Denne artikel beskriver, hvordan microinject virale vektorer i muse hjerne og derefter teste i klimatiseret sted præference paradigme, der omfatter en erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse fasen.
Mikroinjektion rekombinante adenoassociated virale (rAAV) vektorer, der udtrykker Cre recombinase i særskilte mus hjerneområder til selektivt knockout gener af interesse giver mulighed for øget tidsmæssigt og regionalt specifikke kontrol af gendeletion sammenlignet med eksisterende metoder. Mens betinget sletning også kan opnås ved parring mus, der udtrykker Cre recombinase under kontrol af specifikke genpromotorer med mus, der bærer en floxet gen, stereotaxic mikroinjektion mulighed for målretning af diskrete områder i hjernen på forsøgslederen fastlagte tidspunkter af interesse. I forbindelse med kokain conditioned sted præference og andre kokain adfærdsmæssige paradigmer såsom selvadministration eller psykomotorisk overfølsomhed, der kan involvere tilbagetrækning udryddelse og / eller genindsættelse faser er denne teknik særligt nyttigt i at udforske den unikke bidrag target gener på disse særskilte faser af adfærdsmæssige modeller for kokain-induceret plasticitet. Specifiktdenne teknik giver mulighed for selektiv fjernelse af målgener under diskrete faser af en adfærd til at teste deres bidrag til adfærden tværs af tid. I sidste ende, denne forståelse giver mulighed for mere målrettede lægemidler, der er bedst i stand til at løse de mest potente risikofaktorer, der præsenterer sig selv i hver fase af vanedannende adfærd.
Kokain er et stærkt forstærkende psykostimulerende. Efter gentagen eksponering, forekomme flere molekylære og cellulære tilpasninger i belønning-relevant hjernen kredsløb, der menes at resultere i kompulsiv narkotika-søger adfærd, hvilket fik høje tilbagefald, der udgør et alvorligt klinisk problem 1.. Kokain udøver disse langvarige adfærdsmæssige effekter ved regulering af genekspression. At studere de tilpasninger, der opstår fra kronisk brug af kokain, har prækliniske gnavermodeller været brugt i udstrakt. En sådan model er den betingede sted præference (CPP) paradigme. Denne model indebærer udvikling af en lært forening mellem en tidligere neutralt miljø og givende egenskaber kokain. Efter flere fodboldmesterskaber af kokain med en bestemt kammer er dyr lov til frit at udforske kokain-parret og har non-kokain-parret miljøer, og hvis de foretrækker narkotika parrede rum, er de siges at have erhvervet en kokain-induceret place præference. Desuden efter en udslettelse træningsperiode, kan dette paradigme bruges til at studere kontekst-specifikke genindsættelse af kokain-søger adfærd.
Sammenlignet med andre adfærdsmæssige modeller af vanedannende-lignende adfærd, såsom psykomotorisk sensibilisering, som bruges til at studere langsigtet kokain-induceret adfærdsmæssige og molekylær plasticitet 2,3 og selvadministration (SA), der menes at mere præcist efterligne vanedannende -lignende adfærd hos mennesker, er CPP paradigme en enkel procedure til at studere kokain kontekstuelle læring 4.. CPP protokoller kan bekvemt udvides til at omfatte udryddelse og genindsættelse faser ligeledes til SA, som giver mulighed for undersøgelse af de underliggende mekanismer narkotika trang og tilbagefald 5-7 og som menes at rekapitulere aspekter af, hvad der sker i humant lægemiddel-søgende adfærd og narkotika – og cue-induceret tilbagefald 8-10.
En mekanisme, der ligger til grund forkokain-induceret adfærdsmæssige plasticitet, der er karakteristisk for hver af de forskellige faser af CPP, herunder erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse, er aktivering af unikke signaturer genekspression inden for forskellige områder af hjernen. Til direkte teste, hvilke gener inden belønning-relevante områder af hjernen medierer kokain-induceret adfærdsmæssige ændringer, er det nyttigt at være i stand til at manipulere dem selektivt i et regionalt-specifik måde. En måde at opnå dette på er at microinject rekombinante adenoassociated viral (rAAV)-vektorer, der udtrykker Cre-rekombinase med stereotaktisk kirurgi, i særskilte områder i hjernen af mus, der har målgener flankeret af loxP sites (floxet mus). Denne metode giver mulighed for meget præcis tidsmæssig og regional kontrol over, hvornår og hvor generne er poleres, i både delende og ikke-delende neuroner, uden at inducere immunresponser 11-13. Dette niveau af kontrol er en vigtig fordel i forhold til traditionelle Cre-LoxP teknologi af ynglende floxet mus wed mus, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af et endogent gen promotor, idet timingen og fordelingen af gendeletion kan mere stramt reguleret. Derudover viral vektor-medieret gen knockout omgår potentielle udviklingsmæssige kompenserende virkninger, der kan opstå ved brug af traditionelle knockout strategier.
Foruden kokain CPP, som er beskrevet her, mikroinjektion af rAAV-Cre ind i hjernen på mus floxet at vurdere betydningen af specifikke gener kan anvendes ubikvitært til adfærdsmæssige paradigmer, der involverer separate faser, herunder selvadministration og psykomotorisk sensibilisering. For eksempel har vores laboratorium udnyttet rAAV-Cre teknologi at undersøge den rolle, Ca V 1.2 L-type Ca2 +-kanaler i kokain psykomotorisk sensibilisering 14. Specifikt blev rAAV-Cre mikroinjiceres i nucleus accumbens (NAC) i mus med genet, som koder Ca v 1.2 floxet at påvise, at Ca v </sub> 1.2 handler i denne region medierer ekspressionen fase af psykomotorisk sensibilisering 14,15. Dog kan rAAV-Cre strategi ikke anvendes, hvis mus med en floxet gen af interesse ikke eksisterer, som var vores erfaring, når vurderingen rolle Ca V 1.3 L-type Ca2 +-kanaler i psykomotorisk sensibilisering. Dermed en begrænsning af anvendelse rAAV-Cre præsenterer sig selv hvis betingede mus, ikke eksisterer for et bestemt gen af interesse. Men rAAVs der udtrykker siRNA kan bruges til at Knockdown target gener, som vi har gjort for at undersøge, hvilken rolle Ca V 1.3 kanaler 14,15.
Mikroinjektion rAAV-Cre i adskilte områder af hjernen i floxet mus og derefter teste dem i CPP paradigme tillader undersøgelse af de specifikke gener, der medierer de forskellige faser af vanedannende-lignende adfærd, og hvor de handler. Brug af dette paradigme har hjulpet i vores forståelse af, hvordan gentagen kokain administration i det væsentlige hijacks brains belønning kredsløb forårsager utilpasset forandringer i molekylær signaltransduktionsveje og genekspression, der fører til den afhængige tilstand 1,16,17.
Regionalt og tidsligt-specifikt gen ablation via stereotaxic mikroinjektion af virale vektorer kombineret med CPP, der omfatter udryddelse og genindsættelse faser muliggør undersøgelse af de specifikke bidrag fra gener til tre forskellige faser af vanedannende-lignende opførsel. Mens betingede knockout, der er opnået udnytte den traditionelle Cre-LoxP system giver for spatio-tidsmæssigt begrænset gen ablation, stereotaksisk mikroinjektion Cre-recombinase i adskilte dele af hjernen hos floxet mus giver mulighed fo…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Anni Lee og Maureen Byrne for deres hjælp med at etablere den udvidede konditionerede sted præference protokol.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |