Summary
Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.
Abstract
Microinjecting virais (rAAV) vetores recombinantes adenoassociados expressando Cre recombinase em regiões do cérebro do rato distintas seletivamente genes knockout de interesse permite maior controle temporal e regionalmente específica de deleção do gene, em comparação com os métodos existentes. Enquanto a deleção condicional também pode ser conseguida por acoplamento ratinhos que expressa recombinase Cre sob o controle de promotores de genes específicos com ratinhos que transportam um gene floxed, microinjecção estereotáxico permite a determinação das áreas discretas do cérebro em pontos de interesse tempo experimentador-determinados. No contexto de preferência lugar cocaína condicionado, e outros paradigmas comportamentais da cocaína tais como a auto-administração ou sensibilização psicomotora, que pode envolver a retirada de restabelecimento fases, extinção e / ou, esta técnica é particularmente útil para explorar a contribuição única de genes-alvo para estes distintos fases de modelos comportamentais de plasticidade induzida pela cocaína. Especificamente,esta técnica permite a ablação seletiva de genes-alvo durante as fases distintas de um comportamento para testar a sua contribuição para o comportamento ao longo do tempo. Em última instância, esse entendimento permite terapêuticas mais específicas, que são mais capazes de lidar com os fatores de risco mais potentes que se apresentam durante cada fase do comportamento viciante.
Introduction
A cocaína é um psicoestimulante altamente reforço. Após a exposição repetida, várias adaptações celulares e moleculares ocorrem em circuitos cerebrais de recompensa relevante que são acreditados para resultar em compulsivo de drogas comportamento de busca, fazendo com altas taxas de recaída que representam um sério problema clínico 1. A cocaína exerce esses efeitos comportamentais de longa duração por regulação da expressão gênica. Para estudar as adaptações que surgem do uso crônico da cocaína, os modelos pré-clínicos de roedores têm sido amplamente utilizados. Um tal modelo é a preferência paradigma local condicionado (CPP). Este modelo envolve o desenvolvimento de uma associação entre um ambiente aprendido anteriormente neutro e as propriedades gratificantes de cocaína. Depois de vários pares de cocaína com uma câmara particular, os animais estão autorizados a explorar livremente os ambientes cocaína pareado e não-pareado cocaína e se eles preferem o compartimento de droga pareado, eles dizem ter adquirido uma plac induzida pela cocaínae de preferência. Além disso, na sequência de um período de treino de extinção, este paradigma podem ser usadas para estudar a reintegração específica do contexto do comportamento de procura de cocaína.
Em comparação com outros modelos comportamentais de comportamento aditivo semelhante, tais como a sensibilização psicomotora, que é usada para estudar a longo prazo induzida por cocaína comportamental e plasticidade molecular 2,3 e auto-administração (SA), que é pensado para mimetizar mais precisamente viciante -como o comportamento encontrado em seres humanos, o paradigma CPP é um procedimento simples para estudar cocaína aprendizagem contextual 4. Protocolos CPP pode ser convenientemente estendido para incluir as fases reintegração extinção e, à semelhança do SA, que permitem a investigação dos mecanismos subjacentes a ânsia da droga e recaída 5-7 e que são acreditados para recapitular aspectos do que ocorre em humanos droga comportamento de busca e drogas - e cue-induced recaída 8-10.
Um mecanismo que está na base dainduzida por cocaína plasticidade comportamental, que é característica de cada uma das fases distintas do CPP, incluindo a aquisição, extinção, e reposição, é a activação de assinaturas únicas de expressão do gene em diferentes regiões do cérebro. Para testar quais genes directamente dentro das regiões do cérebro relevantes para mediar a recompensa cocaína induziu alterações comportamentais, é útil ser capaz de manipular selectivamente de forma regional específica. Uma maneira de conseguir isso é microinject vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que expressam Cre recombinase usando cirurgia estereotáxica, em áreas distintas do cérebro de ratos que têm genes alvo ladeado por sites LoxP (ratos floxed). Este método permite um controlo temporal e regionais muito preciso sobre quando e onde os genes são ablação, em ambos os neurónios que dividem e que não se dividem, sem induzir respostas imunes 11-13. Este nível de controle representa uma vantagem importante sobre a tecnologia tradicional Cre-LoxP de reprodução camundongos floxed with ratinhos que expressam a recombinase Cre sob o controle de um promotor de gene endógeno, em que a temporização e distribuição de deleção do gene pode ser mais fortemente regulado. Além disso, o vetor viral mediada por nocaute gene evita potenciais efeitos de compensação de desenvolvimento que podem ocorrer usando estratégias knockout tradicionais.
