Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

Published: July 30, 2013 doi: 10.3791/50600
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Graduate Program in Neuroscience, Weill Cornell Graduate School of Biomedical Sciences, 2Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Weill Cornell Medical College

Summary

מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.

Abstract

Microinjecting רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים המבטאים Cre recombinase לאזורים במוח עכבר ברורים לסלקטיבי גני נוקאאוט של עניין מאפשר שליטה באופן זמני ואזורי ספציפית משופרת של מחיקת גן, בהשוואה לשיטות קיימות. אמנם גם יכולה להיות מושגת על ידי מחיקה מותנית הזדווגות עכברים שמבטאים Cre recombinase תחת שליטת יזמים גנים ספציפיים עם עכברים שנשאו גן floxed, microinjection stereotaxic מאפשר מיקוד של אזורי מוח בדידים בנקודות זמן שנקבעו הנסיין של עניין. בהקשר של העדפת קוקאין מותנית מקום, ופרדיגמות התנהגות אחרות כגון קוקאין מנהל עצמי או רגישות פסיכומוטורי שיכול להיות כרוך בנסיגה, הכחדה ו / או שלבי כינון, טכניקה זו שימושית במיוחד בחקר תרומתו הייחודית של גני המטרה ברורים לאלה שלבים של מודלים התנהגותיים של פלסטיות-Induced קוקאין. באופן ספציפי,טכניקה זו מאפשרת לאבלציה סלקטיבית של גני המטרה במהלך שלבים של התנהגות כדי לבחון את תרומתם להתנהגות על פני זמן בדידים. סופו של דבר, הבנה זו מאפשרת לתרופות ממוקדות יותר כי הם מסוגלים הטובים ביותר לטפל בגורמי הסיכון החזקים ביותר שמציגים את עצמם במהלך כל שלב של התנהגות ממכרת.

Introduction

קוקאין הוא psychostimulant מאוד מחזק. בעקבות חשיפה חוזרת ונשנית, כמה עיבודים מולקולריים ותאיים מתרחשים בפרס רלוונטי-מעגלי מוח שהם האמינו לגרום כפייתיים סמים התנהגות חיפוש, מה שגרם שיעור גבוה של הישנות אשר מהווה בעיה רצינית 1 קלינית. קוקאין מפעיל השפעות התנהגותיות ארוכת טווח אלה על ידי ויסות ביטוי גנים. כדי ללמוד את ההתאמות הנובעות משימוש בקוק כרוני, היו בשימוש נרחב במודלים של מכרסמים פרה. מודל אחד כזה הוא העדפת פרדיגמה המקום מותנה (CPP). מודל זה כולל את הפיתוח של עמותה למדה בין סביבה ניטראלית בעבר ואת המאפיינים המתגמלים של קוקאין. לאחר כמה זיווגים של קוקאין בחדר מסוים, בעלי חיים מותר לחקור בחופשיות את סביבת קוק לזווג ולא קוק לזווג ואם הם מעדיפים את תא סמים לזווג, הם אמרו שרכשו plac קוקאין-Inducedהעדפת דואר. יתר על כן, לאחר תקופת הכשרת הכחדה, יכולה לשמש פרדיגמה זו כדי ללמוד כינון הקשר ספציפי של שוחרת קוקאין התנהגות.

בהשוואה לדגמים אחרים של התנהגות כמו התנהגות ממכרת, כגון רגישות פסיכומוטורי, המשמש למחקר ארוך טווח התנהגות מושרה קוקאין ופלסטיות מולקולרית 2,3 וממשל עצמי (SA), כי הוא חשב בצורה מדויקת יותר לחקות ממכר כמו התנהגות שנמצאה בבני אדם, את הפרדיגמה CPP היא הליך פשוט ללמוד קוקאין למידה קונטקסטואלית 4. פרוטוקולי CPP יכולים להתארך בנוחות ולכלול את הכחדת שלבי שבה, בדומה לSA, המאפשר חקירה של המנגנונים שבבסיס תשוקת סמים והישנות 5-7 ואשר האמינו לשחזר היבטים של מה שמתרחש באדם תרופה שוחרת התנהגות וסמים - וקיו-Induced הישנות 8-10.

