conectores CapTite fijados a los extremos de la transferencia microcapilares del cubo DMF (ver Paso 2.4).
- Instruir a la bomba de jeringa para enviar los tapones de líquido (medio acondicionado) en las cámaras de perfusión que perder.
- InstRUCT el cubo de DMF para elaborar estímulo (E. coli biopartículas a 100 g / ml en medio fresco con 0,1% de Pluronic F127 w / v) de un depósito de a bordo y entregar una gota de tamaño apropiado (10 l) a cada transferencia microcapilar . Los reservorios de a bordo se componen de compartimentos con forma cilíndrica (1,5 x 1,5 cm cada una) y conectados al concentrador DMF a través de tubos.
- Instruir a la bomba de jeringa para extraer los tapones de estímulo a la transferencia microcapilares y siga con el aire suficiente para colocar los tapones en las poblaciones de células en las cámaras de perfusión.
- Se incuban las células con el estímulo (37 ° C durante 1 - 4 horas). Opcional: Cambio de un nuevo impulso (es decir, repita los pasos 3.2 a 3.4) a intervalos regulares.
4. Terminar estimulación y recuperación lisados de células para el análisis
- Opcional: Si se requiere un período posterior a la estimulación, intercambiar los tapones de líquidos que contienen estímulo para el medio fresco (es decir, repita los pasos 3,2-30.4, sustituyendo el medio fresco para el estímulo), y continuar a incubar e intercambiar según sea necesario.
- Cambio de los tapones de líquido en las cámaras de perfusión de tampón de lavado (preludio directo Lisis Módulo de Tampón B) (es decir, repita los pasos 3.2 a 3.4, sustituyendo el tampón de lavado para el estímulo), y se incuba según sea necesario (5 min).
- Cambio de los tapones de líquido (tampón de lavado) para la solución de lisis (preludio directo Tampón de Lisis Módulo A con 0,1% de Pluronic F127 w / v) (es decir, repita los pasos 3.2 a 3.4, sustituyendo solución de lisis para el estímulo), y se incuba según sea necesario (5 min) .
- Instrucciones a la bomba de jeringa para enviar los tapones de líquido (lisados celulares) al cubo DMF.
- Desmontar el eje DMF, retire la placa superior del dispositivo DMF (teniendo cuidado de no inclinar el plato de lado, ya que esto puede dar lugar a gota la mezcla), y recoger los lisados utilizando un Pipetman o jeringa para análisis fuera de la plataforma (perfiles de expresión génica mediante qPCR).
5. Plataformas de hardware puro paraReutilización
- Sumergir la transferencia microcapilares y accesorios CapTite en lejía al 10% (v / v en agua) durante 10 min a TA, enjuague bien con agua desionizada, y el uso de gas nitrógeno seco.
- Sumergir las placas de dispositivos DMF en 10% de lejía por 10 min a TA, enjuague bien con isopropanol seguido por agua desionizada, y el uso de gas nitrógeno seco seguido de cocción a 160 ° C durante 10 min.
- El tubo de policarbonato de la bomba de jeringa, y el polímero fundido del dispositivo de DMF y el marco de la compresión, se puede volver a utilizar sin limpieza. La cámara de perfusión microcapilares se desechan después de cada experimento.
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Representative Results
Como una demostración de la plataforma automatizada, lo usamos para llevar a cabo un estudio en el que pequeñas poblaciones de células inmunes se cultivaron en cultivos de micro-escala, desafió con bacterias, y zadas para el análisis fuera de la plataforma de las respuestas pro-inflamatorias (Figura 2 ).
Cada una de las seis cámaras de perfusión de células se sembró con 10 4 células inmunes (P388D.1 macrófagos murinos) se resuspendieron en 10 l de medio de crecimiento. Después de un periodo de adherencia (37 ° C durante 2 horas) y un medio de intercambio, ~ 500 células se mantuvieron unidas a las superficies interiores de cada cámara (Figura 3A), medido a través de análisis de cultivos a microescala replicados (células liberan a través de tratamiento quelante y se contaron mediante hemocitómetro y microscopía de luz). Además incubación a 37 ° C durante 16 horas, con intercambios de medio a intervalos de 2 hr, amplió las poblaciones de células a ~ 1000 células por cámara (Figura 3B) (TH tal como se mideanálisis aproximado de culturas microescala replicar, como se describe más arriba). En cuatro de las seis cámaras de perfusión, las poblaciones de células fueron desafiados con E. bacterias coli (Bioparticles pHrodo), se resuspendieron en medio de crecimiento, y se entregan a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 (es decir, cada célula en la población fue desafiado con 20 Bioparticles, en promedio). En las dos cámaras restantes, las poblaciones de células recibieron un desafío simulada (es decir, sólo medio de crecimiento). Después de la incubación a 37 ° C durante 1 hora (dos cultivos de bacterias impugnadas) o 4 horas (dos bacterias-desafió, y dos maquetas desafió, cultivos), las células se lavaron y se lisaron y los lisados se recuperaron del cubo DMF. Los métodos convencionales a escala de laboratorio se utilizaron para preparar ADNc a partir de los lisados, y para medir los niveles de transcripción para los mediadores de la inflamación: quimioquinas MIP-1β (CCl4) y RANTES (CCL5), inducible de ciclooxigenasa COX-2 (PTGS2), y citoquinas TNF (TNF ).
