Summary
双摄像头发射分光系统，双色荧光显微镜生成具有出色的光学分辨率和时间分辨率，一定的活细胞检测的要求，包括平行板流动腔粘连检测的实时图像序列。当软件被用来从合并收购的同时发射通道的图像，伪彩色图像序列产生。
Abstract
多色免疫荧光显微镜来检测特定的分子在细胞膜上可以加上平行平板流动腔实验来调查管动态流动条件下的细胞粘附机制。例如，标有多种荧光团的癌细胞可灌注了一个潜在的反应底物来建模癌转移的机制。然而，多通道单相机系统和彩色摄像机表现出的缺点在图像采集的实时活细胞分析。为了克服这些局限性，我们采用了双摄像头发射分光系统同时捕获荧光标记细胞的实时图像序列中的流室。双摄像头发射分光系统过滤器中定义的波长范围分为两个黑白CCD摄像机，从而同时捕获两个空间相同，但荧光的特定图像。随后，psuedocolored 1通道的图像被组合成一个单一的实时合并序列，可以揭示多个目标分子对细胞运动迅速在一个地区的利益。
Introduction
方法分子在细胞表面上，如免疫染色分析，采用被化学偶联至荧光基团，从而允许检测目标分子的探针。活细胞成像和流体动力流动为基础的细胞黏附测定法通常记录的黑白CCD相机设计在细胞和/或分子水平1，2捕获的生理过程。这些摄像机是高度敏感的，提供快速的帧速率（大于每秒30帧），和（由于快速的帧速率和较短的曝光时间），提供出色的时间分辨率。然而，黑白相机只能捕捉到一个单一的发射通道（检测单个荧光基团）来采集图像。单个相机发射分光系统可并入到捕获多个发射信道，但往往减少视场并需要相同的曝光时间进行摄像的所有通道。要抓紧细胞标记MULTIP的全彩色光谱勒荧光团，一个彩色照相机可以作为一种替代方法。然而，彩色相机通常不能够提供期望在某些应用中的活细胞成像的时间分辨率。另一个成像装置所需的应用中，有利的是，图象的活细胞在多个波长，同时保持高的时间分辨率。一个主要的实验应用是在平行平板流动腔粘附试验，其中细胞被灌注在生理学相关条件下在一个潜在的反应基片1，3。在流动细胞表达特定细胞表面分子可能粘附和轧辊的基体如表达粘附分子或表面吸附的细胞外基质蛋白4，5的细胞单层上。轧制细胞可以在几分之一秒进行旋转和平移运动。上的滚动和粘附的细胞，如簇的细胞表面分子的分子功能，还具有电位人经过积极的重组在细胞表面上。因此，成像系统必须提供一个特殊的时间分辨率（每秒或更高30帧和“近零”的曝光时间），以生成示出的细胞轧制6,7的一步一步的进展的图像序列。双摄像头发射分光系统能满足这些要求的成像单元带有多种荧光团。
双摄像发射分光系统拆分和滤波器荧光通道分成两个相似的摄像机同时捕获两个空间上相同，但荧光团特定的图象，同时保留的全视场。该技术使实时在每个通道中捕获的图像进行直接比较，并允许用户快速照相机模型之间具有不同的成像能力切换。此功能可用于制作在一个摄像头，更好地让系统捕捉调整图像捕捉设置有用荧光基团具有不同强度，寿命和消光系数8。再加上成像软件，双摄像头发射分光系统允许在多个波长活细胞成像分析的实时记录，并可以提高在体外实验使用的荧光来研究细胞行为。
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Protocol
1。软件安装
- 购买StreamPix 5多摄像头软件SimulPix模块或能够收集并结合了黑白CCD相机拍摄的图像的其它图像软件。
- 对于StreamPix 5最低要求包括：搭载Core 2 Duo处理器，2.4 GHz或更好地与2 GB RAM或更高的PC。受支持的IEEE数字或模拟相机和兼容图像采集卡。窗户XP/7/Vista 32位或64位。监视器支持分辨率1024×768或更高。 （建议OCU表达16倍或更高）的图形适配器具有良好的2D性能和7,200 RPM的硬盘驱动器，用于记录与RAID-O配置。
2。安装双摄像头系统能够双色同步实时成像
- 通过滑动DC2 C型安装适配器插入MICR的视频端口连接DC2的配光发射分离器或类似的双摄像头发射分光装置，在显微镜OSCOPE，使得设备上的二向色性的外壳是可访问。
- 插入两个黑白CCD摄像机转化为雌C接口1和女C型2。相同的摄像机是优选的。类似的相机也可使用，但兼容性是依赖于硬件的内部，最重要的是CCD图像传感器。
- 使用图像处理软件来显示来自摄像机的图像。下面的步骤（2.3.1 - 2.3.4）适用于StreamPix 5与SimulPix模块，并且必须适用于其他的多摄像头成像软件。