Em adição à cocaína CPP, que é aqui descrito, a microinjecção de rAAV-Cre no cérebro de ratinhos floxed para avaliar o papel de genes específicos pode ser aplicado para ubiquamente paradigmas comportamentais que envolvem fases distintas, incluindo a auto-administração e sensibilização psicomotora. Por exemplo, o nosso laboratório tem utilizado a tecnologia de rAAV-Cre para estudar o papel do Ca V 1.2 canais de Ca 2 + do tipo-L de cocaína psicomotora sensibilização 14. Especificamente, rAAV-Cre foi microinjectado no núcleo accumbens (NAC) de ratinhos com o gene que codifica a Ca v 1.2 floxed, para demonstrar que o Ca v 14,15 expressão. No entanto, a estratégia de rAAV-Cre não pode ser utilizado se os ratos com um gene de interesse floxed não existem, como foi a nossa experiência quando se avalia o papel de Ca V 1.3 canais de Ca 2 + do tipo-L de sensibilização psicomotora. Assim, uma limitação da utilização de rAAV-Cre apresenta-se se os ratos condicionados não existem para um determinado gene de interesse. No entanto, rAAVs que expressam siRNA podem ser usadas para genes alvo knockdown, como fizemos para examinar o papel do CA V 1.3 canais 14,15.
Microinjecting rAAV-Cre em regiões cerebrais distintas de camundongos floxed e, em seguida, testá-las no paradigma do CPP permite a investigação sobre os genes específicos que medeiam as várias fases do comportamento viciante-como e onde eles estão atuando. O uso deste paradigma tem ajudado na nossa compreensão de como a administração repetida de cocaína em essência seqüestra o brains circuito de recompensa causando alterações inadequadas em vias de transdução de sinal molecular e expressão de genes que levam ao estado viciado 1,16,17.
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Protocol
Todos os procedimentos são realizados em conformidade com o Weill Cornell Medical College Animal Care Institucional e Comitê de Regras de Uso.
1. Preparação e configuração para entrega estereotáxica de vetores virais
- Se um instrumento, cotonete estéril, ou a mão usando luva estéril é contaminado ao entrar em contato com uma superfície não-estéril, descarte ou re-esterilizar o instrumento utilizando um esterilizador talão quente, descartar o cotonete ou mudar para novas luvas estéreis.
- Coloque a gaiola do rato com roupa de cama em um bloco de calor para aquecer para a recuperação pós-operatória.
- Configure barbeador elétrico para barbear cabeça e etanol e iodo para esterilizar o couro cabeludo.
- Limpe as barras de ouvido e mantenha a boca do stereotax com etanol 70%.
- Usando a 5 mL seringa Hamilton, elaborar 5 mL de vetor viral (1 x 10 6 partículas virais / l) e criado em suporte de seringa em stereotax.
- Almofada de aquecimento por microondas ou virar bloco elétrico em umº lugar em stereotax. Cubra com uma almofada absorvente limpa para reduzir o risco de queimaduras. Monitor de temperatura corporal do rato (entre 97-99,5 ° F) com freqüência durante todo o procedimento.
- Injectar rato (pesando entre 22-35 g) com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Uma vez que um rato é anestesiado, ponta da cauda pitada de verificar os reflexos do rato e observe qualquer movimento ou resposta para garantir que o mouse está devidamente anestesiados.
- Raspar a cabeça entre as orelhas e os olhos.
- Limpe a cabeça raspada com a alternância de etanol e iodo aplicadores de algodão estéreis.
- Transferir mouse para pad aquecida em stereotax.
2. Microinjeção estereotáxica de vetores virais
- Usar luvas estéreis durante toda a cirurgia. Se as luvas estão contaminadas em qualquer ponto ao tocar superfícies não-estéreis, mude as luvas.
- Zero bar dente e escala de barras de ouvido.
- Definir os dentes na barra do dente.
- Aperte focinho. Se mexer ou bigode movimentomento é de notar, a qualquer momento, administrar uma dose de reforço IP (~ 0,05 cc) de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg).
