Summary
Ici, nous utilisons transduction rétrovirale et transfection concatémérique pour créer une lignée cellulaire qui peut exprimer les composantes d'un vecteur lentivirus (LV) en l'absence de tétracycline. Ce LV code pour la GFP et est pseudotypé avec une glycoprotéine, SVGmu, qui est spécifique d'un récepteur sur les cellules dendritiques.
Abstract
Les vecteurs lentiviraux (LV) sont un puissant moyen de fournir du matériel génétique à de nombreux types de cellules. En raison de problèmes de sécurité liés à ces VIH-1 vecteurs dérivés, produisant de grandes quantités de volumes logiques est difficile. Dans cet article, nous présentons une méthode pour produire des titres élevés d'VL auto-inactivant. Nous transduire rétrovirale le tet-off stable producteur lignée cellulaire GPR pour produire une lignée cellulaire, GPRS, qui peut exprimer tous les composants viraux, dont une glycoprotéine spécifique de la cellule dendritique, SVGmu. Ensuite, nous utilisons la transfection d'ADN concatémérique pour transfecter le transfert plasmide codant pour la GFP LV un gène rapporteur en combinaison avec un marqueur sélectionnable. Plusieurs des clones obtenus peuvent produire LV à un titre de 10 fois supérieure à ce que nous réalisons avec transfection transitoire. De plus, ces virus transduire efficacement des cellules dendritiques in vitro et génèrent une forte réponse immunitaire cellulaire de T à notre antigène de journaliste. Cette méthode peut être une bonne option for la production de vaccins à base de fortes LV pour les études cliniques de cancer ou de maladies infectieuses.
Introduction
Beaucoup de systèmes de vecteurs ont été développés pour la livraison de gènes. Vecteurs basés sur les lentivirus ont été parmi système virale la plus couramment étudiée. Ces vecteurs sont avantageux car ils peuvent transduire efficacement à la fois la division et non les cellules en division 1, obtenir une expression à long terme en raison de l'intégration dans le génome de l'hôte, présentent une faible immunité anti-vecteur naturel dans la plupart des populations humaines 2, et ont un faible potentiel de génotoxicité de mutagenèse par insertion 3,4.
La production de lentivirus a toujours été colorée par des préoccupations de sécurité. Les vecteurs lentiviraux sont généralement dérivés du VIH-1, l'agent étiologique du sida. Transfection transitoire de composants individuels du lentivector (transfert, l'enveloppe, et des plasmides d'emballage) est un moyen commun et flexible de livrer du matériel génétique en laboratoire. Cependant, l'extension des transfections transitoires pour des applications cliniques est lourd et may conduire à l'élaboration de lentivirus compétent pour la réplication 5,6. Pour surmonter ces obstacles, plusieurs emballage stable et lignées cellulaires de production ont été développées 6-11. Une de ces lignes, la ligne de conditionnement GPR 11, présente l'avantage d'être attrayant régulée par la tétracycline. Dans cet article, nous montrons comment adapter ce système à produire des auto-inactivant les vecteurs lentiviraux qui sont spécifiquement ciblés vers les cellules dendritiques (DC-LV) 12.
Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène les plus solides du système immunitaire. Ils ont fait l'objet d'un grand intérêt dans le développement du vaccin contre le cancer parce qu'ils initient directement, programme et régulent les réponses immunitaires spécifiques de la tumeur 13. Intégrant un protocole de vaccination afin d'inclure les PED a le potentiel de déclencher une réponse immunitaire antitumorale plus forte que peptidiques ou vaccins ADN. Récemment, nous avons développé un vecteur lentivirus qui specifically cible les cellules dendritiques par une glycoprotéine du virus de la sindbis modifiée, SVGmu 14. Ces vecteurs sont uniques en ce qu'ils montrent une grande spécificité pour les cellules dendritiques et générer des réponses immunitaires plus fortes que non spécifiques, vecteurs VSVg-pseudotypées.