La Figura 4 resume los resultados de tres experimentos replicados de forma independiente. Encontramos que las células inmunes cultivan y desafiados en cultivos de micro-escala (barras rojas) montado respuestas pro-inflamatorias transcripcionales que eran esencialmente idénticos a los provocados en las células cultivadas y desafiado en cultivos convencionales (barras azules). Por otra parte, los experimentos en la plataforma (micro-escala) mostraron menos variabilidad (como se indica por las barras de error más pequeñas) y se consumen cantidades más pequeñas de las células y los reactivos (Tabla 1).
Figura 1. Fotografía de la Plataforma Automatizada de micro-escala experimentos de estimulación celular.
Figura 2. Visión general de un experimento representativo Platform-Enabled: perfil transcripcional de las células inmunes retados con bacterias en cultivos de micro-escala.
Figura 3. Las fotografías de las células inmunes cultivaron en una cámara de perfusión micro-escala. Macrófagos murinos (línea celular P388D.1) se resuspendieron en medio de cultivo a una concentración de 10 6 células / ml, y 10 l (10 4 células) utilizados para sembrar un fibronectina recubierto microcapillary (cámara de perfusión). Fotografías de campo brillante fueron tomadas con un microscopio MVX10 (Olympus) equipado con una cámara CCD (QImaging). Para medir el tamaño de la población, las células de cultivos de micro-escala réplicas fueron liberados de las superficies de la cámara de perfusión con separador celular, teñidas con azul de tripano, y se contaron usando un hemocitómetro y el microscopio de luz. A. B. Después de 16 horas de cultivo (incubación a 37 ° C con intercambios medio cada 2 hr), la población había aumentado a ~ 1.000 células.
La Figura 4. Perfiles de transcripción de las células inmunes cultivadas y estimuladas en buques convencionales frente a cámaras de perfusión micro escala. Macrófagos murinos (línea celular P388D.1) se resuspendieron en medio de cultivo a una concentración de 10 6 células / ml. Para los cultivos convencionales, 50 l (10 células de 5 x 4) se utilizaron para sembrar 150 l de medio de crecimiento en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos; para cultivos de micro-escala, 10 l (10 células 4) se utilizaron a las semillas un microcapil recubiertos de fibronectinalary (cámara de perfusión). Después de la incubación a 37 ° C durante 16 h, las células (5 x 10 ~ 4 por cultivo convencional, ~ 10 3 por cultivo de micro-escala) fueron desafiados con E. bacterias coli (Bioparticles pHrodo) a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 (es decir, 20 Bioparticles para todas las células en el cultivo); control negativo (maqueta desafiado) cultivos recibieron sólo medio fresco. Después de una incubación adicional a 37 ° C durante 1 o 4 horas, las células se lavaron y se lisaron usando reactivos desde el módulo de lisis directa preludio. Lisado de ARN se amplifica y se convierte en ADNc usando Ovation PicoSL WTA, los (≥ 200 nt) productos de ADNc más grandes purificados usando Agencourt RNAClean XP, y estos productos se utilizan como molde en los ensayos TaqMan qPCR para medir los niveles de transcripción para MIP-1β (CCl4), RANTES (CCL5), la COX-2 (PTGS2), y TNF (TNF), así como GAPDH (para la normalización de los niveles de cDNA entre lisados). Cada ensayo qPCR se llevó a cabo por triplicado, y los resultados promedio. Each experimento se repitió tres veces de forma independiente. Las barras indican el promedio de aumento veces en los niveles de transcripción en cultivos convencionales (azul) o cultivos de micro-escala (rojo) inoculados con bacterias, en comparación con el control negativo (maqueta desafiado) culturas; barras de error indican la desviación estándar a través de los tres experimentos.