- Parafuso em bares de ouvido.
- Lubrifique os olhos com PuraLube.
- Corte couro cabeludo aberto apenas atrás das orelhas com um bisturi.
- Coloque grampos bulldog nos cantos do couro cabeludo para descascar a pele longe do crânio. Bregma e lambda deve ser facilmente visível.
- Certifique-se de sutura de bregma ao lambda está alinhada reta. Se a sutura é o posicionamento reajuste torto da cabeça.
- Verifique se todas as configurações no stereotax são zerados.
- Coloque a ponta da agulha no lugar em bregma.
- Meça todas as coordenadas para tanto bregma e lambda. Isso inclui coordenadas dorsal / ventral, lateral / medial e anterior / posterior.
- Ajustar a cabeça até que as coordenadas ventrais para bregma e lambda estão dentro de 0,02 milímetros um do outro.
- Uma vez alinhada, a partir bregma ir medialmente para as coordenadas medial / lateral (M / L). Certificar-seos lados esquerdo e direito estão alinhados dentro de 0,02 milímetros um do outro.
- Re-center ponta da agulha no bregma e de lá se mover na direção anterior / posterior (A / P) para atingir a cota anterior / posterior desejado.
- Se necessário, agulha ângulo em uma direção e verifique se o stereotax está bloqueado. Vá para a esquerda M / L de coordenadas (+ / - 1,52)
- Medir a posição ventral do topo do crânio para usar como uma referência, após o furo é perfurado.
- Faça um furo com uma broca estéril na coordenada desejada. Verificar que a agulha pode entrar ininterrupta através do crânio.
- Abaixe a agulha para a coordenada ventral desejado.
- Uma vez que a cota é alcançada, dip 0,015 milímetros abaixo de ~ 10 segundos para criar uma pequena bolsa para o vector viral.
- Injectar o volume desejado de vector virai, a uma taxa de ~ 0,1 mL / min. Espere 3 min para o vetor viral para difundir completamente. Levante a agulha ponta de 0,015 milímetros e esperar um adicional de 2 min.
- Mergulhar o agulha (se fazendo injecções angulares) no sentido oposto. De novo, o registo da posição ventral como uma referência para o topo do crânio.
- Repita os mesmos passos como no primeiro lado para injetar vetor viral no lado oposto (se fazendo injeções bilaterais).
- Aplique cera de osso para ambos os buracos para selá-los usando o final de madeira de uma ponta do aplicador de algodão estéril.
- Sutura no couro cabeludo.
- Aplicar o bloqueio do nervo para a área ferida.
- Retire do mouse de stereotax e coloque em gaiola aquecida em bloco de calor para se recuperar por 45 min.
- Monitorar os sinais de dor, incluindo: diminuição da atividade global ou agitação, diminuição do consumo de alimentos e água ou aumento da vocalização. A buprenorfina (0,05-0,2 mg / kg), pode ser administrada duas vezes por dia durante uma semana, se necessário para a dor. As alternativas aceitáveis incluem: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg).
3. Condicionado Lugar de Preferência: Acquisition, extinção e Reintegração
- Camundongos lugar para a câmara central de um lugar aparelho preferência de três câmaras (Med Associates Inc., St. Albans, VT, EUA) para um período de habituação 60 seg com portas guilhotina fechada.
- Depois de habituação, portas guilhotina abertas e permitir que os ratos livre exploração de todas as três câmaras para 1,200 seg, com o tempo gasto em cada câmara a ser gravado usando o software MedPC IV (Med Associates, Inc.).
- Atribuir ratos para câmaras de condicionamento com base em seu desempenho durante o pré-teste. Usando um desenho, a administração da droga par inclinado durante os três dias seguintes, com o compartimento que era menos preferido durante o pré-teste de linha de base.
- Durante os próximos 3 dias condicionado, injetar camundongos com a cocaína (10 mg / kg, ip) durante a sessão da manhã e confiná-los em sua câmara atribuído para 1200 sec imediatamente após a injeção. Voltar ratos para suas gaiolas para casa depois da sessão. Depois de quatro horas, injetar camundongos com solução salina (0,01 ml / gde peso corporal) e confinam à câmara oposta para a sessão de 1,200 seg tarde.
