Summary
Här visar vi hur bilden cytometri kan användas för kvantifiering av patogena svampar i association med värdceller i kultur. Denna teknik kan användas som ett alternativ till CFU uppräkning.
Abstract
Studier av de cellulära patogenes mekanismer patogena jästsvampar såsom Candida albicans, Histoplasma capsulatum och Cryptococcus neoformans sysselsätter ofta infektion i mammalievärdar eller värdceller (dvs makrofager) följt av jäst kvantifiering med kolonibildande enhet analys eller flödescytometri. Medan kolonibildande enhet uppräkning har varit den vanligaste metoden inom området, har denna teknik nackdelar och begränsningar, inklusive långsamma tillväxten av vissa svamparter på fasta medier och låga och / eller varierande effektivitet plätering, vilket är särskilt oroande när man jämför tillväxten av vildtyp och mutanta stammar. Flödescytometri kan ge snabb kvantitativ information om jäst lönsamhet har dock anta flödescytometrisk detektion för patogena jästsvampar varit begränsade till ett antal praktiska skäl, inklusive dess höga kostnad och biosäkerhet överväganden. Här visar vi en bild-baseradcytometrisk metod med hjälp av den Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) för kvantifiering av livsdugliga patogena jäst i samodling med makrofager. Våra studier fokuserar på detektion av två humana svamppatogener: Histoplasma capsulatum och Candida albicans H.. capsulatum koloniserar alveolära makrofager genom att replikera i makrofager fagosomen, och här, vi kvantitativt bedöma tillväxten av H. capsulatum jäst i RAW 264.7 makrofager med akridinorange / propidiumjodidfärgning i kombination med bilden cytometry. Vår metod troget recapitulates trender tillväxt, mätt i traditionella kolonibildande enhet uppräkning, men med väsentligt ökad känslighet. Dessutom bedömer vi direkt infektion av levande makrofager med en GFP-uttryckande stam av C. albicans. Vår metodik ger snabb, korrekt och ekonomiskt medel för detektion och kvantifiering av viktiga mänskliga svamppatogener i samband with värdceller.
Introduction
Studier av patogena svampar i samband med sina värdar och / eller värdceller kräver ofta kvantifiering av livsdugliga svampceller under ett tidsförlopp eller under olika infektion förhållanden. Räkning av kolonibildande enheter (CFU) är standard metoden med vilken antalet livsdugliga svampceller har uppmätts, emellertid har denna teknik flera nackdelar och begränsningar. Först många svamparter växer långsamt. Tillväxten av synliga kolonier på fasta medier kan ta 1-2 veckor, betydligt långsammare takten i forskningen. Det andra är manipulation av prover under CFU plätering en mödosam process, eftersom flera utspädningar måste vara pläterad för att säkerställa en uppräknelig antal kolonier. Det tredje är antalet CFU vanligtvis lägre än antalet viabla utstrukna organismer eftersom utstrykningseffektivitet är väl under 100%. Exempelvis kan plätering verkningsgrader för dimorfa svamppatogen Histoplasma capsulatum vara så hög som 90%, men är rutinmässigt så lite som30% och är ännu lägre (10%) för den tillhörande svamp dimorf Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Utstrykningseffektivitet för Candida albicans är också föremål för variation 3. Slutligen står CFU analys för bara levande och aktivt delande celler med förmåga att skapa tillväxt på fasta medier, medan det i många situationer, skulle det vara lämpligt att fastställa förekomsten och koncentrationen av döda och / eller metaboliskt inaktiva celler.
Tidigare har flödescytometriska metoder för kvantifiering av flera patogena svamparter har beskrivits 4-6. Men på grund av biosäkerhet inneslutning frågor som med hjälp av skyddsnivå 2 (BSL2) eller BSL3 nivå patogener på delade flödescytometrar, har antagandet av denna teknik varit begränsad. Liksom flödescytometri, är bilden cytometry en känslig och snabb metod för cell kvantifiering. Däremot kan bilden cytometri utföras på en bråkdel av kostnaden med jämförbara resultat 7 -11. Här beskriver vi metoder för att utföra bilden cytometri av patogena svampar i samband med värdceller. Vi visar våra metoder med två humana svamppatogener: Histoplasma capsulatum och Candida albicans H.. capsulatum är en dimorphic svamppatogen som orsakar respiratorisk sjukdom, hos människor, växer det så spirande jäst och replikerar i alveolära makrofager Candida albicans är en mänsklig commensal art som ibland orsakar candidiasis.. Vi visar att bilden cytometri tillåter snabb kvantifiering av dessa jäst, tillsammans med visualisering kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Infektion av makrofager med H. capsulatum, C. albicans
- 16 h före infektion, utsäde makrofager vid önskad densitet i 24-brunnsplattor. I detta protokoll har en densitet av 3,0 x 10 5 celler / brunn användes.