Ici, nous présentons une méthode pour produire de grandes quantités de ces vecteurs lentiviraux DC ciblées. Nous démontrons que ces DC-LV peut infecter les PED et générer de fortes réponses immunitaires T CD8 + de cellules T. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées avec humanité, sous l'approbation de l'USC Intitutional protection des animaux et le Comité d'utilisation. Afin de réaliser des expériences in vivo et clinique, il est essentiel de créer une lignée cellulaire qui peut produire des virus à un titre élevé. Effectuer les étapes de transduction et transfection exactement comme décrit permettra de maximiser les chances de générer un tel clone.
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Protocol
Cellules productrices stables DC-LV sont construits sur la base de l'emballage de 11 lignée cellulaire GPR qui contient les composants lentiviral gagpol nécessaire, rev et le système Tet-off. Tout d'abord, la transduction rétrovirale est utilisé pour générer une lignée cellulaire de conditionnement GPRS qui code pour une glycoprotéine SVGmu tet-dépendante. Ensuite, concatémère tableau transfection est utilisé pour transfecter la lignée cellulaire GPRS avec un vecteur lentiviral transgène tel que la GFP. Cette lignée cellulaire productrice stable, désigné comme LV-mGFP, peut être testé in vitro et in vivo pour sa capacité à produire un vaccin DC-LV contre la GFP.
1. Génération d'une lignée cellulaire SVGmu Tet-dépendante
Le plasmide PRX-SVGmu est une construction dans laquelle la glycoprotéine SVGmu DC-spécifique est cloné en aval du promoteur tTA avancé de plasmide rétroviral pRetroX-Tet-Off 1 (figure 1C). 293T de la culture dans D10 (milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec10% de sérum de veau foetal, 2 mM L-glutamine). Culture lignée cellulaire d'emballage GPR en D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml). Toutes les cellules sont mises en culture dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2.
- 16-18 h avant transfection transitoire, plaque 2 x 10 6 cellules 293T à 4 ml de D10 dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm de telle sorte que les cellules approchent 90% de confluence au moment de la transfection.
- La transfection de plasmides rétroviraux: mélange 100 pi 1,25 M CaCl2 solution stérile, l'eau Milli-Q et les plasmides suivants: 5 ug PRX-SVGmu, 2,5 pg pgag-Pol, 2,5 pg pVSV-G. Le volume final est de 500 pi. Pour un polystyrène tube 5 ml à fond rond, ajouter 500 ul 2X HBS (HEPES 50 mM, 10 mM de KCl, 12 mM de dextrose, NaCl 280 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Ajouter le mélange goutte à goutte plasmide dans le tampon HBS 2X tout en faisant barboter le tampon vigoureusement avec une pipette Pasteur en verre. Après avoir ajouté le mixture, continuer bouillonnant pour un autre 30 secondes. Ensuite, ajoutez la totalité du mélange sur les cellules 293T à la boîte de culture de 6 cm, et incuber à 37 ° C.
- 4 heures après transfection, remplacer soigneusement le milieu dans la boîte de culture avec 4 ml D10 préchauffé.
- Spin infection: 48 heures après transfection, la récolte SVGmu codant pour des particules rétrovirales dans le surnageant en passant le surnageant à travers un filtre de 0,45 um. Plaque les cellules de conditionnement GPR dans un plat de 24 puits à 2 x 10 4 cellules / puits. Ajouter surnageant filtré de cellules d'encapsidation GPR dans le plat (2 ml / puits) et des cellules de centrifugation pendant 90 min à 1050 x g et 25 ° C. Changer le milieu dans D10 frais avec de la doxycycline (1 ng / ml) après spin-infection (2 ml / puits).
- 72 heures après la transfection, développez la culture de cellules transduites d'emballage en D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 ng / ml).
- Pour confirmer l'expression de SVGmu, culture des cellules sans doxycycline pendant 48 heures. Mesurer ex de surfacepression de SVGmu avec la cytométrie de flux en utilisant anti-Sindbis sérum. Ces cellules sont désignées en tant que lignée cellulaire d'empaquetage GPRS.
2. Construire DC-LV cellules productrices par Concatémère tableau transfection
Lentivirale plasmide de transfert TL20-GFP est une auto-inactivant lentiviral transfert vecteur plasmidique basé sur pCL20c-MSCV-GFP avec un système Dox-régulable ARN viral expression du génome et le remplacement du cytomégalovirus (CMV) activateur avec 7 tet opérateurs (figure 1C) 11 , 12,15. Plasmide PGK-ble est un résistant bléomycine (BLE) Cassette entraînée par un promoteur PGK faible 2.
- Digest 20 pg de plasmide TL20-GFP avec l'enzyme de restriction SfiI à 50 ° C. Digest 20 ug de plasmide PGK-ble avec PflMI à 37 ° C.
- Purifier les fragments d'ADN (la cassette PGK-ble est de 1011 pb et le vecteur TL20-GFP est 6861 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose.
- Ligaturer le TL20-GFP et PGK-Cassette ble à un rapport molaire de 25:1 (ONE ADN ligase de T4). Incuber une nuit à température ambiante.
- Après ligature du jour au lendemain, de purifier l'ADN à partir du mélange de ligature (Qiagen DNeasy Sang et Kit de tissus). Assurer la quantité d'ADN purifié est d'environ 5 ug.
- 16-18 h avant la transfection, les cellules de conditionnement GPRS plaque dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm de telle sorte que la confluence sera d'environ 90% au moment de la transfection.
- Utilisez la méthode de transfection au phosphate de calcium décrite à l'étape 1.2 pour la transfection de 5 ug de l'ADN purifié concatémérique dans les cellules de conditionnement GPRS dans la boîte de culture tissulaire de 6 cm. 4 heures après transfection, retirez soigneusement le support et la remplacer par 4 ml D10 préchauffé avec de la doxycycline (1 ng / ml).
- 48 heures après transfection, changer le milieu dans D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml). Sélectionner des clones transfectées par l'ajout zeocine (50 pg / ml) dans le milieu de culture. Culture des cellules pour environ 2 semaines jusqu'à cellule colonisationes est visible en bas de la vaisselle.
- Étiquette les colonies de cellules au fond de la vaisselle. Prenez des boîtes de culture tissulaire à 24 puits, nombre des puits et ajouter dans chaque puits 2 ml contenant zeocine D10 (50 pg / ml), la doxycycline (1 ng / ml), et la puromycine (2 pg / ml). Aspirer le milieu des cellules transduites, puis ajouter une goutte de la trypsine sur chacune des colonies pendant moins d'une minute. Ensuite, ajoutez un ou plusieurs gouttes de D10 sur les mêmes colonies. Ramassez colonies, un par un avec une pipette et transférer dans des réservoirs séparés de la plaque de culture tissulaire à 24 puits.
- Culture et développer tous les clones de cellules en D10 contenant zeocine (50 pg / ml), la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml) pour l'évaluation de la capacité de production virale.
3. Évaluer la production virale de chaque clone cellulaire
- Trypsiniser les cellules productrices et la plaque autour de 4x10 6 cellules en 6 cm boîte de culture tissulaire dans D10 sans doxycycline tels que la confluencesupérieur à 90%. Remplacez le support avec D10 frais préchauffé quotidienne et recueillir le support pour le titre dosage 72 heures après le retrait dox.
- Récolter le surnageant viral par le moyen de filtrage avec un filtre de 0,45 um.
- cellules cibles des plaques exprimant le récepteur DC-SIGN (par exemple 293T.hDC-signe ou la moelle osseuse de souris cellules dendritiques dérivées 16) et 293T comme contrôle négatif dans des boîtes de culture de 96 puits, 1 x 10 4 cellules / puits. Ajouter des dilutions en série de 2 fois du surnageant viral dans les puits (100 pl / puits). Généralement, 8.6 dilutions sont suffisantes pour atteindre la plage dans laquelle les cellules transduites GFP-positives sont dans une relation linéaire avec la quantité de virus ajouté.
- Centrifuger les cellules et remplacer le support tel que décrit dans l'étape 1.4. BMDCs doivent être cultivées dans un milieu RPMI avec 10% de FBS et GM-CSF (1:20 moyen J558L conditionné).
- Mesurer l'expression de la GFP dans les cellules transduites par cytométrie de flux 4-6 jours post-transduction. Le vecto lentiviralr titre est calculé dans la gamme de dilution de vecteur lorsque le pourcentage de cellules GFP-positives et le montant de vecteur sont dans une relation linéaire. Choisissez le clone cellulaire avec la production virale plus élevée pour les applications suivantes.
4. Produire et de concentrés vecteurs lentiviraux
- Culture de la lignée cellulaire de producteur (LV-mGFP) dans des boîtes de culture de tissu de 15 cm.
- Trypsiniser les cellules productrices et les cellules de la plaque dans les boîtes de culture tissulaire de 15 cm à plus de 90% de confluence dans D10 frais sans doxycycline. Changer le milieu avec des produits frais D10, préchauffé quotidien.
- Au moment de la production virale maximale (tel que déterminé par l'utilisateur), récolter le surnageant viral et filtrer à l'aide d'un filtre de 0,45 um. Chargez le surnageant filtré dans le mur 32.5 tubes d'ultracentrifugation ml d'épaisseur, sceller avec du parafilm et centrifuger à 50000 xg, 4 ° C pendant 90 min. Soigneusement remettre le culot dans 50 ul ou un volume approprié de PBS ou HBSS en fonction de l'application. </ Li>
5. Immuniser des souris in vivo et analyser la réponse immunitaire spécifique de l'antigène
- Produire des virus à titre élevé, comme décrit dans la section 4.
- Injecter des souris BALB / c (6-8 semaine, femelle) par une voie plantaire avec la suspension de vecteur (25 pi par talon).
- 2 semaines après la vaccination, isoler la rate et les cellules spléniques de récolte. splénocytes de culture avec épitopes peptides GFP et d'analyser la présence de GFP spécifique lymphocytes T CD8 + en utilisant la coloration des cytokines intracellulaires, comme décrit précédemment 17 (figure 3B).
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Representative Results
La lignée cellulaire stable décrit dans le présent procédé peut produire de grandes quantités de vecteurs lentiviraux qui sont spécifiquement destinés à des cellules dendritiques. Comme le montre la figure 1B, l'isolement de clones individuels a donné des lignées cellulaires stables de qualité 12 variables. Parmi les 26 clones testés, 8 produit des particules lentiviraux à un titre de plus de 10 6 unités de transduction par ml (TU / ml), ce qui est une référence typique de vecteurs lentiviraux SVG-pseudotypées produites par transfection transitoire. Dans le même temps, plusieurs clones ont produit moins de 10 4 TU / ml, il est important d'isoler plusieurs clones afin d'obtenir un important producteur.
Un clone a produit de manière fiable vecteurs lentiviraux à un titre supérieur à 10 7 TU / ml. D'autres essais sur ce clone a montré que ce niveau de production virale est restée stable pendant plusieurs jours, affectée par la présence / absence de sérum dans le milieu de culture, et unchievable dans des cellules cultivées pendant plus de 3 mois (figure 2) 12.
Pour confirmer que ces virus étaient non seulement efficaces in vitro, ils ont également été utilisés pour immuniser des souris. Analyse de la réponse immunitaire spécifique GFP par coloration des cytokines intracellulaires constaté que de manière stable produite DC-LV pourrait stimuler l'expansion de la GFP spécifique lymphocytes T CD8 + à près de 4% de tous les CD8 + splénocytes (figure 3) 12.