- Para testar a aquisição, ratinhos lugar na câmara central com portas de guilhotina fechado por um período de habituação de 60 seg. Portas de guilhotina abertas e permitem a livre exploração para 1200 sec, com o tempo gasto em todas as câmaras gravadas por software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcular preferência subtraindo a quantidade de tempo gasto na câmara de solução salina-emparelhado a partir da quantidade de tempo gasto na câmara de cocaína-emparelhado.
- Para extinguir a preferência de lugar, expor os ratos a duas sessões de 20 min de exploração livre diários no mesmo aparelho, separados por pelo menos 2 horas, começando 24 horas após o teste para a aquisição. O tempo gasto em todas as câmaras devem voltar a ser gravado e a magnitude do CPP inicial deve ser comparado com aquele de cada sessão de extinção.
- Determinar se os ratos têm extinta a preferência induzida por drogas, avaliando se a preferência por um parcâmara cular em dois dias consecutivos de extinção é significativamente menor em comparação com a pontuação preferência de aquisição.
- Restabelecer ratinhos com uma dose preparatória de cocaína (5 ou 10 mg / kg, ip) e re-exposição ao aparelho permitindo a exploração livre e registar o tempo gasto em cada compartimento.
- Administrar solução eutanásia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfundir ratos com paraformaldeído 4% (PFA) e efectuar um exame histológico para validar a colocação microinjeção correta.
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Representative Results
CPP
Depois de realizar CPP em ratos microinjetados, deve-se verificar que o grupo de controle de injecção (rAAV-GFP) camundongos normalmente adquirido preferência para a câmara de drogas pareado (Figura 1A, 1B). Ratos são considerados como tendo adquirido preferência por uma câmara especial quando preferência cocaína (tempo gasto na câmara de cocaína-emparelhado menos tempo gasto na câmara de solução salina-emparelhado), é significativamente superior em comparação com pontuação preferência basal (Figura 1B, A vs B) . Se, como um grupo, os ratos controle de injecção não mostram uma preferência para a câmara de cocaína pareado, ou mostrar uma aversão, a colocação deve ser verificada imediatamente por meio de histologia (ver rAAV Injeções subseção) e camundongos com colocação incorreta deve ser descartada.
Se a preferência tem sido normalmente adquirida pelo grupo de controlo de injecção, pode-se, posteriormente, estender o paradigma de início de extinção (Figura 1A (Figura 1B, E3, E4, E5 vs A). Neste momento, pode-se restabelecer com um primo da droga (Figura 1A, 1B). Se a contagem de preferência após a administração do fármaco principal é estatisticamente indistinguível na aquisição, em seguida, que coorte é dito ter restabelecido a preferência induzida por drogas para a câmara de fármaco-emparelhados (Figura 1B, R vs A).
rAAV microinjeções
Antes de exercer a estratégia experimental de rAAV-Cre em qualquer paradigma comportamental deve verificar que o rAAV-Cre foi efectivamente eliminado o gene de interesse em ratinhos microinjectados por qPCR (figura 1C) e / ou Western blot ou imuno-histoquímica 18 </ Sup>. Por exemplo, após microinjecção de rAAV-Cre-GFP para o NAc de ratinhos que tinham o tipo L do canal de cálcio Ca isoforma v 1.2 floxed, rAAV-Cre socos injectadas mostram uma diminuição significativa da expressão do gene (Figura 1C). Além disso, temos mostrado pela análise imuno-histoquímica que rAAV-Cre pode nocaute Ca v proteína 1.2 no cérebro do rato 18. Após todas as análises de comportamento, os murganhos devem ser transcardially perfundidos com paraformaldeído a 4% e imuno fluorescente deve ser realizado para a proteína verde fluorescente (GFP). Se foram alvo estruturas bilaterais, a colocação bilateral adequada deve ser verificada por meio fluorescente coloração imuno-histoquímica (Figura 1D, representante direcionamento do NAC). Se a área correta de fato tem sido alvo, a coloração deve ser visualizado exclusivamente na região pretendida e não fora dele. Se uma ou ambas as injecções são fora do alvo, os ratos deve ser retroactivaly excluído do conjunto de dados do DPC. Outra estratégia para a visualização de dados precisos segmentação das regiões do cérebro infectados por vectores virais e subsequente dissecção da área infectada por análises bioquímicas, pode ser conseguida utilizando uma lanterna GFP iluminante tal como descrito em Li e Wolf (2011) 19.