- Lägg svamp celler i log-fas tillväxt vid en önskad mångfald av infektion (MOI). Detta protokoll kan rymma en rad MOI (0,2-5,0). För infektion av RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, använde vi en MOI på 0,2.
- Efter 1,5 h för att möjliggöra fagocytos, tvätta makrofager tre gånger med PBS för att avlägsna extracellulära svampar.
- Inkubera önskat antal timmar före provet analys. Vid låg MOI (0,2 i vårt experiment), infekterade makrofagceller förblir livskraftiga i flera dagar, och prover kan analyseras ungefär var 12-24 timme.
2. Makrofag Lysis
- Att befria svampar från makrofagceller, ta bort media, tvätta 3 gånger med PBS, ochtillsätt 0,5 ml sterilt vatten. Under dessa förhållanden kommer makrofager lyserar och fungusceller förblir intakt.
- Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Överför lysat till sterilt rör, hålla på is.
- Överför 20 pl lysat till ett separat rör, lägg sedan till 20 ^ AO / PI-lösning. Gå direkt till steg 5: "Provberedning för bild cytometrisk Analysis"
Tre. CFU Plating
- Utför tiospädning av lysat (från steg 2,3) i media.
- Plate 100 pl av varje spädning, i två exemplar, på HMM-agarosplattor. Inkubera plattorna i en fuktig kammare vid 37 ° C med 5% CO2 under 7-8 dagar.
- Manuellt räkna kolonier på plattorna visa minst 100 och högst 1.000 olika kolonier.
4. Visualisering av svampar inom Live makrofager
- Att samla in levande makrofager, tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Tillsätt 0,5 ml PBS och inkubera under 30 min vid 4 ° C.
- För att ta bort makrofager från brunnar vävnadsodling, försiktigt pipettera upp och ned flera gånger. Överför vätskan till sterilt rör, hålla på is.
- Överför 20 pl prov till ett separat rör, lägg sedan till 20 ^ AO / PI-lösning. Gå direkt till steg 5: "Provberedning för bild cytometrisk Analysis".
Fem. Provberedning för bild cytometrisk Analysis
- Pipettera det riktade urvalet grundligt och sedan överföra 20 | il av provet i den disponibla cellen räknekammare.
- Låt cellerna att bosätta sig i kammaren under 30 sek.
- Sätt räknekammare i bilden cytometer.
6. Cellometer Instrumentinställning
- Sätt i fluorescensoptik Moduler: VB-535-402 och VB-660-502 in i systemet och se till att de är låsta på plats.
- VB-535-402 (excitation vid 475 nm, emission vid 535 nm) används för akridinorange och GFP detektion.
- VB-660 till 502 (excitatipå vid 540 nm, är emission vid 660 nm) används för propidiumjodid upptäckt.
- Slå på bilden cytometer och öppna den medföljande programvaran.
7. Cellometer Software Setup
- Välj det förinställda "Typ av analys" och "Cell Type" i analysen rullgardinsmenyn.
- För livsduglighet, utförs analysen optimerad för akridinorange och propidiumjodid detektion.
- För detektion av Candida albicans infektion, är analysen optimerad för GFP upptäckt.
- Välj "Alternativ" längst upp och klicka på "Ta Bakgrundsbild", och låta verksamheten att slutföra.
- Klicka på "Förhandsgranska ljusfält Image".
8. Image Acquisition Procedure
- Sätt det preparerade provet kammaren in i bilden cytometer.
- Använd fokus ratten och justera fokus.
- Väl i fokus, klicka på "Count", och låta bilden förvärvet operation för att slutföra.
- Remove den disponibla räknekammare och kassera på lämpligt sätt.
9. Image Data Analysis
- Koncentration och livskraft mätning
- När räkningen är klar, är koncentrationen och livskraft målceller visas på resultatsidan.
- Klicka på "Exportera" för att exportera data till FCS Express 4 för cell population analys av GFP i Candida albicans infektion experiment.
- FCS Express analys av Candida albicans-infekterade celler
- Importera ". NXDAT" fil till FCS Express 4 och tomt resultaten i en fluorescens histogram.