מנגנון אחד שעומד בבסיסקוקאין-induced פלסטיות התנהגותית שאופיינית לכל אחד מהשלבים שונים של CPP, כולל רכישה, הכחדה, ושבה, היא הפעלה של חתימות ייחודיות של ביטוי גנים באזורים שונים במוח. כדי לבחון ישירות אילו גנים בתוך אזורים במוח גמול רלוונטיים לתווך-Induced קוקאין שינויים התנהגותיים, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לתפעל אותם באופן סלקטיבי באופן אזורי ספציפי. אחת דרכים להשגת מטרה זו היא microinject רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים שהמפורש Cre recombinase באמצעות ניתוח stereotaxic, לאזורים במוח שונים של עכברים שיש להם גני המטרה מוקפים אתרי loxP (עכברי floxed). שיטה זו מאפשרת שליטה זמנית ואזורית מאוד מדויקת על מתי והיכן גנים ablated, בשני נוירונים מתחלקים ולא החלוקה, ללא גרימת תגובה חיסונית 11-13. רמה זו של שליטה מייצגת יתרון חשוב על פני טכנולוגיית Cre-LoxP המסורתי של רבייה עכברי floxed wעכברי ith מבטאים Cre recombinase תחת השליטה של ​​אמרגן גן אנדוגני, שבעיתוי וההפצה של מחיקת גן יכולים להיות מוסדרות יותר בחוזקה. בנוסף, נוקאאוט גן וקטור ויראלי עוקף בתיווך השפעות התפתחותיות פיצוי פוטנציאלי שעלולים להתרחש באמצעות אסטרטגיות נוקאאוט מסורתיות.

בנוסף לקוקאין CPP, שתואר כאן, microinjection של rAAV-Cre לתוך המוח של עכברי floxed כדי להעריך את התפקיד של גנים ספציפיים יכול להיות מיושם בכל מקום בגוף לפרדיגמות התנהגות הכרוכים בשלבים נפרדים, ובכלל זה ניהול עצמי ורגישות פסיכומוטורי. לדוגמה, במעבדה שלנו ניצל את טכנולוגית rAAV-Cre כדי ללמוד את התפקיד של CA v 1.2 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי קוקאין 14. באופן ספציפי, rAAV-Cre היה microinjected לתוך גרעין האקומבנס (NAC) של עכברים עם גן קידוד Ca V 1.2 floxed, על מנת להוכיח כי Ca V 14,15. עם זאת, לא ניתן להשתמש באסטרטגיה rAAV-Cre אם עכברים עם גן floxed של עניין לא קיימים, כפי שהיה הניסיון שלנו בעת הערכת התפקיד של CA v 1.3 ליטר מסוג Ca 2 + ערוצים ברגישות פסיכומוטורי. לפיכך, מגבלה של שימוש rAAV-Cre מציגה את עצמו אם עכברים מותנים אינם קיימים לגן מסוים של עניין. עם זאת, rAAVs שsiRNA המפורש ניתן להשתמש בם למציאת גני המטרה, כפי שעשינו כדי לבחון את התפקיד של CA v 1.3 הערוצים 14,15.

Microinjecting rAAV-Cre לאזורים נפרדים במוח של עכברי floxed ולאחר מכן בודק אותם בפרדיגמה CPP מאפשר לחקירה את הגנים הספציפיים המתווכים את השלבים השונים של התנהגות דמוית הממכר ושבו הם פועלים. השימוש בפרדיגמה זו סייעה בהבנתנו כיצד ממשל קוקאין החוזר ונשנה במהות חוטפת brמעגלי גמול ains גורמים לשינויים הסתגלותי במסלולי העברת אותות מולקולריים וביטוי גנים שיובילו למדינה המכורה 1,16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים מתבצעים בהתאם לטיפול Weill Cornell Medical College בבעלי החיים המוסדי וכללי ועדת שימוש.

1. הכנה והתקנה עבור משלוח Stereotaxic של וקטורים ויראליים

  1. אם מכשיר, ספוגית סטרילית, או יד לובשת כפפה סטרילית מזוהם באים במגע עם משטח שאינו סטריליים, לבטל או לעקר מחדש את המכשיר באמצעות מעקר חרוז חם, לבטל או לשנות את ספוגית לכפפות סטריליות חדשות.
  2. הצב כלוב עכבר עם מצעים על גוש חום כדי לחמם להחלמה שלאחר ניתוח.
  3. הגדר את מכונת גילוח חשמלית לגילוח הראש ואתנול ויוד לחיטוי הקרקפת.
  4. נגב את סורגי אוזן ולהחזיק את הפה של stereotax עם 70% אתנול.
  5. באמצעות מזרק המילטון 5 μl, לצייר עד 5 μl של וקטור ויראלי (1 x 10 6 / μl חלקיקים נגיפיים) ולהקים בבעל מזרק בstereotax.
  6. כרית חימום במיקרוגל או להפוך כרית חשמלית עלמקום שני בstereotax. לכסות עם כרית סופגת נקיות כדי להפחית את הסיכון לכוויות. צג טמפרטורת גוף עכבר (שבין 97-99.5 מעלות פרנהייט) בתדירות גבוהה לאורך כל הליך.
  7. הזרק עכבר (במשקל של בין 22-35 g) בתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) וxylazine (20 מ"ג / ק"ג). ברגע שעכבר הוא מורדם, קצה זנב קמצוץ כדי לבדוק את הרפלקסים של העכבר ושים לב כל תנועה או תגובה על מנת להבטיח שהעכבר הוא מורדם כראוי.
  8. לגלח את הראש בין אוזניים ועיניים.
  9. יש לנקות את הראש מגולח עם לסירוגין applicators כותנה סטריליים אתנול ויוד.
  10. העבר את העכבר למשטח מחומם בstereotax.

2. Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים

  1. ללבוש כפפות סטריליות במהלך הניתוח. אם כפפות מזוהמות בכל נקודה על ידי נגיעה משטחים שאינם סטריליים, לשנות את הכפפות.
  2. בר שן אפס קשקשים ואוזן בר.
  3. הגדר שיניים בבר שן.
  4. בורג בפרצופו. אם נענוע או מהלך זיףment יצוין, בכל עת, לנהל חיסון דחף IP (~ 0.05 סמ"ק) מתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) וxylazine (20 מ"ג / ק"ג).
  5. בורג בברים אוזניים.
  6. לשמן את העיניים עם PuraLube.
  7. חותכים את הקרקפת פתוחה לממש מאחורי אוזניים עם אזמל.
  8. קליפים בולדוג מקום בפינות של הקרקפת כדי לקלף את העור מהגולגולת. גבחת ומבדה צריכה להיות גלויה לעין.
  9. הפוך תפר בטוח מגבחת למבדה מיושרת ישר. אם התפר הוא מיצוב להסתגל עקום של הראש.
  10. בדקו כדי לוודא שכל ההגדרות בstereotax הם התביית.
  11. שים מחט קצה במקום בגבחת.
  12. למדוד את כל הקואורדינטות עבור שניהם גבחת ולמבדה. זה כולל קואורדינטות גב / הגחון, המדיאלי / לרוחב וקדמית / אחורית.
  13. התאם את הראש עד שקואורדינטות הגחון לגבחת ומבדה נמצאות ב0.02 מ"מ של כל אחד אחר.
  14. ברגע שמיושר, מגבחת הולכים מדיאלית החוצה לקואורדינטות המדיאלי / רוחב (מ '/ ל'). לוודאהצדדים ימני והשמאליים מיושרים בתוך 0.02 מ"מ של כל אחד אחר.
  15. קצה מחט מחדש מרכז בגבחת ומשם לנוע בכיוון הקדמי / אחורי (/ P) כדי לתאם הקדמי / אחורי הרצויים.
  16. אם מחט צורך, זווית בכיוון אחד ולוודא stereotax נעול. לצאת לM / L לתאם השמאלי (+ / - 1.52)
  17. מדוד את עמדת הגחון של החלק העליון של הגולגולת להשתמש כהפניה לאחר הקידוח הוא קדח.
  18. לקדוח קידוח באמצעות מקדח סטרילי בקואורדינטות הרצויה. בדקו שהמחט יכולה להיכנס ללא הפרעה דרך הגולגולת.
  19. מנמיכים את המחט לקואורדינטות הגחון הרצויה.
  20. ברגע שהוא הגיע לתאם, לטבול 0.015 מ"מ מתחת ל~ 10 שניות כדי ליצור כיס קטן לוקטור ויראלי.
  21. הזרק את הנפח הרצוי של וקטור ויראלי בשיעור של 0.1 ~ μl / דקה. לחכות 3 דקות לוקטור ויראלי לנטרל לחלוטין. הרם את קצה מחט מ"מ 0.015 ולחכות 2 דקות נוספות.
  22. טובלים את המחט (אם עושה זריקות זווית) בכיוון ההפוך. שוב, להקליט את מיקום הגחון כהתייחסות לחלק העליון של הגולגולת.
  23. חזור על אותם השלבים כמו בצד הראשון להזריק וקטור ויראלי בצד השני (אם עושה זריקות דו צדדיות).
  24. החל שעוות עצם לשני החורים כדי לאטום אותם באמצעות סוף העץ של קצה מוליך כותנה סטרילי.
  25. תפר את הקרקפת.
  26. החל בלוק עצבי לאזור הפגוע.
  27. הסר את העכבר מstereotax ומקום בכלוב בחום לחסום חימם להתאושש במשך 45 דקות.
  28. לעקוב אחר סימנים של כאב, כולל: ירידה בפעילות כללית או חוסר מנוחה, ירידה בצריכת מזון ומים או ניקוד מוגבר. יכולות להינתן פעמיים ביום במשך שבוע במידת צורך לכאב - עצירות (0.2 מ"ג / ק"ג 0.05). חלופות מקובלות כוללות: meperidine (20-60 מ"ג / ק"ג), סחרחורת (10 מ"ג / ק"ג), nalbuphine (4-8 מ"ג / ק"ג).

3. העדפות מקום אוויר: Acquisition, הכחדה, והחזרה

  1. עכברי מקום לחדר המרכזי של מנגנון העדפת מקום השלוש קאמרי (מד Associates Inc, סנט אלבנס, ורמונט, ארה"ב) לתקופה של 60 שניות הרגלה עם דלתות סגורות הגיליוטינה.
  2. לאחר התרגלות, דלתות הגיליוטינה פתוחות ולאפשר חיפושי עכברים ללא כל 3 התאים ל1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל תא שהוקלט באמצעות התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc).
  3. הקצאת עכברים לתאי מיזוג המבוססים על הביצועים שלהם במהלך המבחן מראש. באמצעות עיצוב, תרופות צמד מוטות במהלך 3 ימים שלאחר מכן עם התא שהיה הכי פחות מועדף במבחן מראש תחילת המחקר.
  4. בימי מיזוג 3 הבאים, להזריק עכברים עם קוקאין (10 מ"ג / ק"ג; IP) במהלך ישיבת הבוקר ולהגביל אותם בחדר שהוקצה להם ל1,200 שניות מייד לאחר ההזרקה. להחזיר עכברים לכלובים בביתם לאחר הפגישה. לאחר 4 שעות, להזריק עכברים עם מי מלח (0.01 מ"ל / גרםמשקל גוף) ולהגביל אותם לתא ההפוך למושב 1,200 שניות אחר הצהריים.
  5. כדי לבדוק לרכישה, עכברי מקום בתא המרכזי עם דלתות הגיליוטינה נסגרו לתקופה התרגלות שנייה 60. הגיליוטינה דלתות פתוחות ולאפשר חקירה ללא תשלום עבור 1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל התאים שתועדו על ידי התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc). חישוב העדפה על ידי הפחתת כמות הזמן שבילתה בתא מלוחים לזווג מכמות הזמן שבילתה בתא קוק לזווג.
  6. כדי לכבות את העדפת המקום, תחשוף עכברים לשני מפגשי 20 דקות של חיפושים חופשיים יומי באותו המנגנון, מופרדים על ידי לפחות 2 שעות, 24 שעות לאחר תחילת המבחן לרכישה. שוב המשך זמן בכל התאים צריך להיות מוקלט וסדר הגודל של CPP הראשוני צריך להיות בהשוואה לזה של כל מושב הכחדה.
  7. לקבוע אם עכברים כיבו את העדפת תוצאת משימוש בסמים על ידי בחינת האם העדפת נקובקאמרי ticular על פני יומיים רצופים הכחדה הוא נמוך באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפת הרכישה.
  8. להחזיר עכברים עם מנה תחול בקוקאין (5 או 10 מ"ג / ק"ג; IP) ולחשוף מחדש למנגנון המאפשר חקירה החופשית ולהקליט את משך זמן בכל תא.
  9. לנהל פתרון המתת חסד Euthasol (150 מ"ג / ק"ג). Transcardially perfuse עכברים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ולבצע בדיקה היסטולוגית כדי לאמת את מיקום microinjection נכון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CPP