| Requisito | Experimento convencional | Experimento Micro-Scale |
| Células | 3000000 | 60000 |
| Medio de Crecimiento | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Biopartículas | 200 g | 4 mg |
| Lavado y reactivos de lisis | 300 l cada uno | 60 l cada uno |
Tabla 1. Requisitos para la convencional frente Micro-Scale Experimental Estimulación Celulars. Los números se extraen del experimento representativo se describe en este informe (Figura 2), en la que los macrófagos murinos (línea celular P388D.1) fueron cultivadas en seis (placa de microtitulación de 96 pocillos) convencional frente a micro-escala (cámara de perfusión) culturas , desafiados con E. bacterias coli (biopartículas pHrodo) a una MOI de 20, y zadas para el análisis qPCR.
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Discussion
Hemos desarrollado una plataforma automatizada simple y versátil para el cultivo celular micro-escala y experimentos de estimulación. La plataforma nos permite trabajar con pequeñas cantidades de cultivos y poblaciones de células (1 - 20 ly 100 - 2000 células por cámara); tamaños cultura podría reducirse aún más mediante el uso de microcapilares de menor diámetro. Trabajar en estas escalas reduce el costo de estudios de rutina y hace que los estudios viables que requieren el uso de reactivos preciosos y / o células. Plataforma experimentos ejecutados también muestran una menor variabilidad, presumiblemente debido a la precisión y reproducibilidad en la que las células y los fluidos están a cargo de la plataforma automatizada.
La configuración actual de la plataforma hace que las células y los medios de comunicación desde fuera del tablero depósitos (tubos de microcentrífuga o pocillos de la placa de microtitulación) para la siembra, el equilibrio, y la expansión de poblaciones de células en las cámaras de perfusión. Esta es una manera simple de hacer frente a la falta de coincidencia entre losrequisitos media de crecimiento (por ejemplo, 700 l consumido en el experimento representativo se ha descrito anteriormente) y la capacidad del dispositivo de DMF hay a bordo depósitos (24 l cada uno). Sin embargo, esta configuración requiere intervención manual mediados de experimento, para cambiar entre los dos depósitos (Paso 1.6) y conectar las cámaras de perfusión al cubo DMF (Paso 3.1). Configuraciones futuras podrían incluir gran capacidad (por ejemplo, 1 ml) a bordo de los embalses, lo que permitiría enrutamiento de todos los materiales a través del cubo DMF, eliminando así la necesidad de intervención manual mediados de experimento.
Nuestros experimentos requieren sólo la cultura de corto plazo (<24 h) de las células en la plataforma. Hemos verificado que la viabilidad celular en la plataforma es comparable a la que en cultivos convencionales para al menos 24 horas (datos no mostrados). Sin embargo, todavía no hemos tratado de mantener los cultivos en la plataforma por períodos más largos de tiempo. La evaporación no es una preocupación importante porque de la plataformacámaras de perfusión y medianos embalses de crecimiento son sistemas parcialmente cerrados y los tapones de líquido de las células se reponen fácilmente a través de medio de intercambio. Por otro lado, para mantener el pH en cultivos a largo plazo puede ser necesario para alojar el medio de reservorios de crecimiento en un 5 - 10% de CO 2 atmósfera o cambiar a un medio de crecimiento que no incluye un tampón de pH basado en CO 2-bicarbonato . Además, el cultivo a largo plazo de células que se dividen activamente se expandiría poblaciones hasta el punto de confluencia (es decir, la cobertura de todas las superficies disponibles dentro de la cámara de perfusión), lo que requeriría paso de las células (de liberación, lavar, diluir, y re-semilla) . Otros han logrado esto en los regímenes de microfluidos 3,5,6,9,17 y en su configuración actual de la plataforma debería ser capaz de llevar a cabo todas las manipulaciones requeridas. En resumen, esperamos que con la modificación modesta (principalmente a los protocolos, en lugar de hardware) nuestra plataforma debe ser capable de apoyar el cultivo de células de mamíferos a largo plazo. Esto parecería una dirección futura particularmente prometedor porque los métodos convencionales son lentos y laboriosos, añadiendo una capacidad de cultivo a largo plazo al repertorio de nuestra plataforma automatizada permitirá seguir sus usuarios para volver a dirigir su trabajo de manera más productiva.