- Ansök gate cell population till histogrammet att bestämma befolkningen procentandelar av Candida albicans-infekterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde Cellometer cytometer Vision bilden för att övervaka tillväxten av H. capsulatum i makrofagceller. RAW 264.7-celler infekterades med H. capsulatum jästceller och vid olika tidpunkter togs prover underkastades AO / PI-färgning följt av bildbaserad cytometrisk analys. Parallellt analyserades prover av traditionell CFU uppräkning. Vid varje tidpunkt togs prover inkuberades i vatten för att lysera makrofager, och de befriade jästcellerna identifierades genom Cellometer Vision mjukvara (figur 1a och 1b). Vi observerar mycket jämförbara tendenser i koncentrationen av livskraftiga jäst som detekteras av bildbaserade cytometrisk analys och CFU uppräkning vid varje tidpunkt (Figur 1c). Som väntat var det absoluta antalet levande jäst upptäckts av AO / PI färgning genomgående högre än antalet jäst kan kolonibildningen på fast medium som bedömts av CFU-analys, markera teckenificant antalet livskraftiga men icke odlingsbara celler.
Visualisering av svamp celler inom levande makrofager kan åstadkommas med hjälp av GFP-uttryckande jäststammar. Benmärg makrofager (BMDM) infekterades med C. albicans jästceller som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av ADH1-promotorn 12 (figur 2a). Infektion av BMDM med GFP-C. albicans jäst vid multipliciteter av infektion (MOI) som spänner 0,1-10 motsvarade stegvisa ökningar av GFP intensitet inom infekterade makrofager (Figur 2a) samt totala andelen infekterade makrofager (Figur 2b).
Figur 1. Jämförelse av bildbaserade cytometrisk analys till CFU uppräkning av H. capsulatum under in vitro infektion av RAW 264.7 makrofager. (a) RAW 264.7 makrofager infekterades med H. capsulatum jäst med ett MOI på 0,2. Vid 24 timmars intervall efter infektion, var makrofager lyseras och livskraftiga jäst bedöms av AO / PI färgning parallellt med CFU uppräkning. (B) Representant ljusfält (BR) och FL1/FL2 (grön / röd) kombinerade bilder av AO / PI färgade H . capsulatum utsläppt från lyserade RAW 264.7 makrofager. En segmentering algoritm räknas endast AO och PI positiva jäst i de fluorescerande bilder medan de stora PI-färgade RAW 264.7 makrofager (röd) är exkluderade. Bilder fångades under 10x förstoring. (C) Direkt jämförelse av jäst spridning som bedöms av AO / PI färgning och CFU uppräkning. Linjär regressionsanalys av tillväxttrenderna mätt med CFU och Cellometer analys avkastning R2 = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Kvantifiering av BMDM infektion med en GFP-uttryckande stam av C. albicans. (a) Fångad ljusfält (BR) (överst) och fluorescerande (mitten) bilder av GFP-C. albicans smittade BMDMs att öka MOI. Histogram över fluorescensintensiteter visar en ökning av GFP fluorescens intensitet som MOI ökar, vilket innebär en ökning av antalet C. albicans samband med BMDM celler (botten). Programvaran identifieras infekterade BMDMs baserade på tillämpning av en linjär markör vid baslinjen fluorescensintensiteten visas av infekterade kontroll populationen (MOI = 0). (B) Procent infection som en funktion av MOI, som visar en ökning av infekterade BMDMs som MOI ökar. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bild cytometry tillåter användaren att ta högkvalitativa bilder och med hjälp av specialiserad mjukvara, utföra snabba kvantifiering av celler. En potentiell utmaning till antagandet av bilden metri inom området för mikrobiell patogenes är att mikrober som ska räknas är närvarande i en blandad population av celler, inklusive däggdjursvärdceller. Här visar vi att bilden cytometri kan användas för kvantifiering av livsdugliga patogena jäst under in vitro makrofag infektion. Vår metodik inte bara troget recapitulates trender i svampens tillväxt och livskraft observerats under in vitro-makrofag infektion analyser, men den visar förbättrad känslighet jämfört med den traditionella CFU-analysen 13.