לאחר ביצוע CPP על עכברי microinjected, צריך לוודא שהקבוצה של שליטה המוזרקת (rAAV-GFP) העכברים בדרך כלל רכשה העדפה הקאמרית סמים לזווג (איור 1 א, 1 ב). עכברים נחשבים לרכשו העדפה לחדר מסוים, כאשר העדפת קוקאין (משך זמן בחדר קוק לזווג מינוס הזמן שבילה בתא מלוחים לזווג) היא גבוהה באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפה בסיסית (איור 1 ב, לעומת ב ') . אם, כפי שעוקבה, עכברים מוזרקים שליטה לא מראים העדפה לתא קוק לזווג, או להראות סלידה, מיקום צריך להיות מאומת באופן מיידי באמצעות היסטולוגיה (ראה סעיף קטן rAAV זריקות) ועכברים עם מיקום שגוי אמורים להיות מושלך.

אם העדפה כבר נרכש בדרך כלל על ידי קבוצת ביקורת-המוזרקת, אחד לאחר מכן ניתן להאריך את הפרדיגמה על ידי הכחדת תחילת (איור 1 א (איור 1 ב, E3, E4, E5 לעומת). בשלב זה, אפשר להחזיר עם ראש תרופה (איור 1 א, 1 ב). אם הציון בעקבות העדפתו של ראש ממשל התרופה הוא שאין להבחין מבחינה סטטיסטית, כי במועד הרכישה, ולאחר מכן כל דור שהוא אמר לי מחדש את העדפת תוצאת משימוש בסמים לתא סמים לזווג (איור 1 ב, ר נ).

rAAV microinjections

לפני רודף האסטרטגיה הניסיונית rAAV-Cre בתוך כל פרדיגמה התנהגותי אחד צריך לוודא שrAAV-Cre יש למעשה דפק את הגן של עניין בעכברי microinjected ידי qPCR ו / או כתם מערבי או ניתוח immunohistochemical 18 (איור 1 ג) </ Sup>. כך למשל, בעקבות microinjection של rAAV-Cre-GFP לתוך NAC של עכברים שהיו L-סוג סידן ערוץ איזופורם Ca V 1.2 floxed, אגרופים הזריקו rAAV-Cre מראים ירידה משמעותית בביטוי גנים (איור 1 ג). בנוסף, יש לנו שמוצג על ידי ניתוח immunohistochemical שrAAV-Cre יכול נוקאאוט חלבון 1.2 V CA במוח העכבר 18. בעקבות כל הניתוחים התנהגותיים, עכברים צריכים להיות perfused transcardially עם paraformaldehyde 4% ואימונוהיסטוכימיה ניאון צריכה להתבצע לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). אם מבנים הבילטרליים היו ממוקדים, מיקום נכון בין שתי המדינות צריך להיות מאומת על ידי ניאון מכתים immunohistochemical (איור 1D, נציג מיקוד של NAC). אם האזור הנכון אכן כבר ממוקד, מכתים צריך להיות דמיינו באופן בלעדי באזור המיועד ולא מחוצה לו. אם אחד או שתי הזריקות הם מחוץ ליעד, עכברים צריכים להיות רטרואקטיבייםly נכלל בערכת נתונים CPP. אסטרטגיה נוספת להדמיה של מיקוד מדויק של אזורים במוח וקטור נגוע בנגיף ולאחר מכן נתיחה של האזור הנגוע לניתוחים ביוכימיים, יכולה להיות מושגת באמצעות פנס-GFP מאיר, כמתואר ובלי וולף (2011) 19.

איור 1
איור 1 א. ציר זמן ניסיוני של microinjection rAAV-Cre ושלבי רכישה, הכחדה והחזרה ממוזגות מקום בכורה. rAAV-Cre הוא microinjected לאזור של עניין 2-3 שבועות לפני תחילתו של בדיקות התנהגותיות. העדפת מקום אוויר מתחילה עם טרום בדיקה כדי לברר את כל הטיות ראשוניות, ואחרי 3 ימים של מיזוג עם קוקאין (10 מ"ג / ק"ג, IP). ארבע שעות לאחר כל הפעלת מיזוג קוקאין, עכבריםמטופלים עם מלח ומרותק לחדר השני. עכברי היום הבאים, נבחנו צורך ברכישה של CPP. אימון הכחדה מתחיל 24 שעות מאוחר יותר, וכרוך ב2 פגישות יומיות, כי הם מופרדים על ידי לפחות 2 שעות, המאפשרות גישה החופשית לכל המכשיר. ברגע שעכברים הגיעו לקריטריון ההכחדה, הם מנוהלים הזרקה תחול של קוקאין (10 מ"ג / ק"ג, IP) ובילה את זמנם בכל התאים של המנגנון נבחנת לבדיקת החזרת 1B קוקאין שוחר התנהגות. איור. נציג תוצאות של מחקר, טופלו רכישה, אימון הכחדה, וכינון. עכברי C57BL/6J WT עם קוקאין במהלך ימים 2, 3 ו -4 של מיזוג. עכברים הציגו רכישה, הכחדה והחזרה-Induced קוקאין (10 קוקאין IP מ"ג / ק"ג ראש). *** P <0.001 לעומת תחילת המחקר (ב); # p <0.05 לעומת רכישה (). Baseline B, A; רכישה,; הכחדה, E; שבה, ר 'איור 1 ג. Stereotaxמשלוח של IC-rAAV Cre-GFP לתוך NAC של 1.2 עכברי floxed Ca v ירד משמעותי mRNA Ca V 1.2. 1.2 עכברי הומוזיגוטים Ca v floxed היו microinjected עם שליטה (rAAV-GFP) או ניסויי (rAAV-Cre-GFP) וקטורים ויראליים . בעקבות הפעלת Cre מקסימלי, עכברים הוקרבו וmRNA היה מבודד ורמות ביטוי יחסיות נבדקו באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז כמותית באמצעות 1.2 פריימרים ספציפיים Ca v. משלוח Stereotaxic של rAAV-Cre-GFP לתוך NAC של 1.2 עכברי floxed Ca v 1.2 ירד באופן משמעותי את רמות ה-mRNA v CA, בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם AAV-GFP. † † p <0.001 לעומת rAAV-GFP. 1D איור. נוירונים microinjected עם rAAV-GFP בNAC העכבר. 1.2 עכברי הומוזיגוטים Ca v floxed היו microinjected עם rAAV-GFP כדי לבדוק עבור מיקום בין שתי המדינות תקינים בNAC. עכברים היו perfused עם PFA 4% ואימונוהיסטוכימיה בוצעו. GFP מכתים demonstrates מיקוד דו צדדי תקין של NAC. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אזורי ואבלציה גן temporally הספציפית באמצעות microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים בשילוב עם CPP הכולל הכחדה ושלבי כינון מאפשרת חקירה של התרומות הספציפיות של גנים לשלושה שלבים ברורים של התנהגות דמוית ממכרת. בעוד נוקאאוט המותנה שמושג תוך ניצול מערכת Cre-LoxP המסורתי מספק למרחב באופן זמני, אבלציה הגן מוגבל, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase לאזורים במוח של עכברים בדידים floxed מאפשר שליטה חזקה עוד יותר של מתי והיכן גן בנוקאאוט. בנוסף, זה עוקף את האפשרות של שינויים מפצים מתרחשים במהלך התפתחות, לפעמים המהווה וריאציה פנוטיפי מוגבלת שנצפתה בעכברים בנוקאאוט. יתר על כן, שימוש בקבוצות של עכברים שmicroinjected בנקודות זמן שונים במהלך ההתנהגות יכולה לאפשר לקשרים סיבתיים שיש להבחין בין שינוי בביטוי גנים ושינוי בהתנהגות. Importantly, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כמה פרדיגמות התנהגות קוקאין שונות, כולל ניהול עצמי ורגישות פסיכומוטורי.