Aunque se ha probado sólo unos pocos tipos de células diferentes hasta el momento (por ejemplo, línea celular de macrófagos murinos RAW264.7; macrófagos derivados de médula ósea murinos (BMDM)), la plataforma debe ser capaz de adaptarse a prácticamente cualquier tipo de célula adherente. En algunos casos, puede ser necesario cambiar el revestimiento de cámara de perfusión de la fibronectina a otro componente de la matriz extracelular (o mezcla de componentes), o para cambiar el medio de crecimiento, pero estas modificaciones se hacen fácilmente. Trabajar con tipos de células no adherentes podría ser más difícil, pero las estrategias de inmovilización de células han sido exitosos en contextos similares 32-34. Se shoULD también ser posible crear cultivos mixtos formados por múltiples tipos de células y, de hecho, la precisión con la que la plataforma se encarga de las células y los fluidos se debe garantizar que la construcción de cultivos mixtos es altamente reproducible.
Con respecto a los estímulos, virtualmente cualquier sustancia que puede ser transportado dentro de un tapón de líquido acuoso debe ser compatible con nuestra plataforma 5,13,16,35. En el caso de partículas grandes o densos, que pueden sedimentarse a lo largo del tiempo, puede ser necesario para volver a suspender periódicamente dentro de los depósitos, en el pasado, hemos abordado este problema mediante el uso de fluido portador de alta densidad 36 o una simple agitación sistema (datos no presentados), soluciones que deben ser fáciles de implementar en nuestra plataforma.
Hasta el momento, nuestra caracterización de células cultivadas y estimuladas en la plataforma se ha centrado fundamentalmente en el análisis QRT-PCR de sello respuestas pro-inflamatorias. Como siguiente paso, el análisis exhaustivo de tque transcriptoma de población celular (a través de microarrays de ADN o Generation Sequencing (SGS) (es decir, RNA-Seq 37,38)), está dentro de su alcance; con modesta modificación de la etapa de preparación de ADNc, nuestra plataforma y los protocolos deben ser plenamente capaces de soportar mundial estudios de perfiles de transcripción. Del mismo modo, el análisis de las respuestas de la población de células a nivel de proteínas (por medio de ELISA, inmunoprecipitación, espectrometría de masas, o microarrays de proteínas) debe requerir sólo la modificación de los pasos de preparación de lisado. La plataforma también soporta análisis de imágenes basado en de las respuestas de células. Las células se pueden obtener imágenes dentro de la cámara de perfusión (por ejemplo, Figura 3), el uso de de superficie plana (en lugar de redondeado) microcapilares para el módulo de cámara de perfusión sería facilitar este tipo de análisis. Además, las células se pueden visualizar en el cubo de DMF 14,15, antes de la siembra de las cámaras de perfusión y / o después de la liberación de ellos. Lanzamiento células también pueden ser reflejados fuera dela plataforma. Hasta ahora, hemos utilizado la microscopía de luz y de fluorescencia para celdas de imagen en todas estas etapas con el fin de analizar su morfología, viabilidad, la tasa de proliferación, y las interacciones físicas con los estímulos (por ejemplo, Bioparticles) y entre sí (datos no mostrados). Microscopía también debe permitir el análisis de contenido de metabolito (evaluado mediante el uso de colorantes fluorescentes), la actividad transcripcional (evaluado a través del uso de construcciones de indicador), y los niveles de proteína / localización (evaluado a través del uso de construcciones indicadoras fluorescentes, construcciones de fusión de proteínas, y / o inmunocitoquímica ). Lanzamiento células pueden analizarse por citometría de flujo como bien. Muchos de estos análisis podría llevarse a cabo exclusivamente en la plataforma en su configuración actual, mientras que otros requerirán análisis fuera de la plataforma o la integración de los módulos de microfluidos basados especializados (por ejemplo, véase Referencias 36,39-41) en la plataforma a través de la conexión a la DMF concentrador. En conjunto, parece probable tsombrero de nuestra plataforma será útil para permitir el análisis multidimensional de las pequeñas poblaciones de células, que de otro modo sólo se pueden alcanzar a través del uso de sistemas robóticos muy complejos y costosos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Ronald F. Renzi y Michael S. Bartsch por sus contribuciones al diseño y desarrollo de dispositivos de DMF y el cubo DMF. Esta investigación fue plenamente apoyada por el Programa de Desarrollo de Laboratorio Director de Investigación y en Sandia National Laboratories. Sandia es un laboratorio multi-programa administrado y operado por Sandia Corporation, una subsidiaria de propiedad total de Lockheed Martin Corporation, para el Departamento de Administración de Seguridad Nuclear Nacional de Energía de los EE.UU. bajo contrato DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
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- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
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