Bild cytometri erbjuder flera praktiska fördelar jämfört med antingen CFU uppräkning eller flödescytometri för kvantifiering av jästceller. Vid plätering CFU, laboratoriepersonal måste plattan flera dilutjoner i syfte att säkra en uppräknelig antal celler på varje platta, vilket kan vara mycket arbetskrävande. Bild cytometry eliminerar behovet av flera utspädningar. Tidigare har vi visat att kolonibildning på fasta medier är ofta variabel, och vid mycket låga koncentrationer svampar kan misslyckas med att bilda kolonier alls, medan bilden cytometri möjliggör räkning av celler oberoende av koncentration 13. Förmågan att upptäcka och räkna svampar vid mycket låga koncentrationer kan vara mycket användbar under tidiga skeden av en låg dos infektion, eller vid avslut, då siffror och lönsamhet kan vara på marginalen för upptäckt. Dessutom data som genereras av bilden cytometri finns omedelbart, medan kolonier kan ta flera dagar att bli synliga. Medan många svamparter kan detekteras genom flödescytometri, är möjligheten för korskontaminering ett problem i gemensamma anläggningar. Den räknekammare användes i denna studie ger en signifikant fördel när det gäller biosäkerhet, eftersom det är disposable och fristående. Dessutom erbjuder image cytometri de praktiska fördelarna med lägre pris och ett mindre fotavtryck jämfört med konventionell flödescytometri, vilket kan vara viktigt för mindre forskningslaboratorier 11.
Utöver de praktiska fördelarna, ger bilden cytometri av jästceller information som CFU uppräkning kan inte. Först är CFU uppräkning endast kunna upptäcka svampar som kan fastställa kolonitillväxt på det valda mediet, vilket kanske inte exakt anger antalet livskraftiga svampar som finns i en infektion experiment i realtid. Dessutom kan förmågan att etablera kolonitillväxt på fasta medier skiljer sig vid jämförelse vildtyp och muterade stammar av svampar, vilket kan vara en källa till experimentell partiskhet 14, och dessa dolda fördomar kan avslöjas genom jämförelse av bilden cytometry och CFU kvantifiering av vildtyp och mutanta stammar. När beteendet hos en särskild stam har präglats av Both CFU uppräkning och image cytometri, tror vi att bilden cytometri kan användas som en alternativ form av svamp kvantifiering.
En begränsning av bilden cytometri i allmänhet är att den inte tillåter insamling av så många datapunkter som flödescytometri. Eftersom bilden cytometer härleder kvantitativa data från ett begränsat antal tagna bilder, är det svårt för systemet att samla in uppgifter om hundratusentals till miljontals celler per prov. Emellertid kan denna begränsning kringgås genom att gruppera flera prover i en uppsättning data för analys för att nå liknande datapunkter som en flödescytometer. Vi vill också betona att AO / PI färgning metod som används här är ett sätt att mäta av cellulär livsduglighet, och innebär inte nödvändigtvis cellulär vitalitet och / eller förmåga att etablera tillväxt på fast medium i varje enskilt prov. Därför, medan vår metod ger en enkel metod för levande / döda kvantifiering av jäst, detkommer också vara intressant att undersöka användningen av bilden cytometri i kombination med cellulär metabolism indikatorer såsom FUN-1 15.
Bild cytometry programvara identifierar och räknar celler av intresse baserat på storlek och form, och därför är det helt avgörande att dessa parametrar ställs in noggrant under varje experiment. När man utför bild cytometri med en ny jäststam, föreslår vi att man först jämföra data som genererats från en ren jästkultur de data som genererats från att räkna en blandning av jäst plus värdceller för att säkerställa att parametrarna är inställda så att programvaran kan skilja mellan två celltyper.
I framtiden kommer detta arbete att vara en grund för fortsatt utveckling av metoder för att detektera och kvantifiera mikrober via bilden cytometri. Exempelvis kommer utvecklingen av bild cytometrisk metoder för att upptäcka svampar inom orgel homogenat vara till stor användning i fält. En annan framtida utmaning blir att develop och förbättra bilden cytometric metoder och mjukvara så att den kan användas för kvantifiering av bakterieceller. Med framsteg inom optiska system, digitalkameror, och ett brett utbud av fluorescerande fläckar i fältet, förmågan att avbilda och analysera bakterier befolkningen kan genomföras i bilden cytometrar, vilket kan ge en snabbare metod för koncentration och livskraft eller vitalitet mätning i jämförelse med CFU eller optiska metoder densitet. Sammanfattningsvis är arbetet som presenteras här ett proof-of-concept som visar att bilden cytometri är en känslig metod för kvantifiering av patogena jästsvampar. Den sofistikerade image-baserad cytometrisk analys programvara ger möjlighet att analysera samspelet mellan värdceller och patogena svampar i ett starkt kvantitativt sätt. Denna teknik kan anpassas för att ta upp en rad forskningsfrågor inom området svamp patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna Leo Li-Ying Chan och Benjamin Paradis är anställda av Nexcelom Bioscience LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