Figura 1A. Experimental cronograma de rAAV-Cre e microinjecção lugar de preferência de aquisição, extinção e reintegração fases condicionado. RAAV-Cre é microinjectado para a região de interesse de 2-3 semanas antes do início dos testes comportamentais. Preferência lugar condicionado começa com um pré-teste para determinar quaisquer desvios iniciais, seguido de 3 dias de condicionamento com a cocaína (10 mg / kg, ip). Quatro horas após cada sessão cocaína condicionado, ratossão tratadas com solução salina e confinados à câmara oposta. Os ratinhos dias seguintes são testados para a aquisição de um CPP. Extinção formação começa 24 horas mais tarde e envolve duas sessões diárias, que são separadas por pelo menos 2 horas, que permitem o acesso livre a todo o aparelho. Uma vez que os ratos tenham atingido o critério de extinção, eles são administrados uma injecção de escorvamento de cocaína (10 mg / kg, ip) e o tempo gasto em todas as câmaras do aparelho para testar é avaliada de restabelecimento da cocaína comportamento de busca. Figura 1B. Os resultados representativos da linha de base, aquisição, formação extinção e reintegração. WT camundongos C57BL/6J foram tratados com cocaína durante os dias 2, 3 e 4 de condicionamento. Ratos expostos aquisição, extinção e reintegração induzida pela cocaína (10 mg / kg ip cocaína prime). *** P <0,001 vs linha de base (B), # p <0,05 vs aquisição (A). Linha de base, B; Aquisição, A; Extinction, E; Reintegração, R. Figura 1C. Stereotaxentrega ic de rAAV-Cre-GFP para o CAN de Ca V 1.2 camundongos floxed diminuiu significativamente Ca v 1.2 mRNA. homozigotos Ca V 1.2 floxed ratos receberam microinjeções de controle (rAAV-GFP) ou experimental (rAAV-Cre-GFP) vetores virais . Após activação máxima Cre, os ratinhos foram sacrificados e os ARNm foi isolado e os níveis de expressão relativos foram examinados através de reacção em cadeia da polimerase quantitativa utilizando Ca V 1.2 iniciadores específicos. Entrega estereotáxica de rAAV-Cre-GFP para o CAN de Ca V 1.2 camundongos floxed diminuiu significativamente Ca V 1.2 níveis de mRNA, em comparação com camundongos injetados com AAV-GFP. † † p <0,001 vs rAAV-GFP. Figura 1D. Neurônios microinjeção com rAAV-GFP no rato NAc. Homozigotos Ca V 1.2 floxed ratos receberam microinjeções rAAV-GFP para verificar a colocação bilateral adequada no NAc. Os ratos foram perfundidos com PFA a 4% e imuno-histoquímica foi realizada. GFP coloração demonstraçãotes segmentação bilateral adequada do NAc. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Regionalmente e ablação gene específico temporalmente via microinjeção estereotáxica de vetores virais combinados com CPP, que inclui as fases de reintegração extinção e permite uma investigação das contribuições específicas de genes de três fases distintas de comportamento viciante-like. Enquanto knockout condicional que é alcançado utilizando o sistema Cre-LoxP tradicional prevê espaço-temporalmente ablação gene restrito, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase em áreas cerebrais distintas de camundongos floxed permite um controle ainda mais apertado de quando e onde um gene é nocauteado. Além disso, este contorna a possibilidade de mudanças compensatórias que ocorrem durante o desenvolvimento, que às vezes responde por variação fenotípica limitado observado em camundongos knockout. Além disso, utilizando-se grupos de ratinhos que foram microinjectados em vários pontos temporais durante o comportamento pode permitir ligações causais a serem feitas entre uma mudança na expressão de genes e uma mudança no comportamento. Importantly, esta técnica pode ser aplicada a diversos paradigmas comportamentais cocaína diferentes, incluindo a auto-administração e sensibilização psicomotora.