חשוב להמתין לפחות 10-14 ימים לאחר ניתוחים כדי להבטיח שההפעלה מקסימלי של Cre recombinase התרחשה 20. מתחיל בדיקות התנהגותיות לפני זה יכול לגרום לשימוש בעכברים עם כמות לא ידועה של ביטוי תת מקסימאלי Cre, מה שהופך את הממצאים התנהגותיים קשים לפרש. הפעלה מקסימלי של תוצאות Cre בנוקאאוט של גן השלם, אך זה מתרחש רק בתאים שהם למעשה נגועים. בהתאם לכמות וכייל של וקטור ויראלי, כ 50-70% מתאים נגועים לאזור נתון וכתוצאה מכך הסכום המקביל של ה-mRNA ונוקאאוט חלבון אשר יכול להוביל לכמה ביטוי גני שיורי (איור 1 ג). עם זאת, יש לנו הראינו כי mRNA 50-60% סוג של נוקאאוט די בכך כדי לשנות את הביטוירגישות של 14 פסיכומוטורי. יתר על כן, בשיטה זו היא אידיאלית לפרדיגמות התנהגות עוד פעם אחת כהפעלת Cre מתרחשת in vivo, וביטויו בנוקאאוט הגן המקביל נמשכים לפחות 6 חודשים 21.

אם מישהו מעוניין בבוחן את תפקידו של גן על פני תקופה של זמן בדיד יותר עם זאת, כי לא ניתן בשיטה זו בפרט. לביטוי לטווח קצר, הרפס סימפלקס יכולים לשמש (HSV) וקטורים ויראליים, שמעדיף להדביק תאי עצב 22. בהשוואה לביטוי rAAV של Cre recombinase, הנמשך לתקופות ארוכות יותר כאמרגן לא השתיק לאחר ימים או שבועות in vivo 23, וקטורי HSV הם העדיפו לביטוי חולף כפי שהם מביעים את in vivo במשך ימים. וקטורי HSV הם גם יתרון בכך שהם מדגימים רחבה יעילות התמרה וכי עוזר מניות נקיות מוירוסים קיימים 22. יתר על כן, וקטורי HSV יכולים גם להביע Cre recombinase ולתווך הכריתה של רצפי floxed הן בתרבות ובחי 24. עם זאת, מדי פעם cytotoxicity כבר מצא.