- 打开StreamPix 5和任务色带选择“工作空间”。
- 打开“工作区管理器”位于最右边的屏幕并选择“新工作区”。
- 命名一个摄像头后，按照软件提示选择从预填充的列表中选择一个抓取。选择抓取匹配的相机型号和重复的第二个摄像头的工作区。对于合并后的工作空间，重复一次以上，但“所有的相机都在使用”错误米essage将出现。此消息是正常的。
- 一旦合并后的工作区被加载时，分配摄像机从工作区1和2的工作区，以在对接面板位于上观看屏幕的右侧合并的工作区。
- 在双摄像头发射分光系统对准摄像头。
- 在明视场或通过使用PlanApo 40X物镜（或更大）的制造商所提供的校准网格相衬对准摄像机。
- 发送光显微镜目镜，将被提供由制造商在显微镜舞台上的金属涂层校准网格，方形网格上的显微镜载物台。
- 使电网成为关注的焦点。
- 取代，但不删除，分色住房对准摄像头1（旁路相机）。显示网格不分级，不自动缩放。在使用C型底座端口1的对焦调节旋钮聚焦影像。
- 推分色住房进入双channe升获得充分，从而图像被分割为二向色到两个相机设备。
- 松开3 5/64“设定螺钉和转动在阴C型2第二相机直到网格的取向是相同的两个图像中，利用聚焦调整拨盘上的C型安装口2，从相机带来的图像2成为关注的焦点。
- 使用组合图像中的成像软件的合并工作区完成对齐。这允许人们看到的校准网格的两个图像的实时伪覆盖。只使用R / L旋钮右侧DC2的调整合成图像的位置。调整此旋钮，直至图像的左/右垂直边界的精确对准。
- 使用U / D转换旋钮调整第二个图像的上/下排列，直到水平网格条正确对齐。
- 如果在向上/向下对准轻微旋转摄像头松开三个5/64“英寸SCRE发生时，正确的这个问题WS相机2和旋转，直到显示的图像正确对齐。
3。对平行平板流动腔附着力测定制剂癌细胞
- 培养的BT-20乳腺癌细胞在最低必需培养基（MEM），补充以完成介质具有在37℃，10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素-链霉素和CO 2如前所述2 5.0％。
- 嘉实癌细胞用稀胰蛋白酶处理，并计算细胞血球。
- 洗涤和悬细胞于10 7个细胞/ 0.1％白蛋白的牛血清（BSA）的DPBS中的钙和镁（DPBS +）毫升。
- 稀释的第一抗体，纯化的小鼠抗人CD24和纯化的大鼠HECA-452（抗-sialofucosylated抗原），在0.1％BSA的DPBS +预先确定的最佳浓度。孵育细胞30分钟，9，10。
- 离心细胞在1,200 rpm下，得到的细胞沉淀。 ASPI评价第一抗体，并用0.1％BSA的消毒副产物+洗涤细胞两次。
- 稀释的二抗，山羊抗小鼠IgG AlexaFluor 568（发射最大值，603纳米）和山羊抗大鼠IgM AlexaFluor 488（发射最大值，519纳米），以预先确定的最佳浓度在0.1％BSA的DPBS +。孵育细胞30分钟。
- 以10 6细胞/ 0.1％BSA的DPBS +毫升洗涤细胞两次并悬浮在0.1％BSA的DPBS +。
4。对平行平板流动腔附着力测定制剂反应底物
- 连接两个独立的管道长度，以适合在35 mm组织培养皿内的平行平板流动腔室的入口和出口端口。一个管将连接到标记的细胞悬浮于0.1％BSA的DPBS +和其它的注射器泵，这将在指定的流量抽出流体的贮存器。
- 连接真空管线到流动室1。
- 定位流室在35mm组织培养二SH含中国仓鼠卵巢细胞单层表达E-选择素（CHO-E）。 CHO-E细胞在MEM完全培养基中，在37℃和5.0％CO 2的2。
- 调整流动室和/或流室垫圈，以确保良好的真空密封件1。
- 从水库抽取液体，监测流动室组件进行适当的密封与 空气形成气泡1没有视觉证据。
- 将流动室组件上的显微镜（Leica DMI 6000B）1。
5。双色图像采集
- 电力徕卡EL-6000紧凑型光源，或类似的装置，以产生高强度光夫妇到一个光导。使用倒置显微镜通过组合滤块， 即 G / R（绿色/红色）过滤器的立方体通过这个光，激发所需的颜色/亮度的荧光。
- 确保分色住房是在正确的操作姿势（郁闷）和是不是在旁路模式。
- 操作显微镜的荧光模式，并选择适当的荧光滤块（绿色/红色）。
- 确定曝光时间和增益摄像头1（红色; 620±60 nm）和摄像机2（绿; 535±40纳米）。
