Summary
这里，我们用逆转录病毒转导和concatemeric的转染建立的细胞系中能表达的慢病毒载体（LV）的组件在没有四环素。此LV编码绿色荧光蛋白是一种糖蛋白，SVGmu，这是具体的树突状细胞上的受体与假。
Abstract
慢病毒载体（逻辑卷）是许多类型的细胞提供遗传材料的有力手段。由于相关的安全问题与这些HIV-1的衍生载体，产生大量的LVS是具有挑战性的。在本文中，我们报道了一种用于生产高滴度自我失活LVS的。逆转录病毒转导的tet过稳定线GPR生产细胞产生的细胞系，GPRS，它可以表示所有的病毒组分，包括树突状细胞特异性糖蛋白，SVGmu。然后，我们使用concatemeric的LV的转移质粒编码DNA转染，转染报道基因GFP的组合用一个可选择的标记。得到的克隆可以制作LV上面滴度大于10倍的我们实现与瞬时转染的。另外，这些病毒高效转染树突状细胞在体外和产生强烈的T细胞免疫反应向本报记者抗原。这种方法可能是一个不错的选择FOŗ强LV为基础的疫苗，癌症或传染病的临床研究。
Introduction
已经开发了许多载体系统的基因传递。基于慢病毒载体已跻身研究最常用的病毒系统。这些载体是有利的，因为他们可以高效转染分裂和非分裂细胞1，由于整合到宿主基因组实现长期表达，表现出低的天然抗载体在大多数人群的免疫力，并具有低潜力从插入突变3,4的遗传毒性。
慢病毒的生产安全问题一直着色。慢病毒载体一般是来自于HIV-1，艾滋病的病原体。单个元件的慢病毒（转让，外壳和包装质粒）的瞬时转染是一种常见的和灵活的方法，在实验室设置中提供的遗传物质。然而，扩大规模的临床应用瞬时转染是繁琐和马的Ÿ导致复制能力的慢病毒5,6的发展。要克服这些障碍，稳定的包装和生产细胞系已开发6-11。这些线路之一，探地雷达的包装生产线11，受四环素有吸引力的优势。在本文中，我们将演示如何适应这种系统产生自我失活的慢病毒载体，是专门面向树突状细胞（DC-LVS）12。
树突状细胞（DC）是最强大的抗原呈递细胞的免疫系统。他们已经在癌症疫苗开发的主题极大的兴趣，因为它们直接启动，程序和规范肿瘤特异性免疫反应13。装有包括区议会有可能引出更强的抗肿瘤免疫反应比肽或DNA疫苗的接种方案。最近，我们已经开发出一种慢病毒载体，specificallÝ针对树突状细胞，通过修改辛德毕斯病毒糖蛋白，SVGmu 14。这些载体是独特的，他们表现出高特异性树突状细胞，并产生更强的免疫反应比特异性，VSVG假型载体。
在这里，我们报告的方法产生大量的这些直流针对性的慢病毒载体。我们表明，这些DC-LVS可以感染区议会和产生强烈的CD8 + T细胞的免疫反应。所有程序涉及动物的人道待遇，执行下USC Intitutional动物护理和使用委员会批准。为了执行在体内和临床实验，这是至关重要的建立的细胞系，可以制作高滴度的病毒。执行转导和转染与所述的相同的步骤，将产生这样的克隆的机会最大化。
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Protocol
DC-LV稳定生产细胞构造基于对GPR包装细胞系11包含必要的慢病毒组件gagpol，转和TET关闭系统。首先，逆转录病毒转导是用来产生一个GPRS编码一个四面体依赖SVGmu的糖蛋白的包装细胞系。然后，连环体数组转染用于转染的GPRS慢病毒载体的转基因如GFP细胞系。指定为LV-mGFP的这种稳定的生产细胞系，可在体外和体内进行测试，它能够产生一个DC-LV疫苗的GFP。
1。生成一个春节依赖SVGmu的细胞系
质粒PRX-SVGmu是一个构建体，其中被克隆的DC-特异性糖蛋白SVGmu的的下游启动子的逆转录病毒质粒pRetroX四环素销1（ 图1C），tTA的先进。文化293T细胞在D10（Dulbecco改良的Eagle培养基与10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺）。文化GPR与多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）在D10的包装细胞系。所有细胞培养在5％CO 2，饱和湿度37℃培养箱。
- 瞬时转染前16-18小时，板2×10 6 293T细胞在4ml的D10在6厘米的组织培养皿中，例如，细胞在转染时的接近90％汇合。