כמעט בכל אזור במוח יכול להיות ממוקד באמצעות טכניקת microinjection זה. כאשר מנסים למקד אזורי משנה קטנים יותר בתוך אזור גדול יותר, ייתכן שאחד צריך לייעל את כמות וקטור ויראלי בשימוש. לדוגמה, אנו microinjected 0.5 μl של rAAV-Cre-GFP למקד NAC ואזור tegmental הגחון (VTA) 14, ואילו כאשר מיקוד מבנים גדולים יותר כגון ההיפוקמפוס וקליפת המוח, אחמד ועמיתיו השתמשו ב20 0.8 μl של rAAV-Cre. לחלופין, לבחון אפשרויות שונות שלכל סרוטיפ התפשט ההפרש ומאפייני infectivity (ראה צ'וי et al. (2005) 25 לבדיקה) יכול לסייע במיקוד שטח קטן יותר, מוגדר יותר. לעומת זאת, אם אנסה למקד לאזור גדול יותר, ניתן להגדיל את הנפח של וקטור ויראלי microinjected. זה אניים יעיל יותר מניצול titers וקטור גבוה יותר כפי שהם צפויים להניב זיהומים נוספים לכל תא בניגוד למספר גבוה יותר של תאים בסך הכל נדבקו 22. בנוסף, ניתן לבצע הזרקות מרובות באזור, או על פני מספר אזורים, כדי להדביק שטח גדול יותר 26 בצורה יעילה יותר.

שימוש בוקטורי rAAV הוא גם יתרון בהשוואה לוקטורים ויראליים אחרים המשמשים לבדיקת תפקוד מוח ומחלות. באופן ספציפי, וקטורי adenoviral מסורתיים התגלו כבעייתיים בכך שהם גרמו תגובות דלקתיות קשות, ואילו וקטורים אחרים כגון רטרווירוסים וlentiviruses יכולים לערב בעיות עם mutagenesis insertional. rAAV הוא parvovirus שפיר ואין שום מחלה ידועה קשורה לזיהום rAAV. יתר על כן, בניגוד לוקטורים נגיפיים אחרים, התמרה עם rAAV מתרחשת ללא ביטוי של חלבונים נגיפיים AAV ילידי 27, מה שהופך את השפעות משניות על תאי היעד הרבה פחות דאגה.ניתן לייצר וקטורי rAAV בtiters גבוהה ויכולים transduce נוירונים לאחר mitotic במוח באופן מקומי מאוד מרחבית 21,28. יתר על כן, וקטורי rAAV הם עתה נוצרו, שיכולים למקד תת ספציפיים של הנוירונים במוח העכבר 29 ומערכות ביטוי rAAV Cre תלויות גם הם הופכים יותר שימוש נרחב (ראה Zhang et al. (2010) 30 לבדיקה).

לסיכום, קוקאין CPP משמש ככלי התנהגותי פשוט אך אינפורמטיבי ללמוד קוקאין למידת ההקשרים רלוונטי לרכישה, הכחדה, ושבה של שוחרת קוקאין התנהגות. שילוב של ניצול rAAV מבטא Cre recombinase בעכברים שנשאו אלל floxed עם CPP מספק אסטרטגיה רב עוצמה על מנת לחקור את תפקידם של גני המטרה באזורים ספציפיים במוח שמבקש לתווך קוקאין התנהגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לאנני לי ומורין בירן על עזרתם בהקמת פרוטוקול העדפת המקום המותנה הממושך.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conditioned place preference activity chambers Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA model 900
Hamilton syringes Hamilton Company, Reno, Nevada, USA 7634-01
rAAV2-Cre-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7016
rAAV2-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
  2. Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
  3. Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
  4. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
  5. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
  6. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
  7. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
  8. Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
  9. O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
  10. Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
  11. Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
  12. Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
  13. Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
  14. Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
  15. Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
  16. Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
  17. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
  18. Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
  19. Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
  20. Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
  21. Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  22. Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
  23. Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
  24. Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
  25. Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
  26. Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
  27. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
  28. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
  29. Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
  30. Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).

Tags

התנהגות גיליון 77 מדעי המוח נוירוביולוגיה אנטומיה פיזיולוגיה ההנדסה ביו רפואית רפואה פרמקולוגיה בעלי חיים מהונדסת גנטי התנהגות בעלי חיים תרופות התנהגות חיפוש Psychophysiology התנהגות ומנגנוני התנהגות וקטורים ויראליים ניתוח stereotaxic microinjection התנו העדפת מקום עכבר התנהגות מדעי המוח הכחדה השבה-Induced קוקאין מודל חיה
Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A.… More

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference. J. Vis. Exp. (77), e50600, doi:10.3791/50600 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter