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Immunology and Infection

एक टेट्रासाइक्लिन विनियमित सेल लाइन विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं को लक्षित है कि उच्च टिटर lentiviral वैक्टर का उत्पादन

Published: June 19, 2013 doi: 10.3791/50606
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, Viterbi School of Engineering, University of Southern California, Los Angeles

Summary

यहाँ, हम रेट्रोवायरल पारगमन और टेट्रासाइक्लिन के अभाव में एक lentiviral वेक्टर (एल.वी.) के घटक व्यक्त कर सकते हैं कि एक सेल लाइन बनाने के लिए concatemeric अभिकर्मक का उपयोग करें. इस एल.वी. GFP encodes और वृक्ष के समान कोशिकाओं पर एक रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है जो एक ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu, साथ छद्म है.

Abstract

Lentiviral वैक्टर (LVS) कोशिकाओं के कई प्रकार के आनुवंशिक सामग्री पहुंचाने का एक शक्तिशाली साधन हैं. LVS की बड़ी मात्रा में उत्पादन, इन एचआईवी -1 व्युत्पन्न वैक्टर के साथ जुड़े सुरक्षा चिंताओं की वजह से चुनौती दे रहा है. इस पत्र में, हम स्वयं निष्क्रिय LVS के उच्च titers के उत्पादन के लिए एक विधि की रिपोर्ट. हम retrovirally एक वृक्ष के समान सेल विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu सहित सभी वायरल घटकों, व्यक्त कर सकते हैं जो एक सेल लाइन, जीपीआरएस, उत्पन्न करने के लिए टीईटी बंद स्थिर निर्माता सेल लाइन जीपीआर transduce. फिर, हम एल.वी. हस्तांतरण प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक चयन मार्कर के साथ संयोजन में एक पत्रकार जीन GFP transfect करने concatemeric डीएनए अभिकर्मक का उपयोग करें. परिणामस्वरूप क्लोन के कई हम क्षणिक अभिकर्मक के साथ क्या हासिल की तुलना में 10 गुना अधिक से अधिक एक टिटर पर एल.वी. उत्पादन कर सकते हैं. इसके अलावा, इन वायरस कुशलतापूर्वक इन विट्रो में वृक्ष के समान कोशिकाओं transduce और हमारे संवाददाता प्रतिजन के लिए एक मजबूत टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं. इस पद्धति का एक अच्छा विकल्प के लिए हो सकता हैआर कैंसर या संक्रामक रोगों के नैदानिक ​​अध्ययन के लिए मजबूत एल.वी. आधारित टीके के उत्पादन.

Introduction

कई वेक्टर सिस्टम जीन डिलीवरी के लिए विकसित किया गया है. Lentiviruses पर आधारित वैक्टर सबसे अधिक अध्ययन वायरल व्यवस्था के बीच किया गया है. वे कुशलता, 1 कोशिकाओं को विभाजित और गैर विभाजित दोनों transduce कारण मेजबान जीनोम में एकीकरण के लिए लंबी अवधि की अभिव्यक्ति को प्राप्त है, सबसे अधिक मानव आबादी 2 में कम प्राकृतिक विरोधी वेक्टर प्रतिरोधक क्षमता का प्रदर्शन, और के लिए एक कम क्षमता है सकते हैं क्योंकि ये वैक्टर फायदेमंद हैं insertional mutagenesis के 3,4 से genotoxicity.

Lentiviruses का उत्पादन हमेशा सुरक्षा चिंताओं से रंग दिया गया है. Lentiviral वैक्टर आम तौर पर एचआईवी -1, एड्स के हेतुकविज्ञानी से निकाली गई है. Lentivector के व्यक्तिगत घटकों (हस्तांतरण, लिफाफा, और पैकेजिंग प्लास्मिड) के क्षणिक अभिकर्मक प्रयोगशाला सेटिंग्स में आनुवंशिक सामग्री वितरित की एक आम और लचीला साधन है. हालांकि, नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए स्केलिंग अप क्षणिक transfections के बोझिल और मा हैवाई प्रतिकृति-सक्षम lentivirus 5,6 के विकास के लिए नेतृत्व. इन बाधाओं को पार करने के लिए, कई स्थिर पैकेजिंग और निर्माता सेल लाइनों 6-11 विकसित किया गया है. इन लाइनों में से एक, जीपीआर पैकेजिंग लाइन 11, टेट्रासाइक्लिन द्वारा नियंत्रित किया जा रहा है की आकर्षक लाभ है. इस पत्र में, हम विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी LVS) 12 की ओर लक्षित कर रहे हैं कि आत्म - निष्क्रिय lentiviral वैक्टर निर्माण करने के लिए इस प्रणाली को अनुकूलित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) प्रतिरक्षा प्रणाली की सबसे मजबूत प्रतिजन कोशिकाओं पेश कर रहे हैं. वे सीधे, कार्यक्रम आरंभ, और ट्यूमर विशेष प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 13 को विनियमित क्योंकि वे कैंसर के टीके के विकास में बहुत रुचि का विषय रहा है. डीसी पेप्टाइड या डीएनए टीके की तुलना में मजबूत अर्बुदरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने की क्षमता है शामिल करने के लिए एक टीकाकरण प्रोटोकॉल शामिल है. हाल ही में, हम एक lentiviral वेक्टर विकसित किया है कि specifically एक संशोधित Sindbis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu 14 के माध्यम से वृक्ष के समान कोशिकाओं लक्ष्य. वे वृक्ष के समान कोशिकाओं को उच्च विशिष्टता दिखाने के लिए और अविशिष्ट, VSVg-छद्म वैक्टर की तुलना में मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न उस में ये वैक्टर अद्वितीय हैं.

यहाँ, हम इन डीसी लक्षित lentiviral वैक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पादन के लिए एक विधि की रिपोर्ट. हम इन डीसी LVS डीसी को संक्रमित और मजबूत CD8 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है. जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं यूएससी Intitutional पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत, नम्रता से प्रदर्शन किया गया. विवो और नैदानिक ​​प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए आदेश में, यह एक उच्च टिटर पर वायरस का उत्पादन कर सकते हैं कि एक सेल लाइन बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. बिल्कुल के रूप में वर्णित पारगमन और अभिकर्मक चरणों का प्रदर्शन इस तरह के एक क्लोन पैदा करने की संभावना को अधिकतम जाएगा.

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Protocol

डीसी एल.वी. स्थिर उत्पादक कोशिकाओं आवश्यक lentiviral घटकों gagpol, राजस्व और टीईटी बंद प्रणाली जिसमें जीपीआर पैकेजिंग सेल लाइन 11 के आधार पर निर्माण कर रहे हैं. सबसे पहले, रेट्रोवायरल पारगमन एक टीईटी पर निर्भर SVGmu ग्लाइकोप्रोटीन encodes कि एक GPRS पैकेजिंग सेल लाइन उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर, concatemer सरणी अभिकर्मक ऐसी GFP के रूप में एक lentiviral वेक्टर transgene के साथ जीपीआरएस सेल लाइन transfect करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एल.वी.-MGFP के रूप में नामित यह स्थिर निर्माता सेल लाइन, GFP के खिलाफ डीसी एल.वी. वैक्सीन का उत्पादन करने की क्षमता के लिए इन विट्रो में और vivo में परीक्षण किया जा सकता है.

1. एक Tet पर निर्भर SVGmu सेल लाइन जनरेटिंग

प्लाज्मिड PRX-SVGmu डीसी विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन SVGmu बहाव रेट्रोवायरल प्लाज्मिड pRetroX-Tet बंद 1 (चित्रा 1C) के टीटी A-उन्नत प्रमोटर के क्लोन किया जाता है, जिसमें एक का निर्माण है. D10 में संस्कृति 293T कोशिकाओं (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम साथ10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine). डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) और puromycin (2 ग्राम / एमएल) के साथ D10 में संस्कृति जीपीआर पैकेजिंग सेल लाइन. सभी कोशिकाओं 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत हैं.

  1. 16-18 घंटा पहले क्षणिक अभिकर्मक, थाली 2 एक्स 10 कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में 90% confluency दृष्टिकोण है कि इस तरह के एक 6 सेमी टिशू कल्चर पकवान में D10 के 4 मिलीलीटर में 6 293T कोशिकाओं.
  2. रेट्रोवायरल plasmids के अभिकर्मक: मिश्रण 100 μl 1.25 एम 2 CaCl समाधान, बाँझ मिल्ली क्यू पानी और निम्नलिखित प्लास्मिड: 5 ग्राम PRX-SVGmu, 2.5 ग्राम pGag पोल, 2.5 ग्राम pVSV जी. अंतिम मात्रा 500 μl है. एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब करने के लिए, 500 μl 2X HBS (50 मिमी HEPES, 10 मिमी KCl, 12 मिमी Dextrose, 280 मिमी NaCl, 2 4 HPO * 7 2 हे, पीएच 7.05 ना 1.5 मिमी) जोड़ें. एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ सख्ती बफर बुदबुदाती जबकि 2X HBS बफर में प्लाज्मिड मिश्रण dropwise जोड़ें. मील जोड़ने के बादxture, एक और 30 सेकंड के लिए बुदबुदाती जारी है. फिर, 6 सेमी संस्कृति डिश में 293T कोशिकाओं पर पूरे मिश्रण जोड़ें, और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस
  3. 4 घंटा अभिकर्मक के बाद, ध्यान से 4 मिलीलीटर पूर्व गर्म D10 के साथ संस्कृति डिश में मध्यम जगह.
  4. संक्रमण स्पिन: अभिकर्मक के बाद 48 घंटा, फसल SVGmu एन्कोडिंग एक 0.45-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पारित करके तैरनेवाला में रेट्रोवायरल कणों. अच्छी तरह / 2 x 10 4 कोशिकाओं में एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्लेट जीपीआर पैकेजिंग कोशिकाओं. 1,050 XG पर 90 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए डिश में जीपीआर पैकेजिंग कोशिकाओं (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर्ड जोड़ें (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) स्पिन संक्रमण के बाद डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) के साथ ताजा D10 में मध्यम बदलें.
  5. पैकेजिंग कोशिकाओं डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) और puromycin (2 एनजी / एमएल) के साथ D10 में transduced के 72 घंटे बाद अभिकर्मक, संस्कृति का विस्तार.
  6. 48 घंटे के लिए डॉक्सीसाइक्लिन बिना SVGmu, संस्कृति कोशिकाओं की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए. सतह पूर्व उपायविरोधी Sindbis सीरम का उपयोग कर प्रवाह cytometry साथ SVGmu की अभिव्यक्ति. इन कोशिकाओं को जीपीआरएस पैकेजिंग सेल लाइन के रूप में नामित कर रहे हैं.

2. Concatemer ऐरे अभिकर्मक द्वारा डीसी एल.वी. उत्पादक कोशिकाओं का निर्माण

Lentiviral हस्तांतरण प्लाज्मिड TL20-GFP के एक स्वयं निष्क्रिय lentiviral हस्तांतरण वेक्टर प्लाज्मिड एक Dox-regulatable विषाणु आरएनए जीनोम अभिव्यक्ति प्रणाली और 7 टीईटी ऑपरेटरों (चित्रा 1C) 11 के साथ cytomegalovirus (सीएमवी) बढ़ाने के प्रतिस्थापन के साथ pCL20c-MSCV-GFP के आधार पर , 12,15. प्लाज्मिड PGK, ble एक कमजोर PGK प्रमोटर 2 द्वारा संचालित एक bleomycin प्रतिरोधी (ble) कैसेट है.

  1. 50 पर प्रतिबंध एंजाइम SfiI साथ डाइजेस्ट 20 ग्राम प्लाज्मिड TL20-GFP डिग्री सेल्सियस 37 में PflMI साथ डाइजेस्ट 20 ग्राम प्लाज्मिड PGK, ble डिग्री सेल्सियस
  2. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए टुकड़े (PGK, ble कैसेट 1011 बीपी और वेक्टर है TL20-GFP 6861 बीपी) है शुद्ध.
  3. TL20-GFP वेक्टर और PGK-ligate25:1 का एक दाढ़ अनुपात (चंचु टी -4 डीएनए ligase) में ble कैसेट. कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं.
  4. रातोंरात बंधाव के बाद, बंधाव मिश्रण (क्विएज़न DNeasy रक्त और ऊतक किट) से डीएनए शुद्ध. शुद्ध डीएनए की मात्रा सुनिश्चित 5 ग्राम के आसपास है.
  5. अभिकर्मक पहले 16-18 घंटा, confluency अभिकर्मक के समय के बारे में 90% हो जाएगा कि इस तरह के एक 6 सेमी टिशू कल्चर पकवान में थाली जीपीआरएस पैकेजिंग कोशिकाओं.
  6. 6 सेमी टिशू कल्चर पकवान में जीपीआरएस पैकेजिंग कोशिकाओं में शुद्ध concatemeric डीएनए के 5 ग्राम transfect को 1.2 चरण में वर्णित कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि का प्रयोग करें. 4 घंटा अभिकर्मक के बाद, ध्यान से मध्यम हटाने और डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) के साथ 4 मिलीलीटर पूर्व गर्म D10 के साथ बदलें.
  7. 48 घंटा अभिकर्मक के बाद, डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) और puromycin (2 ग्राम / एमएल) के साथ D10 में मध्यम बदल जाते हैं. संस्कृति के माध्यम में Zeocin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़कर ट्रांसफ़ेक्ट क्लोन के लिए चयन करें. सेल COLONI तक के बारे में 2 सप्ताह के लिए संस्कृति कोशिकाओंतों बर्तन के तल पर देखा जा सकता है.
  8. बर्तन के तल पर सेल कालोनियों लेबल. , 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर व्यंजन लो संख्या कुओं और प्रत्येक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर D10 युक्त Zeocin (50 माइक्रोग्राम / एमएल), डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल), और puromycin (2 ग्राम / एमएल) में जोड़ें. Transduced कोशिकाओं के मध्यम Aspirate, तो कम से कम एक मिनट के लिए कालोनियों में से प्रत्येक पर trypsin की एक बूंद जोड़ें. फिर, एक ही कालोनियों पर D10 के एक या एक से अधिक बूँदें जोड़ने. एक विंदुक के साथ एक के बाद कालोनियों एक उठाओ और 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की अलग कुओं में उन्हें स्थानांतरण.
  9. संस्कृति और वायरल उत्पादन क्षमता के मूल्यांकन के लिए D10 युक्त Zeocin (50 माइक्रोग्राम / एमएल), डॉक्सीसाइक्लिन (1 एनजी / एमएल) और puromycin (2 ग्राम / एमएल) में सभी सेल क्लोन का विस्तार.

3. प्रत्येक सेल क्लोन के वायरल उत्पादन का मूल्यांकन

  1. डॉक्सीसाइक्लिन बिना कि confluency ऐसे D10 में 6 सेमी टिशू कल्चर पकवान में 4x10 6 कोशिकाओं के चारों ओर उत्पादक कोशिकाओं और थाली Trypsinize90% से अधिक है. दैनिक ताजा पूर्व गर्म D10 के साथ मध्यम बदलें और Dox हटाने के बाद टिटर परख 72 घंटे के लिए मध्यम इकट्ठा.
  2. एक 0.45-माइक्रोन फिल्टर के साथ मध्यम छान कर वायरल तैरनेवाला हार्वेस्ट.
  3. प्लेट लक्ष्य कोशिकाओं 10 x 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 1, 96 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में डीसी इन रिसेप्टर (जैसे व्युत्पन्न 293T.hDC-इन या माउस अस्थि मज्जा वृक्ष के समान कोशिकाओं 16) और 293T व्यक्त. कुओं (अच्छी तरह से 100 μl /) के लिए वायरल सतह पर तैरनेवाला के 2 गुना धारावाहिक dilutions जोड़ें. आमतौर पर, 6-8 dilutions के GFP पॉजिटिव कोशिकाओं जोड़ा वायरस की राशि के लिए एक रैखिक संबंध में हैं transduced जिसमें सीमा तक पहुंचने के लिए पर्याप्त हैं.
  4. कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और के रूप में 1.4 चरण में वर्णित मध्यम जगह. BMDCs 10% FBS और जीएम-CSF (1:20 J558L वातानुकूलित माध्यम) के साथ RPMI मध्यम में संवर्धित किया जाना चाहिए.
  5. प्रवाह cytometry 4-6 दिनों के बाद पारगमन द्वारा कोशिकाओं transduced में GFP अभिव्यक्ति उपाय. lentiviral VectoGFP पॉजिटिव कोशिकाओं और वेक्टर राशि का प्रतिशत एक रैखिक संबंध में कर रहे हैं जब आर अनुमापांक वेक्टर कमजोर पड़ने रेंज में गणना की जाती है. बाद में आवेदन पत्र के लिए सबसे अधिक वायरल उत्पादन के साथ सेल क्लोन चुनें.

4. Lentiviral वैक्टर उत्पादन और ध्यान लगाओ

  1. संस्कृति 15 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन में उत्पादक सेल लाइन (एल.वी.-MGFP).
  2. डॉक्सीसाइक्लिन बिना ताजा D10 में confluency 90% से अधिक पर 15 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन में उत्पादक कोशिकाओं और प्लेट कोशिकाओं Trypsinize. दैनिक ताजा, पूर्व गर्म D10 के साथ मध्यम बदलें.
  3. शिखर वायरल उत्पादन (के रूप में उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित) के समय, वायरल सतह पर तैरनेवाला फसल और एक 0.45-माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर यह फिल्टर. 90 मिनट के लिए 50,000 XG पर parafilm और अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस के साथ सील, मोटी दीवार 32.5 मिलीलीटर ultracentrifuge एक ट्यूब में फ़िल्टर तैरनेवाला लोड. अच्छी तरह से 50 μl या आवेदन के आधार पर पीबीएस या HBSS के एक उचित मात्रा में गोली resuspend. </ ली>

5. विवो में चूहे छुटकारा और एंटीजन विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण करें

  1. धारा 4 में वर्णित के रूप में उच्च टिटर वायरस उत्पादन.
  2. वेक्टर निलंबन (लुटेरा प्रति 25 μl) के साथ एक लुटेरा मार्ग के माध्यम से BALB / ग चूहों (पुराने, महिला 6-8 सप्ताह) इंजेक्षन.
  3. 2 सप्ताह टीकाकरण के बाद, प्लीहा और फसल splenocytes अलग. GFP के मिलान पेप्टाइड्स के साथ और GFP विशिष्ट सीडी 8 की उपस्थिति + इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन धुंधला का उपयोग टी कोशिकाओं का विश्लेषण संस्कृति splenocytes, जैसा कि पहले 17 (3B चित्रा) का वर्णन किया.

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Representative Results

इस विधि में वर्णित स्थिर सेल लाइन विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं कि lentiviral वैक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं. चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, व्यक्तिगत क्लोन के अलगाव की गुणवत्ता 12 अलग से स्थिर सेल लाइनों झुकेंगे. परीक्षण 26 क्लोन के अलावा, 8 क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित एसवीजी-छद्म lentiviral वैक्टर के लिए एक विशिष्ट मानक है जो मिलीलीटर (टीयू / एमएल), प्रति अधिक से अधिक 10 से 6 पारगमन इकाइयों के एक टिटर में lentiviral कणों का उत्पादन किया. इसी समय, कई क्लोन कम से कम 10 4 टीयू / एमएल उत्पादन किया, यह एक मजबूत निर्माता प्राप्त करने के लिए कई क्लोन अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है.

एक क्लोन मज़बूती से अधिक से अधिक 10 से 7 टीयू / एमएल के एक टिटर पर lentiviral वैक्टर का उत्पादन किया. इस क्लोन पर आगे के परीक्षण वायरल उत्पादन के इस स्तर संस्कृति के माध्यम में सीरम की उपस्थिति / अनुपस्थिति से अप्रभावित, कई दिनों के लिए स्थिर, और एक था कि प्रदर्शन3 माह से अधिक (चित्रा 2) 12 के लिए सभ्य कोशिकाओं में chievable.

इन वायरस केवल इन विट्रो में प्रभावी नहीं थे कि पुष्टि करने के लिए, वे भी चूहों छुटकारा इस्तेमाल किया गया. Intracellular साइटोकाइन धुंधला द्वारा GFP-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण स्थिरतापूर्वक पर उत्पादन डीसी एल.वी. सभी सीडी 8 + Splenocytes की लगभग 4% (चित्रा 3) के 12 से GFP-विशिष्ट सीडी 8 की विस्तार + टी कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. टेट्रासाइक्लिन विनियमित lentiviral वेक्टर उत्पादक कोशिकाओं की पीढ़ी. एक रेट्रोवायरल वेक्टर ऑन साथ जीआरपी लाइनों के पारगमन सहित डीसी लक्षित lentiviral वेक्टर उत्पादक कोशिकाओं, बनाने के लिए प्रक्रिया की (ए) योजनाबद्ध रूपरेखाSVGmu लिफाफा जीन और concatemeric अभिकर्मक द्वारा ब्याज (वायरल वेक्टर) के जीन की अभिकर्मक aining. (बी) Zeocin उपचार द्वारा चयनित एकल क्लोन 1-2 हफ्तों में विस्तार किया गया है, और वायरल सतह पर तैरनेवाला के अनुमापांक 3 दिनों हटाने के बाद मापा गया था डॉक्सीसाइक्लिन की. दिखाया गया है, वायरल titers क्लोन द्वारा व्यापक रूप से विविध. (सी) प्लास्मिड नक्शे. प्लाज्मिड वायरल वेक्टर, TL20 GFP, एक murine स्टेम सेल वायरस प्रमोटर और एक टेट्रासाइक्लिन repressible प्रमोटर के नियंत्रण में वेक्टर जीनोम के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन encodes. PGK, ble विधान phosphoglycerate काइनेज 1 प्रमोटर (PGK) के तहत Zeocin प्रतिरोध जीन (श्री ble) encodes. रेट्रो SVGmu पी तंग टीईटी उत्तरदायी तत्व के तहत SVGmu ग्लाइकोप्रोटीन शामिल हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. वायरल वेक्टर उत्पादन के अभिलक्षण. (ए) Dox को हटाने के बाद, संस्कृति supernatants के वायरल वेक्टर अनुमापांक 7 दिनों के लिए प्रत्येक दिन मापा गया था. 72 घंटे बाद प्रेरण - वायरस उत्पादन 48 के बीच पहुंच गया. सीरम मुक्त मीडिया में संवर्धित कोशिकाओं के 10% FBS के साथ सुसंस्कृत लोगों के रूप में लगभग उतनी ही वायरस का उत्पादन किया. (बी) निर्माता कोशिकाओं 3 महीनों में सुसंस्कृत थे और aliquots वायरस उत्पादन के लिए समय समय पर परीक्षण किया गया. वायरस उत्पादन का कोई खास नुकसान मनाया गया.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्थिर डीसी लक्षित सेल लाइनों द्वारा उत्पादित lentiviral वैक्टर चुनिंदा इन विट्रो में DCs transduce और इन विवो में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं. <मजबूत> (ए) माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं एल.वी.-GFP और GFP अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry के साथ मापा गया था से संक्रमित थे. GFP अभिव्यक्ति वृक्ष के समान कोशिकाओं में शामिल हैं जो CD11c + कोशिकाओं के लिए विशिष्ट था. (बी) चूहे शुद्ध और केंद्रित एल.वी.-GFP के 2 एक्स 10 7 दर्जा साथ प्रतिरक्षित किया गया. दो हफ्ते बाद, सभी सीडी 8 + टी कोशिकाओं की लगभग 4% GFP के प्रमुख पेप्टाइड की प्रस्तुति के जवाब में IFNγ सक्रिय और व्यक्त किया गया.

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Discussion

यहाँ, हम स्थिरतापूर्वक नियामक प्रणाली बंद टीईटी के तहत सभी lentiviral घटकों के साथ transduced 293T कोशिकाओं का उपयोग lentiviral वैक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पादन के लिए एक विधि को रेखांकित किया है. तिथि करने के लिए, lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए सबसे प्रोटोकॉल (उदाहरण के लिए, 18 देखें) मानक कैल्शियम फॉस्फेट क्षणिक अभिकर्मक पर भरोसा करते हैं. यह दृष्टिकोण एक नैदानिक ​​पैमाने पर सफल रहा है, लेकिन यह स्थिर सेल लाइनों से उत्पादन स्केलिंग में उपस्थित होने की संभावना नहीं कुछ सीमाओं से पीड़ित हो सकता है. उदाहरण के लिए, एल.वी. plasmids के बड़ी मात्रा के साथ सह अभिकर्मक सैद्धांतिक रूप से प्रतिकृति सक्षम lentivirus 19 के विकास के लिए अवसरों में वृद्धि कर सकता है. इसके अलावा, क्षणिक transfections के 12 आवश्यक डीएनए आदानों की बड़ी मात्रा के कारण एक स्थिर निर्माता लाइन के उपयोग से एक बड़े पैमाने पर चर परिणामों का उत्पादन होने की संभावना है. सही परिस्थितियों में, ऐसे उत्पादक लाइनों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है γ-रेट्रो अन्यबड़े पैमाने 20,21 पर वायरल वैक्टर. हालांकि, lentiviral उत्पादक लाइनों का उपयोग पढ़ाई सीमित कर रहे हैं, और इस तरह प्रतिकृति सक्षम lentivirus पता लगाने के लिए मजबूत assays के 22 के शामिल किए जाने के नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए किसी भी सेल लाइन के विकास में महत्वपूर्ण हो जाएगा.

अन्य समूहों lentivirus उत्पादन स्थिर सेल लाइनों 6-11,23 लिए विवरण प्रकाशित किया है. हालांकि, इन रिपोर्टों की एक आम सीमा उनमें से कई नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उनकी सुरक्षा कम कर सकते हैं, जो ब्याज की जीन, एन्कोडिंग lentiviral वैक्टर के साथ उत्पादक कोशिकाओं transducing पर निर्भर है. यहाँ, हम स्वयं निष्क्रिय lentivirus उत्पादन कर सकते हैं कि कोशिकाओं transduce को concatemeric सरणी अभिकर्मक विधि 11 का उपयोग. इसके अलावा, टीईटी बंद प्रणाली की हमारी प्रयोग नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए विधि की उपयुक्तता को बेहतर बनाता है. इस नियामक प्रणाली सेल संस्कृति रखरखाव के दौरान SVGmu से विषाक्तता से बचाता है और antibiot तहत lentiviral वैक्टर के संग्रह के लिए अनुमति देता हैआईसी मुक्त परिस्थितियों.

प्रक्रिया के दौरान, यह lentiviral वैक्टर निपटने जब प्रयोगशाला कार्यकर्ताओं उचित सावधानियों का प्रयोग जरूरी है. Lentiviral वैक्टर एचआईवी -1, एक मानव रोगज़नक़ से प्राप्त कर रहे हैं, और सभी प्रक्रियाओं एक संस्था जैव सुरक्षा समिति के मार्गदर्शन में किया जाना चाहिए. प्रयोगों नैदानिक ​​अभ्यास 24 के ऊपर पहुंचा रहे हैं तो बढ़ाया BL2 रोकथाम संकेत दिया जा सकता है, हालांकि एनआईएच के अनुसार, BL2 रोकथाम, आम तौर पर इस तरह के यहाँ वर्णित के रूप में उन्नत lentiviral सिस्टम के साथ काम करने के लिए उपयुक्त है.

विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है कि प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, सेल संस्कृति विस्तार करने के लिए महान ध्यान के साथ किया जाना चाहिए. हम उत्पादक कोशिकाओं हर 24 घंटा passaged नहीं कर रहे हैं वायरस titers काफ़ी गिरावट पाया है. इसी तरह, एफबीएस से कुछ बहुत सारे वायरस उत्पादन में उल्लेखनीय गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, तो यह एफबीएस bef के कई बहुत सारे परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैअयस्क एक प्रयोग स्केलिंग. उच्च वायरस titers उत्पादन कर सकते हैं कि एक क्लोन के चयन के बहाव के अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है. पिछले काम 25 के साथ समझौते में, हम और अधिक तेजी से विभाजित करने के लिए दिखाई देते हैं कि क्लोन अधिक वायरस का उत्पादन करते हैं कि मिल गया है. एक बार एक उच्च टिटर क्लोन पाया गया है, इन कोशिकाओं aliquoted और FBS में जमे 10 +% DMSO के रूप में जल्द से जल्द किया जाना चाहिए. फिर, हौसले से thawed aliquots का उपयोग संभव उच्चतम अनुमापांक उत्पन्न करने में मदद करता है. अंगूठे के इस नियम का पालन करके, हम क्षणिक transfections के माध्यम से वायरस उत्पादन सबसे अधिक सफलता मिली है, और हम इसी तरह की सेल लाइन रखरखाव स्थिर वायरस उत्पादक कोशिकाओं को फायदा होगा कि उम्मीद है.

इस विधि के प्रमुख सीमा है कि यह एक स्थिर निर्माता लाइन उत्पन्न करने के लिए आगे के प्रयास का एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है. इस प्रकार, यह lentiviral वैक्टर के कई प्रकार के परीक्षण किया जाएगा जहां स्थितियों में उपयुक्त होने की संभावना नहीं है. क्षणिक transfections के thes के लिए और अधिक सुविधाजनक हो सकता हैआवेदनों की ई प्रकार. हम आम तौर पर वेक्टर पहले से ही एक छोटे प्रारूप में परीक्षण किया गया है के बाद वायरल वेक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की उम्मीद है. हमारे विशेष सेल लाइन का एक और सीमा लिफाफा प्रोटीन, SVGmu, इस रिसेप्टर को बांधता है क्योंकि जीपीआरएस कोशिकाओं द्वारा उत्पादित वैक्टर केवल डीसी इन व्यक्त कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हो जाएगा. अन्य सेलुलर रिसेप्टर्स लक्ष्य करने के लिए, प्रक्रिया मूल जीपीआर सेल लाइन में अन्य ग्लाइकोप्रोटीन प्लास्मिडों शुरू करने से संशोधित किया जा सकता है. Lentiviral वैक्टर GFP की तुलना में अधिक प्रासंगिक प्रोटीन प्रदान कर सकते हैं तो इसी तरह, ब्याज की अन्य जीन निर्माता सेल लाइनों में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है.

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Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि के लिए डेटा योगदान के लिए माइकल चाउ, Bingbing दाई, और लियांग जिओ स्वीकार करना चाहते हैं. हम भी इस अध्ययन में इस्तेमाल अभिकर्मकों के उदार उपहार के लिए डॉ. जॉन ग्रे को स्वीकार करते हैं. पंजाब नेशनल कैंसर केंद्र से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस शोध के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI68978, P01CA132681 और RCA170820A), बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, translational चिकित्सा के लिए संयुक्त केंद्र से एक translational त्वरण अनुदान और कैलिफोर्निया एचआईवी / एड्स से अनुदान से अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया रिसर्च प्रोग्राम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Mediatech Inc. 10-013-CV
FBS Sigma-Aldrich F2442
Glutamine Mediatech Inc. 25-005-Cl
Doxycycline Clontech Laboratories, Inc. 631311
Zeocin Invitrogen R250-01 Toxic
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
T4 DNA Ligase NEB M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506

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References

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एक टेट्रासाइक्लिन विनियमित सेल लाइन विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं को लक्षित है कि उच्च टिटर lentiviral वैक्टर का उत्पादन
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Bryson, P. D., Zhang, C., Lee, C.… More

Bryson, P. D., Zhang, C., Lee, C. L., Wang, P. A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (76), e50606, doi:10.3791/50606 (2013).

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