- 踩下分色同时在红色和绿色发射渠道获取的图像。使用带有标记的细胞只有红色荧光的流动室试验中，通过调整摄像机1的曝光时间在成像软件的“实时设置”获得图像中的红色通道。
- 相机2的曝光时间匹配到照相机1的曝光时间。如果图像中的绿色通道观察，渗出通过伪影的存在，需要在两个相机的曝光时间可以缩短。
- 保持曝光时间相当于在摄像机1和摄像机2，减少曝光时间，直到扩散到工件不再在绿色通道可见。调整摄像机1的增益，以提高图像visibilitY的红色通道，如果必要的。
- 重复步骤5.4.1 - 5.4.3与标记的细胞只有绿色荧光，但与照相机2限定的曝光时间，以图像单元中的绿色通道而不在由照相机1所收集的红色通道渗出通过工件。
- 返滴定抗体，如果放气通过伪影不能被消除11，或者如果摄像机1和摄像机2的曝光时间是显着不同，使得合并后的图像可以是在时间上对齐。
- 使用图像处理软件来查看从流室实验二黑白CCD摄像机同时拍摄的图像。
- 合并使用Streampix 5的SimulPix模块或另一种软件包，这两个摄像头采集到的图像。
- 使用SimulPix或替代软件数字校正调整，如有必要，在空间上对齐拼接的图像，。图像可以用SimulPix模块为水平，垂直纠正和旋转调整。
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Representative Results
平行板流动腔粘连实验检测证明，同时捕获实时图像序列的两个发射信道的双摄像头发射分光系统（ 图1）。双相机发射分光系统检测出BT-20细胞，进行了荧光标记的抗人CD24和HECA-452（检测sialofucosylated抗原）的单克隆抗体和合适的第二抗体（ 图2）。一些细胞滚动显示红色信号（CD24）还检测不到绿色信号（HECA-452），其他显示绿色信号和检测不到的红色信号，并且还在其它细胞显示红色和绿色信号（ 图2）。合并后的排放渠道透露的BT-20细胞上滚动，坚持CHO-E单分子膜（ 图3和图4）在表面上CD24和sialofucosylated分子的分布和共定位。双摄像头发射spli拟合系统最初由于摄像机的对准有轻微的图像对齐错误，但这个错误是与数字调整（ 图5）使用StreamPix 5的SimulPix模块纠正。总而言之，双摄像发射分光系统有必要以显示应用，例如流室附着力试验，其中细胞通过视场中快速移动的细胞和分子特征的空间，时间和光学分辨率。
图1。插图在一个平行板流动腔粘连实验获取图像的双摄像头发射分光系统。注射泵是用来灌注细胞在基板的平行板流动腔。连接到一个倒置落射荧光显微镜双摄像头发射分光系统采用了分色米irror和滤光块分割和筛选排放渠道进入两个摄像头。这些摄像机同时捕获两个空间相同，但荧光的特定图像序列。配备多相机成像软件的计算机被用来合并，并从每个发射通道记录图像序列。
图2。双摄像头发射分光系统被用于一个平行板流动腔粘连检测的实时同步成像BT-20细胞的标记（1）抗人CD24和抗鼠IgG AlexaFluor 568（伪彩色红，排放最大， 603纳米;照相机1，620±60纳米）和（2）HECA-452和抗大鼠IgM AlexaFluor 488（伪彩色绿色，发射最大519毫微米;相机2，535±40纳米）灌注过的CHO-E单层在壁面切应力= 1达因/厘米2。双摄像头我合并法师揭示异质轧制细胞群内，并且可以被用来表征基于细胞表面分子的表达滚动行为。比例尺= 100微米。图像与10倍的目标收购。
图3。通过展示BT-20细胞表达CD24（伪彩色红色）和sialofucosylated分子（伪彩色绿色）在CHO-E单层轧壁面切应力= 1达因/厘米2的双摄像头发射分光系统拍摄的图像合并后的时间序列。相机保持了光学分辨率和时间分辨率上的单元格翻滚“结束了结束”，因为它在推出流动方向的反应性基片上跟踪细胞的功能。白色箭头表示的细胞表面分子的跟踪集群。在每个通道发射信号进行伪彩色和合并在第imaging软件。需要注意的是共同定位信号出现黄色/橙色。静态影像从实时图像序列出口在所示时间点。比例尺=10μm以下。用40倍物镜获得的图像。
图4。双摄像头发射分光系统揭示CD24（伪彩色红）的共定位和sialofucosylated分子（伪彩色绿色）由代表BT-20乳腺癌细胞上滚动的CHO-E单层表示（A）CD24和（B）的sialofucosylated异质性表达在细胞表面上的分子被强调在每个图像。分子（C）共定位显示为黄色/橙色伪彩色斑点时，红色和绿色的伪彩色发射信道合并。泡孔直径约为10微米。图片收购无线TH一个40X的目标。
