Summary
Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.
Abstract
Lentivirale vectoren (GW) zijn een krachtig middel van het leveren van genetisch materiaal naar vele soorten cellen. Vanwege de bezorgdheid over de veiligheid in verband met deze HIV-1 afgeleide vectoren, het produceren van grote hoeveelheden EGW is uitdagend. In dit artikel beschrijven we een methode voor het produceren van hoge titers van zelf-inactiverende LVs. We retroviraal transduceren de tet-off stabiele productiecellijn GPR een cellijn, GPRS, waarbij alle virale componenten, zoals een dendritische cel-specifieke glycoproteïne, SVGmu kan expressie brengen. Vervolgens gebruiken we concatemere DNA transfectie van de LV overdracht plasmide coderend transfecteren reportergen GFP in combinatie met een selecteerbare merker. Verscheidene van de resulterende klonen LV produceren een titer 10 maal groter dan wat we bereiken met voorbijgaande transfectie. Bovendien, deze virussen efficiënt transduceren van dendritische cellen in vitro en genereert een sterke T-cel immuunrespons op onze reporter antigeen. Deze methode kan een goede optie zijn for tot sterke LV-gebaseerde vaccins voor klinische studies van kanker of infectieziekten.
Introduction
Veel vectorsystemen ontwikkeld voor genaflevering. Vectoren op basis van lentivirussen zijn tot de meest bestudeerde viraal systeem. Deze vectoren zijn voordelig omdat ze efficiënt transduceren zowel delende als niet-delende cellen 1, langdurige expressie bereiken door integratie in het gastheergenoom, vertonen lage natuurlijke anti-vector immuniteit meeste menselijke populaties 2, en hebben een gering genotoxiciteit van insertiemutagenese 3,4.
Productie van lentiviruses is altijd gekleurd is door bezorgdheid over de veiligheid. Lentivirale vectoren zijn over het algemeen afkomstig zijn van HIV-1, het etiologische agens van AIDS. Transiënte transfectie van individuele componenten van de lentivector (transfer, enveloppen en verpakkingen plasmiden) is een veel voorkomende en soepelheid van afleveren van genetisch materiaal in laboratoriumsituatie. Echter, opschaling voorbijgaande transfecties voor klinische toepassingen is omslachtig en may leiden tot de ontwikkeling van replicatie-competent lentivirus 5,6. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben diverse stabiele verpakking en producer cellijnen ontwikkeld 6-11. Een van deze lijnen, de GPR verpakkingslijn 11, heeft het aantrekkelijke voordeel van de regels van het tetracycline. In dit artikel laten we zien hoe dit systeem aan te passen aan zichzelf inactiveren lentivirale vectoren die specifiek gericht zijn in de richting van dendritische cellen (DC-GW) 12 te produceren.
Dendritische cellen (DCs) zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het immuunsysteem. Zij hebben het onderwerp van groot belang bij kanker vaccin ontwikkeling, omdat ze direct te starten, het programma, en de regulering van tumor-specifieke immuunrespons 13. Waarin een vaccinatie protocol te nemen DCs heeft het potentieel om een sterkere antitumor immuunrespons dan peptide of DNA vaccins wekken. Onlangs hebben we een lentivirale vector ontwikkeld die specifically richt dendritische cellen met een gemodificeerd sindbis virus glycoproteïne, SVGmu 14. Deze vectoren zijn uniek omdat ze tonen hoge specificiteit voor dendritische cellen en het genereren sterker dan niet-specifieke immuunresponsen, VSVg-pseudotype vectoren.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het produceren van grote hoeveelheden van deze DC-gerichte lentivirale vectoren. We tonen aan dat deze DC-LVs DCs kunnen infecteren en het genereren van een sterke CD8 + T-cel immuunrespons. Alle procedures waarbij dieren werden humane wijze uitgevoerd, onder goedkeuring van de USC Intitutional Animal Care en gebruik Comite. Om uit te voeren in vivo of klinische experimenten is het essentieel om een cellijn die kan produceren virus met hoge titer te creëren. Het uitvoeren van de transductie en transfectie stappen precies zoals beschreven zal maximaliseren van de kansen van een dergelijke kloon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC-LV stabiele producerende cellen worden geconstrueerd op basis van de GPR inpakcellijn 11 dat de nodige lentivirale onderdelen gagpol, rev en de tet-off systeem bevat. Eerst wordt retrovirale transductie gebruikt om een GPRS verpakkingscellijn die een tet-afhankelijke SVGmu glycoproteïne codeert genereren. Vervolgens wordt concatemeer scala transfectie gebruikt om transfecteren de GPRS-cellijn met een lentivirale vector transgen zoals GFP. Deze stabiele producer cellijn, aangeduid als LV-MGFP kunnen worden getest in vitro en in vivo voor zijn vermogen om een DC-LV vaccin tegen GFP produceren.