É importante que esperar, pelo menos, 10-14 dias após a cirurgia para assegurar que a activação máxima de recombinase Cre ocorreu 20. Começando teste comportamental antes de este pode resultar na utilização de ratinhos com uma quantidade desconhecida de expressão de Cre sub-máxima, fazendo descobertas comportamentais difíceis de interpretar. Activação máxima de Cre resulta em nocaute completa de um gene, no entanto, isto só ocorre em células que estão na realidade infectado. Dependendo do volume e o título do vector viral, aproximadamente 50-70% das células estão infectadas durante uma dada região, resultando na quantidade correspondente do RNAm e knockout proteína que pode levar a alguma expressão residual de genes (Figura 1C). No entanto, nós demonstramos que um ARNm de 50-60% neste tipo de nocaute é suficiente para alterar a expressãode sensibilização psicomotora 14. Além disso, este método é ideal para os paradigmas comportamentais como mais uma vez a activação de Cre ocorre in vivo, a sua expressão e o gene knockout correspondente duração de pelo menos 6 meses, 21.
Se um estiver interessado em examinar o papel de um gene ao longo de um período de tempo mais discreta no entanto, que não é possível com este método particular. Para a expressão de curto prazo, vectores virais de herpes simplex (HSV) podem ser usadas, que preferencialmente infectar neurônios 22. Comparado a expressão rAAV de Cre recombinase, que persiste por longos períodos como o promotor não é silenciado depois de dias ou semanas in vivo 23, vetores HSV são os preferidos para expressão transitória como eles expressam in vivo por dias. Vectores HSV também são vantajosos na medida em que demonstram ampla eficácia de transdução e que os estoques de vírus helper-free existem 22. Além disso, os vetores HSV também pode expressar Cre recombinase e medeiam a excisão de sequências floxed tanto em cultura como in vivo 24. No entanto, a citotoxicidade ocasional foi encontrado.
Quase toda a região dentro do cérebro podem ser direcionados utilizando esta técnica de microinjeção. Ao tentar alvejar sub-regiões menores dentro de uma região maior, um ser necessário optimizar a quantidade de vetor viral usado. Por exemplo, nós microinjeção de 0,5 mL de rAAV-Cre-GFP para atingir o CAN e área tegmental ventral (VTA) 14, enquanto que quando a segmentação de estruturas maiores, como o hipocampo eo córtex, Ahmed e colegas 20 utilizado 0,8 mL de rAAV-Cre. Alternativamente, explorando várias opções sorotipo que cada um tem propagação diferencial e propriedades de infectividade (ver Choi et al. (2005) 25, para revisão) pode ajudar no direcionamento, uma área mais definida menor. Por outro lado, se tentar atingir uma região maior, pode-se aumentar o volume da microinjectados vetor viral. Esta is mais eficazes do que utilizando maiores títulos de vectores como eles provavelmente produzir infecções adicionais por célula, em oposição a um maior número de células totais infectadas 22. Além disso, pode-se realizar múltiplas injeções dentro de uma região, ou em várias regiões, para infectar mais eficazmente uma área maior 26.
A utilização de vectores de rAAV também é vantajoso quando comparado com outros vectores virais que são usados para examinar a função cerebral e doença. Especificamente, os vectores adenovirais tradicionais revelado problemática na medida em que induziu respostas inflamatórias graves, enquanto outros vectores, tais como os retrovírus e os lentivírus pode envolver problemas com mutagénese insercional. rAAV é um parvovírus benigna e não há nenhuma doença conhecida associada com infecção de rAAV. Além disso, ao contrário de outros vectores virais, com transdução de rAAV ocorre sem a expressão das proteínas virais de AAV nativas 27, fazendo com que os efeitos secundários nas células alvo, muito menos de uma preocupação.Vector de rAAV podem ser produzidos em títulos elevados, e pode converter os neurónios pós-mitóticos em cérebro de uma forma altamente localizada espacialmente 21,28. Além disso, os vetores rAAV já estão sendo produzidos, que pode direcionar subtipos específicos de neurônios no cérebro de camundongos 29 e sistemas de expressão rAAV Cre-dependentes são também cada vez mais utilizado (ver Zhang et al. (2010) 30, para revisão).
Em resumo, a cocaína CPP serve como um instrumento comportamental simples, mas informativo para estudar aprendizagem cocaína contextual relevante para a aquisição, extinção e reintegração de comportamento de busca de cocaína. Uma combinação da utilização de rAAV que expressa Cre recombinase em ratinhos portadores de um alelo floxed com CPP proporciona uma estratégia eficaz para explorar o papel dos genes alvo, em regiões específicas do cérebro, que medeiam a cocaína comportamento de procura.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Anni Lee e Maureen Byrne por sua ajuda no estabelecimento do protocolo de preferência local condicionado estendida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
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