Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

סיכום

מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.

תקציר

Microinjecting רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים המבטאים Cre recombinase לאזורים במוח עכבר ברורים לסלקטיבי גני נוקאאוט של עניין מאפשר שליטה באופן זמני ואזורי ספציפית משופרת של מחיקת גן, בהשוואה לשיטות קיימות. אמנם גם יכולה להיות מושגת על ידי מחיקה מותנית הזדווגות עכברים שמבטאים Cre recombinase תחת שליטת יזמים גנים ספציפיים עם עכברים שנשאו גן floxed, microinjection stereotaxic מאפשר מיקוד של אזורי מוח בדידים בנקודות זמן שנקבעו הנסיין של עניין. בהקשר של העדפת קוקאין מותנית מקום, ופרדיגמות התנהגות אחרות כגון קוקאין מנהל עצמי או רגישות פסיכומוטורי שיכול להיות כרוך בנסיגה, הכחדה ו / או שלבי כינון, טכניקה זו שימושית במיוחד בחקר תרומתו הייחודית של גני המטרה ברורים לאלה שלבים של מודלים התנהגותיים של פלסטיות-Induced קוקאין. באופן ספציפי,טכניקה זו מאפשרת לאבלציה סלקטיבית של גני המטרה במהלך שלבים של התנהגות כדי לבחון את תרומתם להתנהגות על פני זמן בדידים. סופו של דבר, הבנה זו מאפשרת לתרופות ממוקדות יותר כי הם מסוגלים הטובים ביותר לטפל בגורמי הסיכון החזקים ביותר שמציגים את עצמם במהלך כל שלב של התנהגות ממכרת.

מבוא

קוקאין הוא psychostimulant מאוד מחזק. בעקבות חשיפה חוזרת ונשנית, כמה עיבודים מולקולריים ותאיים מתרחשים בפרס רלוונטי-מעגלי מוח שהם האמינו לגרום כפייתיים סמים התנהגות חיפוש, מה שגרם שיעור גבוה של הישנות אשר מהווה בעיה רצינית ¹ קלינית. קוקאין מפעיל השפעות התנהגותיות ארוכת טווח אלה על ידי ויסות ביטוי גנים. כדי ללמוד את ההתאמות הנובעות משימוש בקוק כרוני, היו בשימוש נרחב במודלים של מכרסמים פרה. מודל אחד כזה הוא העדפת פרדיגמה המקום מותנה (CPP). מודל זה כולל את הפיתוח של עמותה למדה בין סביבה ניטראלית בעבר ואת המאפיינים המתגמלים של קוקאין. לאחר כמה זיווגים של קוקאין בחדר מסוים, בעלי חיים מותר לחקור בחופשיות את סביבת קוק לזווג....

פרוטוקול

כל ההליכים מתבצעים בהתאם לטיפול Weill Cornell Medical College בבעלי החיים המוסדי וכללי ועדת שימוש.

1. הכנה והתקנה עבור משלוח Stereotaxic של וקטורים ויראליים

1. אם מכשיר, ספוגית סטרילית, או יד לובשת כפפה סטרילית מזוהם באים במגע עם משטח שאינו סטריליים, לבטל או לעקר מחדש את המכשיר באמצעות מעקר חרוז חם, לבטל או לשנות את ספוגית לכפפות סטריליות חדשות.
2. הצב כלוב עכבר עם מצעים על גוש חום כדי לחמם להחלמה שלאחר ניתוח.

תוצאות

CPP

לאחר ביצוע CPP על עכברי microinjected, צריך לוודא שהקבוצה של שליטה המוזרקת (rAAV-GFP) העכברים בדרך כלל רכשה העדפה הקאמרית סמים לזווג (איור 1 א, 1 ב). עכברים נחשבים לרכשו העדפה לחדר מסוים, כאשר העדפת קוקאין (משך זמן בחדר קוק לזווג מינוס הזמן שבילה בתא מלוחים לזווג) היא גבוהה באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפה בסיסית (איור 1 ב, לעומת ב ') . אם, כפי שעוקבה, עכברים מוזרקים שליטה .......

דיון

אזורי ואבלציה גן temporally הספציפית באמצעות microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים בשילוב עם CPP הכולל הכחדה ושלבי כינון מאפשרת חקירה של התרומות הספציפיות של גנים לשלושה שלבים ברורים של התנהגות דמוית ממכרת. בעוד נוקאאוט המותנה שמושג תוך ניצול מערכת Cre-LoxP המסורתי מספק למרחב באופן זמני, אבלציה הגן מוגבל, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase לאזורים במוח של עכברים בדידים floxed מאפשר שליטה חזקה עוד יותר של מתי והיכן גן בנוקאאוט. בנוסף, זה עוקף את האפשרות של שינו.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי פעילות העדפת מקום מותנים	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, ארה"ב	MED-CPP-MS
מערכת יישור סטריאוטקסית לעכבר	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, ארה"ב	דגם 900
מזרקי המילטון	חברת המילטון, רינו, נבאדה, ארה"ב	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	וקטור BioLabs, פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב	7016
rAAV2-GFP	וקטור BioLabs, פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב	7004