1. Het genereren van een Tet-afhankelijke SVGmu Cell Line
Plasmide PRX-SVGmu is een constructie waarbij DC-specifieke glycoproteïne SVGmu stroomafwaarts van de tTA-geavanceerde promotor van retrovirale plasmide pRetroX-Tet-off 1 (figuur 1C) wordt gekloond. 293T cellen in kweek D10 (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine). Cultuur GPR verpakkingscellijn in D10 met doxycycline (1 ng / ml) en puromycine (2 pg / ml). Alle cellen worden gekweekt in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2.
- 16-18 uur voor transiënte transfectie, plaat 2 x 10 6 293T cellen in 4 ml D10 in een 6-cm weefselkweek schotel zodanig dat de cellen benadering 90% confluentie op het moment van transfectie.
- Transfectie van retrovirale plasmiden: meng 100 ul 1,25 M CaCl2-oplossing, steriel Milli-Q water en de volgende plasmiden: 5 pg PRX-SVGmu, 2,5 pg PGAG-Pol, 2,5 pg pVSV-G. Het uiteindelijke volume is 500 pi. Om een 5 ml polystyreen ronde bodem buis, voeg 500 ul 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCl, 12 mM dextrose, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7.05). Voeg het plasmide mengsel druppelsgewijs in de 2X HBS buffer terwijl borrelen de buffer krachtig met een glas Pasteur pipet. Na het toevoegen van de mixture, blijven borrelen nog 30 sec. Voeg vervolgens het gehele mengsel op de 293T cellen in de 6-cm kweekschaal en incuberen bij 37 ° C.
- 4 uur na transfectie, zorgvuldig vervangen medium in de kweekschaal met 4 ml voorverwarmd D10.
- Spin-infectie: 48 uur na transfectie, oogst SVGmu-coderen retrovirale deeltjes in het supernatant door het passeren van de bovenstaande vloeistof door een 0,45-um filter. Plaat de GPR verpakking cellen in een 24-well schotel bij 2 x 10 4 cellen / putje. Voeg gefiltreerd supernatant GPR inpakcellen in de schaal (2 ml / putje) en gecentrifugeerd cellen gedurende 90 minuten bij 1050 xg en 25 ° C. Wijzig medium in de frisse D10 met doxycycline (1 ng / ml) na de spin-infectie (2 ml / putje).
- 72 uur na transfectie, uitbreiding van de kweek van getransduceerde cellen in verpakkingen D10 met doxycycline (1 ng / ml) en puromycine (2 ng / ml).
- Om de expressie van SVGmu, de cultuur van de cellen te bevestigen zonder doxycycline voor 48 uur. Meten oppervlak expressie van SVGmu met flowcytometrie met behulp van anti-Sindbis serum. Deze cellen worden aangeduid als GPRS inpakcellijn.
2. Construct DC-LV Producer cellen door concatemeer Array Transfection
Lentivirale plasmide voor overdracht TL20-GFP is een zelf-inactiverende overdracht lentivirale vector plasmide gebaseerd op pCL20c-MSCV-GFP met Dox reguleerbare viraal RNA genoom expressiesysteem en vervanging van het cytomegalovirus (CMV) enhancer met 7 tet-operators (figuur 1C) 11 , 12,15. Plasmide PGK-ble is een bleomycine resistent (BLE) cassette aangedreven door een zwakke PGK-promoter 2.
- Digest 20 ug plasmide TL20-GFP met het restrictie-enzym Sfil bij 50 ° C. Digest 20 ug plasmide PGK-baar met PflMI bij 37 ° C.
- Zuiver het DNA-fragmenten (de PGK-bare cassette 1011 bp en vector TL20-GFP is 6861 bp) door agarose gelelektroforese.
- Afbinden van de TL20-GFP vector en PGK-ble cassette bij een molaire verhouding van 25:1 (NEB T4 DNA ligase). Incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
- Na een nacht ligatie, zuiveren van DNA uit het ligatiemengsel (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Zorg ervoor dat de hoeveelheid gezuiverde DNA is ongeveer 5 pg.
- 16-18 uur voor transfectie plaat GPRS verpakking cellen in een 6-cm weefselkweek schotel zodanig dat het ongeveer 90% confluentie op het moment van transfectie zijn.