Figure 1. Génération de cellules productrices vecteur lentiviral tétracycline réglementées. (A) Représentation schématique de la procédure de mise cellules productrices vecteur lentiviral DC-ciblées, y compris la transduction des lignes GRP avec un vecteur rétroviral contAining le gène de l'enveloppe SVGmu et transfection du gène d'intérêt (vecteur viral) par transfection concatémérique. (B) clones individuels sélectionnés par traitement zeocine ont été étendues sur 1-2 semaines, et le titre du surnageant viral a été mesurée 3 jours après l'enlèvement de la doxycycline. Comme on le voit, les titres viraux ont varié considérablement selon clone. (C) Les cartes Plasmides. Le plasmide vecteur viral, TL20-GFP, code pour une protéine fluorescente verte sous le contrôle d'un promoteur du virus de cellule souche murine et le génome du vecteur sous le contrôle d'un promoteur répressible par la tétracycline. PGK-ble code pour le gène de résistance à la zéocine (Sh ble) en vertu de la phosphoglycérate kinase 1 promoteur constitutif (PGK). Rétro-SVGmu contient la glycoprotéine SVGmu sous l'étroite élément sensible tet P. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Caractéristiques de la production de vecteurs viraux. (A) Après le retrait de la DOX, le vecteur viral titre du surnageant de culture a été mesurée chaque jour pendant 7 jours. La production de virus a atteint un pic entre 48 à 72 après l'induction h. Les cellules cultivées dans un milieu sans sérum produit presque autant de virus que ceux cultivés avec 10% de FBS. (B) Les cellules productrices ont été cultivées pendant 3 mois et des aliquotes ont été testés périodiquement pour la production de virus. Aucune perte significative de la production de virus a été observée.
Figure 3. Les vecteurs lentiviraux produits par des lignées de cellules DC-ciblées stables peuvent sélectivement transduire DCs in vitro et de générer une réponse immunitaire in vivo. <strong> (A) osseuse des cellules dendritiques dérivées de la moelle de souris ont été infectées avec LV-GFP et l'expression de GFP a été mesurée par cytométrie de flux. Expression de la GFP était spécifique aux cellules CD11c +, qui comprennent les cellules dendritiques. (B) Les souris ont été immunisées avec 2 x 10 7 TUs de purifié et concentré LV-GFP. Deux semaines plus tard, près de 4% de toutes les cellules T CD8 + a été activé et a exprimé IFN en réponse à la présentation du peptide dominant GFP.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode pour produire de grandes quantités de vecteurs lentiviraux utilisant des cellules 293T stable transduites avec tous les composants lentiviraux sous la tet off système de réglementation. À ce jour, la plupart des protocoles pour produire des vecteurs lentiviraux reposent sur la transfection transitoire de phosphate de calcium standard (voir 18, par exemple). Cette approche a été couronnée de succès sur une échelle clinique, mais elle peut souffrir de certaines limites ne sont pas susceptibles d'être présents dans l'élargissement de la production de lignées cellulaires stables. Par exemple, co-transfection avec de grandes quantités de plasmides LV pourrait théoriquement augmenter le risque pour le développement de la réplication des lentivirus compétent 19. En outre, des transfections transitoires sont plus susceptibles de produire des résultats variables sur une grande échelle de l'utilisation d'une ligne de production stable en raison des grandes quantités d'intrants d'ADN requis 12. Dans de bonnes conditions, de telles lignes de production ont été utilisées pour produire d'autres γ-rétrovecteurs viraux sur de grandes échelles 20,21. Cependant, des études utilisant des lignes de production lentiviraux sont limitées, et donc l'inclusion de tests robustes 22 pour détecter la réplication lentivirus compétent sera essentielle dans le développement de toute lignée cellulaire pour une utilisation clinique.
D'autres groupes ont publié des descriptions des lignées cellulaires stables lentivirus producteurs 6-11,23. Toutefois, une limitation commune de ces rapports est que beaucoup d'entre eux comptent sur la transduction des cellules productrices avec des vecteurs lentiviraux codant pour le gène d'intérêt, ce qui peut réduire leur innocuité pour l'usage clinique. Ici, nous utilisons la méthode de transfection de tableau concatémérique 11 pour la transduction de cellules qui peuvent produire des lentivirus auto-inactivant. En outre, notre utilisation du système hors tet améliore l'aptitude de la méthode à l'usage clinique. Ce système de réglementation empêche la toxicité de SVGmu lors de l'entretien de culture cellulaire et permet la collection de vecteurs lentiviraux sous antibioconditions ic-libres.
Durant la procédure, il est important que les travailleurs de laboratoire utilisent les précautions appropriées lors de la manipulation des vecteurs lentiviraux. Les vecteurs lentiviraux sont dérivés du VIH-1, un agent pathogène humain, et toutes les procédures doivent être effectuées sous la direction d'un comité de biosécurité institution. Selon le NIH, BL2 confinement est généralement appropriée pour travailler avec des systèmes lentiviraux avancées telles que celle décrite ici, bien que renforcée confinement BL2 peut être indiqué si les expériences sont élargis pour la pratique clinique 24.
Il ya plusieurs étapes importantes de la procédure qui nécessitent des soins spéciaux. Tout d'abord, la culture cellulaire doit être effectuée avec une grande attention aux détails. Nous avons constaté que les titres de virus diminuent sensiblement si les cellules productrices sont pas repiquées chaque h 24. De même, certains lots de FBS peuvent conduire à des baisses importantes de production de virus, il est donc important de tester plusieurs lots de FBS befminerai intensifier une expérience. La sélection d'un clone qui peut produire des titres élevés de virus est essentielle pour les applications en aval. En accord avec des travaux antérieurs 25, nous avons constaté que les clones qui semblent diviser plus rapidement ont tendance à produire plus de virus. Une fois qu'un clone titre élevé a été constaté, ces cellules doivent être aliquotés et congelés dans FBS + 10% DMSO dès que possible. Puis, en utilisant portions fraîchement décongelé contribue à générer le titre le plus élevé possible. En suivant cette règle, nous avons eu le plus de succès production de virus par des transfections transitoires, et nous prévoyons que le maintien de la lignée cellulaire similaire sera bénéfique pour les cellules productrices de virus stables.
Limitation majeure de cette méthode est qu'elle nécessite une quantité importante d'effort avant pour générer une ligne de production stable. Ainsi, il n'est pas susceptible d'être approprié dans les situations où plusieurs types de vecteurs lentiviraux seront testés. Des transfections transitoires peuvent être plus pratique pour les thestypes de courriers d'applications. Nous prévoyons généralement en utilisant cette méthode pour générer de grandes quantités de vecteur viral après le vecteur a déjà été testé dans un petit format. Une autre limite de notre lignée cellulaire spécifique est que les vecteurs produits par les cellules GPRS ne seront spécifiques des cellules exprimant DC-SIGN, car la protéine d'enveloppe, SVGmu, se lie à ce récepteur. Afin de cibler autres récepteurs cellulaires, la procédure peut être modifiée par l'introduction d'autres plasmides de la glycoprotéine dans la lignée de cellules d'origine GPR. De même, d'autres gènes d'intérêt peuvent être transfectés dans des lignées cellulaires de producteurs afin que les vecteurs lentiviraux peuvent délivrer des protéines plus pertinente que la GFP.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Michael Chou, Bingbing Dai, et Liang Xiao pour contribuer données pour ce manuscrit. Nous remercions également le Dr John Gray pour les dons généreux des réactifs utilisés dans cette étude. PB est soutenue par une bourse de recherche postdoctorale du Centre national du cancer. Cette recherche a été financée par des subventions de l'Institut national de la santé (R01AI68978, P01CA132681 et RCA170820A), une subvention de la Fondation Bill et Melinda Gates, une subvention d'accélération de translation de la Joint Center for Translational Medicine et une subvention de la Californie du VIH / SIDA Programme de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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