图5.Adjustments到的图像在摄像机1和摄像机2拍摄到的水平，垂直和旋转空间的设置可以提高空间对准在合并后的图像，适当的对准是关键的，以精确地描述如何细胞粘附和滚动的粘附实验。 （ 一 ）单BT-20细胞的融合图像由于相机定位的错位。 （二）空间定位与软件调整StreamPix 5的SimulPix模块中提高。 （三）进一步调整软件达到近乎完美对齐。比例尺= 2微米。用40倍物镜获得的图像。
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Discussion
双摄像头发射分光系统需要在应用中的细胞或分子的运动是快速捕捉高品质图像的空间，时间，以及光学分辨率。在产生代表性的结果，在双相机发射分光系统，包括软件的设置，相机设置的参数，进行优化以获得合并的图像序列，其中轧制和贴壁细胞，空间和时间上对齐。此优化步骤是关键的，因为未对准可导致图像不正确传达所研究的物理现象， 例如 ，观察到滚在两个绿色和红色通道的单个细胞可能显示为2轧细胞在合并后的工作区。空间定位应该达到的双摄像头发射分光系统的设置，当相机在协议步骤2.4描述的物理排列。数字更正的图像CAPT空间对齐索引由该相机可以通过在成像软件（步骤5.7和图5）数字对齐设置被应用为水平，垂直或旋转偏移量（S）。
曝光时间，偏移和增益：通过摄像机1和摄像机2拍摄的图像之间的时间对准可以通过调整摄像机的“实时设置”来实现。增益和偏移可以在不影响合并图像的时间对准进行调整，但偏差在用户定义的曝光时间摄像头之间可导致未对准。因而增益可以调整，以补偿用来收集在每个摄像机的图像的曝光时间之间的差异。理想情况下，在摄像机之间的曝光时间差异应只当增益调整出现显著影响图像质量允许的。可替代地，抗体滴定实验，可以执行以优化细胞标记，以补偿曝光时间的差异由每个摄像机需要（一）由于各荧光团或（b）由于各抗体/荧光检测分子的表达水平差异的固有特性。然而，还应当注意的是，抗体滴定实验是最佳实践，以防止扩散到工件（步骤5.4.5）11。
虽然双相机发射分束系统被用来同时图像中单独排放通道2的目标分子，替代技术是能够在多个发射信道同时拍摄图像。这些成像系统的范围从单一的彩色摄像机，以激光共聚焦显微镜，各有优势，相对于图像质量，速度劣势，以及成本12-17。特别是，国家的最先进的激光扫描共聚焦显微镜，纳入共振扫描仪能够以每秒几百帧的采集图像的令人印象深刻的多光谱成像系统。这些共聚焦系统是非常强大的，但其成本可能会限制研究者即有机会获得这些系统通过核心设施的数量。最终，每个实验室决定哪些多通道成像系统是最合适的调查需求和资源。
本文所述的方法解释了如何使用了双摄像头发射分光系统和图像处理软件实时获取的图像序列中两个排量的渠道。通过类似的黑白CCD相机拍摄的两个发射通道的图像的时空定位是生产，能同时显示多个目标分子对细胞的高品质的实时融合图像序列是必不可少的。应用双摄像头发射分光系统包括任何双色活细胞分析的要求来看一个满场的特殊光学分辨率和时间分辨率，如流测定，细胞表面分子的转运，细胞骨架重构，囊泡运输和3D粒子跟踪。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢道格拉斯博士戈茨（化学系和生物分子工程，俄亥俄大学）和费边Benencia博士（生物医学俄亥俄大学系）对有见地的讨论和审稿。我们也感谢克里斯托弗Huppenbauer博士的有益的技术讨论（W. Nuhsbaum公司）。这项工作是由美国国立卫生科学基金会（CBET-1106118）和国家研究院（1R15CA161830-01）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix | ||
References
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A.
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M.
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