- Gebruik calciumfosfaattransfectiemethode in stap 1.2 beschreven 5 ug van het gezuiverde DNA concatemere transfecteren in de GPRS inpakcellen in de 6-cm weefselkweek schotel. 4 uur na transfectie, verwijder voorzichtig het medium en te vervangen door 4 ml voorverwarmde D10 met doxycycline (1 ng / ml).
- 48 uur na transfectie, verandert het medium in D10 met doxycycline (1 ng / ml) en puromycine (2 pg / ml). Selecteren voor getransfecteerde klonen door toevoeging zeocine (50 ug / ml) in het kweekmedium. De cultuur van de cellen voor ongeveer 2 weken totdat cel colonies te zien op de onderkant van de gerechten.
- Label de celkolonies onderaan de gerechten. Neem 24-well weefselkweekplaten nummer van de putten en toevoegen aan elk putje 2 ml D10 met zeocine (50 ug / ml), doxycycline (1 ng / ml) en puromycine (2 pg / ml). Zuig het medium van de getransduceerde cellen, voeg dan een druppel trypsine op elk van de kolonies minder dan een minuut. Vervolgens voegt u een of meer druppels van D10 op dezelfde kolonies. Pick-up kolonies een voor een met een pipet en breng ze in afzonderlijke putjes van de 24-well weefselkweek plaat.
- Cultuur en uitklappen celklonen in D10 met zeocine (50 ug / ml), doxycycline (1 ng / ml) en puromycine (2 pg / ml) voor de beoordeling van virale producerende vermogen.
3. Evalueer Virale Productie van elke cel Clone
- Trypsinize de producerende cellen en de plaat rond 4x10 6 cellen in 6-cm weefselkweek schotel in D10 zonder doxycycline zodanig dat de confluentiemeer dan 90%. Vervang het medium met verse voorverwarmde D10 dagelijks en het verzamelen van het medium voor de titer test 72 uur na het verwijderen van dox.
- Oogst de virale supernatant door het filteren van het medium met een 0,45-um filter.
- Plaat doelwit cellen die het DC-SIGN receptor (bijv. 293T.hDC-SIGN of muizen beenmerg afgeleide dendritische cellen 16) en 293T als een negatieve controle in 96-putjes, 1 x 10 4 cellen / putje. Voeg 2-voudige seriële verdunningen van het virale supernatant van de putjes (100 ul / putje). Meestal 6-8 verdunningen voldoende om aan waarin getransduceerde GFP-positieve cellen in een lineaire relatie met de hoeveelheid virus toegevoegd bereiken.
- Centrifugeer cellen en vervang het zoals beschreven in stap 1.4 medium. BMDCs worden gekweekt in RPMI medium met 10% FBS en GM-CSF (01:20 J558L geconditioneerd medium).
- Meet de GFP expressie in getransduceerde cellen door flowcytometrie 4-6 dagen na transductie. De lentivirale vector titer wordt berekend in de vector verdunningsreeks wanneer het percentage GFP-positieve cellen en vector hoeveelheid in een lineair verband. Kies de cel kloon met de hoogste virale productie voor latere aanvragen.
4. Produceren en Concentreer lentivirale vectoren
- Cultuur de producent cellijn (LV-MGFP) in 15-cm weefselkweek gerechten.
- Trypsinize de producerende cellen en plaat cellen in 15-cm weefselkweek gerechten in meer dan 90% confluentie in vers D10 zonder doxycycline. Wijzig medium met verse, voorverwarmde D10 dagelijks.
- Bij de maximale virusproductie (zoals bepaald door de gebruiker), het oogsten virale supernatant en filteren met behulp van een 0,45 um filter. Laad de gefiltreerde supernatans in dikwandige 32,5 ml ultracentrifuge buizen afsluiten met parafilm en centrifugeer bij 50.000 xg, 4 ° C gedurende 90 minuten. Grondig resuspendeer de pellet in 50 ul of een geschikt volume PBS of HBSS afhankelijk van de toepassing. </ Li>
5. Immuniseren Muizen In vivo en analyseren Antigeen-specifieke immuunrespons
- Produceer hoge titer virus zoals beschreven in paragraaf 4.
- Injecteer BALB / c muizen (6-8 weken oud, vrouw) via een voetzool route met de vector suspensie (25 pi per voetzool).
- 2 weken na immunisatie, isoleren milt en oogst splenocyten. Cultuur splenocyten met GFP epitoop peptiden en analyseren van de aanwezigheid van GFP-specifieke CD8 + T cellen met behulp van intracellulaire cytokine kleuring, zoals eerder beschreven 17 (figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stabiele cellijn in deze beschreven werkwijze kunnen grote hoeveelheden van lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen. Zoals getoond in figuur 1B, isolatie van afzonderlijke klonen leverden stabiele cellijnen van uiteenlopende kwaliteit 12. Van 26 geteste klonen, 8 geproduceerd lentivirale deeltjes met een titer van meer dan 10 6 transductie eenheden per ml (TU / ml), wat een typisch maatstaf voor SVG-pseudogetypeerde lentivirale vectoren geproduceerd door transiënte transfectie. Tegelijkertijd, verscheidene klonen produceerde minder dan 10 4 TU / ml, is het belangrijk om meerdere klonen te isoleren, teneinde een sterke fabrikant.
Een kloon betrouwbaar geproduceerde lentivirale vectoren met een titer van meer dan 10 7 TU / ml. Nader onderzoek van deze kloon toonde dat dit niveau van virale productie was stabiel gedurende meerdere dagen, beïnvloed door de aanwezigheid / afwezigheid van serum in het kweekmedium, en eenchievable in cellen gekweekt gedurende meer dan 3 maanden (fig. 2) 12.
Om te bevestigen dat deze virussen niet alleen effectief in vitro, werden zij ook gebruikt om muizen te immuniseren. Analyse van GFP-specifieke immuunrespons door intracellulaire cytokine kleuring vond die stabiel geproduceerde DC-LV uitbreiding van GFP-specifieke CD8 + T-cellen kunnen stimuleren tot bijna 4% van de CD8 + Splenocyten (Figuur 3) 12.
Figuur 1. Generatie van tetracycline-gereguleerde lentivirale vector producerende cellen. (A) Schematisch overzicht van de procedure voor het maken van DC-gerichte lentivirale vector producerende cellen, waaronder transductie van GRP lijnen met een retrovirale vector containing de SVGmu envelopgen en transfectie van het gen van belang (virale vector) door concatemere transfectie. (B) Single klonen door zeocine geselecteerde behandeling werden geëxpandeerd gedurende 1-2 weken, en de titer van het virale supernatant werd gemeten 3 dagen na verwijdering van doxycycline. Zoals getoond, virale titers varieerde sterk per kloon. (C) Plasmide kaarten. De virale vector plasmide, TL20-GFP codeert voor groen fluorescent eiwit onder de controle van een murine stamcel virus promoter en het vector genoom onder controle van een tetracycline te onderdrukken promoter. PGK-ble codeert de zeocine resistentiegen (Sh ble) onder de constitutieve fosfoglyceraatkinase 1 promoter (PGK). Retro-SVGmu bevat de SVGmu glycoproteïne onder de P strakke tet responsief element. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Kenmerken van virale vectorproductie. (A) Na verwijdering van dox, de virale vector titer van kweeksupernatanten werd dagelijks gemeten gedurende 7 dagen. De virusproductie piek tussen 48-72 uur na inductie. Cellen gekweekt in serumvrij medium vormde ongeveer evenveel virus die gekweekt met 10% FBS. (B) Producer cellen werden gekweekt in 3 maanden werden monsters periodiek getest virusproductie. Geen verlies van virusproductie waargenomen.
Figuur 3. Lentivirale vectoren geproduceerd door stabiele DC-gerichte cellijnen kunnen selectief transduceren DCs in vitro en het genereren van een immuunreactie in vivo. <strong> (A) muis beenmerg afgeleide dendritische cellen werden geïnfecteerd met LV-GFP en GFP-expressie werd gemeten met flowcytometrie. GFP expressie specifiek CD11c + cellen, die dendritische cellen omvatten. (B) Muizen werden geïmmuniseerd met 2 x 10 7 TU gezuiverd en geconcentreerd LV-GFP. Twee weken later, ongeveer 4% van de CD8 + T-cellen geactiveerd en IFNy expressie in reactie op de presentatie van de GFP dominante peptide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben wij een werkwijze voor het produceren van grote hoeveelheden lentivirale vectoren met 293T cellen die stabiel getransduceerd met lentivirale componenten onder de tet-off regelgeving geschetst. Tot dusver zijn de meeste protocollen lentivirale vectoren gebaseerd op standaard calciumfosfaat transiënte transfectie (zie 18 bijvoorbeeld). Deze aanpak is succesvol op klinische schaal zijn, maar kunnen lijden aan een aantal beperkingen waarschijnlijkheid niet in opschaling productie van stabiele cellijnen te zijn. Bijvoorbeeld, kan co-transfectie met grote hoeveelheden plasmiden LV theoretisch verhogen de kans op de ontwikkeling van replicatie competent lentivirus 19. Verder voorbijgaande transfecties vaker variabele resultaten op grote schaal dan het gebruik van een stabiele producent lijn vanwege de grote hoeveelheden DNA nodig inputs 12. Onder de juiste omstandigheden, hebben dergelijke producent lijnen werden gebruikt voor het genereren andere γ-retrovirale vectoren op grote schaal 20,21. Echter, onderzoeken waarin lentivirale producent lijnen beperkt en daarmee de opname van robuuste assays 22 replicatie competent lentivirus detecteren kritisch in het ontwikkelen van een cellijn voor klinisch gebruik.
Andere groepen hebben beschrijvingen van lentivirus-producerende stabiele cellijnen 6-11,23 gepubliceerd. Een gemeenschappelijk beperking van deze rapporten is dat zij veelal op transduceren de producerende cellen met lentivirale vectoren die coderen voor het gen van belang, waarvan de veiligheid voor klinisch gebruik kan verminderen. Hier maken we gebruik van de concatemere scala transfectiemethode 11 tot cellen die kunnen produceren zelf-inactiverende lentivirus transduceren. Verder is ons gebruik van het tet off systeem verbetert de geschiktheid van de methode voor klinisch gebruik. Dit regelgevend systeem voorkomt toxiciteit van SVGmu tijdens celcultuur onderhoud en zorgt voor de inzameling van lentivirale vectoren onder Antibiotic-vrije omstandigheden.
Tijdens de procedure, is het belangrijk dat laboranten gebruiken de nodige voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van de lentivirale vectoren. Lentivirale vectoren zijn afgeleid van HIV-1, een menselijk pathogeen, en alle procedures moet onder begeleiding van een instelling bioveiligheid commissie worden uitgevoerd. Volgens de NIH, BL2 insluiting algemeen geschikt voor het werken met lentivirale geavanceerde systemen zoals het hier beschreven, hoewel verbeterde BL2 insluiting worden aangeduid als experimenten up worden opgeschaald voor klinische praktijk 24.
Er zijn een aantal cruciale stappen in de procedure die speciale zorg nodig hebben. Ten eerste moet celkweek worden uitgevoerd met veel aandacht voor detail. Wij hebben gevonden dat virus titers afnemen merkbaar als productiecellen niet gepasseerd elke 24 uur. Evenzo kunnen sommige veel FBS leiden tot een significante afname in virusproductie, dus is het belangrijk om meerdere veel FBS bef testenerts opschaling een experiment. De selectie van een kloon die kan hoge virus titers essentieel is voor verdere toepassingen. In overeenstemming met eerder werk 25 hebben wij gevonden dat de klonen die lijken sneller verdelen neiging om meer virus te produceren. Zodra een hoge titer kloon werd gevonden, moeten deze cellen hoeveelheden verdeeld en bevroren in 10% FBS + DMSO zo spoedig mogelijk. Dan, met vers ontdooide porties in een optimale titer mogelijk geworden. Door het volgen van deze vuistregel, hebben we het meeste succes producerende virus via voorbijgaande transfecties gehad, en wij verwachten dat soortgelijke cellijn onderhoud zullen profiteren stabiel virus-producerende cellen.
Deze methode's belangrijkste beperking is dat het vereist een aanzienlijke hoeveelheid aan de voorkant inspanning om een stabiele producent lijn genereren. Aldus is het niet waarschijnlijk geschikt in situaties waarbij meerdere soorten lentivirale vectoren worden getest. Voorbijgaande transfecties wellicht handiger voor These soorten toepassingen. Wij voorzien het algemeen met behulp van deze methode om grote hoeveelheden virale vector te genereren nadat de vector al in klein formaat getest. Een andere beperking van onze specifieke cellijn is dat vectoren geproduceerd door de GPRS-cellen alleen specifiek voor cellen die DC-SIGN zal zijn omdat het envelop eiwit, SVGmu, bindt aan deze receptor. Om andere cellulaire receptoren richten, kan de procedure worden gewijzigd door de invoering van andere glycoproteïne plasmiden in de oorspronkelijke GPR cellijn. Evenzo kunnen andere genen van belang worden getransfecteerd in de producerende cellijnen zodat lentivirale vectoren meer relevante eiwitten kan leveren dan GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Michael Chou, Bingbing Dai, en Liang Xiao erkennen voor het bijdragen gegevens voor dit manuscript. Wij erkennen ook Dr John Gray voor de gulle giften van de reagentia gebruikt in deze studie. PB wordt ondersteund door een post-doctorale beurs van de National Cancer Center. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 en RCA170820A), een subsidie van de Bill en Melinda Gates Foundation, een translationele versnelling subsidie van het Joint Center for Translational Medicine en een subsidie van de California HIV / AIDS Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