- 逆转录病毒质粒转染 ：混合100微升1.25M的CaCl 2的溶液，无菌Milli-Q水和下列质粒：5微克PRX-SVGmu的，2.5微克pGag聚合物，2.5微克pVSV-G。最终体积为500微升。 5毫升聚苯乙烯圆底管，加入500μl2X HBS（50毫米HEPES，氯化钾10毫米，12毫米葡萄糖，氯化钠280毫米，1.5毫米的Na 2 HPO 4 * 7H 2 O，pH值7.05）。添加质粒进入2X HBS缓冲区的混合物滴鼓泡缓冲区的同时大力巴斯德玻璃吸管。添加英里后夹具，继续冒泡另一个30秒。然后，将整个混合物添加到293T细胞在6厘米培养皿中，在37℃下
- 4小时后，转染，仔细更换介质在培养皿中，用4毫升预热D10。
- 自旋感染 ：在转染后48小时，收获SVGmu编码，在上清液中的逆转录病毒颗粒的上清液通过0.45μm的过滤器通过。 GPR包装板在24孔板中的细胞在2×10 4个细胞/孔。添加过滤上清液GPR包装细胞中的菜（2毫升/孔），离心细胞90分钟，以1050×g，25℃下更改介质到新鲜的D10与强力霉素（1纳克/毫升）后旋感染（2毫升/）。
- 转染后72小时，扩大文化转D10用强力霉素（1纳克/毫升）和嘌呤（2毫微克/毫升）包装细胞。
- 要确认SVGmu，培养细胞的表达没有强力霉素48小时。测量表面前的SVGmu PRESSION流式细胞仪，使用抗辛德毕斯血清。这些细胞被指定为GPRS包装细胞系。
2。构建DC LV生产者细胞连环阵转
慢病毒转移质粒TL20-GFP的是一个自失活慢病毒转移载体质粒基于pCL20c MSCV-GFP一个霉素调节的病毒RNA基因组的表达系统和巨细胞病毒（CMV）的增强子与7 四面体运营商（ 图1C）11更换，12,15。质粒PGK-BLE是一种抗博莱霉素（BLE）盒式磁带驱动由弱PGK启动子2。
- 月刊20微克质粒TL20 SFII GFP用限制性内切酶在50℃下精华20微克质粒PGK-BLE PflMI位在37°C。
- 通过琼脂糖凝胶电泳纯化DNA片段（PGK表盒1011 bp和矢量TL20-GFP为6861碱基对）。
- 结扎TL20-GFP载体和PGK-表盒（NEB的T4 DNA连接酶）的摩尔比为25:1。在室温下孵育过夜。
- 隔夜后结扎，纯化DNA连接混合物（Qiagen公司的DNeasy血液和组织工具包）。确保纯化的DNA的量为约5微克。
- 转染前16-18小时，板GPRS包装细胞在6厘米的组织培养皿中，使得将约90％汇合的转染时。
- 使用在步骤1.2中所述的纯化的concatemeric DNA转染5微克到GPRS包装细胞在6厘米的组织培养皿中的磷酸钙转染方法。 4小时后，转染，小心取出介质，并更换有4毫升预热D10采用强力霉素（1纳克/毫升）。
- 转染后48小时，更改到D10中的介质与多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）。吉欧霉素（50微克/毫升）在培养基中加入转染克隆的选择。培养细胞约2周，直到细胞科洛尼ES可以看出底部的菜肴。
- 标记的细胞集落，在底部的菜肴。径24孔组织培养皿中，数量的孔，并加至各孔中的2毫升D10含有Zeocin的（50微克/毫升），多西环素（1毫微克/毫升），嘌呤霉素（2微克/毫升）。吸媒介转染细胞，然后添加一个胰蛋白酶下降到不到一分钟，每个殖民地。然后，添加一个或多个下降的D10相同的菌落。拿起菌落逐个用吸管，并将它们传送到单独的井24孔细胞培养板。
- 文化和扩大D10含有Zeocin的（50微克/毫升），多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）中的所有细胞克隆的病毒产生能力的评价。
3。评估病毒生产的每一个细胞克隆
- 胰蛋白酶消化的生产者细胞和板周围4×10 6 6-D10厘米的组织培养皿中的细胞在没有强力霉素等汇合超过90％。每天用新鲜预热D10更换介质和收集介质滴度检测72小时，取出后DOX。
- 收获的病毒上清用0.45微米的过滤器通过过滤介质。
- 板靶细胞表达DC-SIGN受体（ 如 293T.hDC-SIGN或小鼠骨髓来源的树突状细胞的16）和293T细胞作为阴性对照，在96孔培养皿中，1×10 4个细胞/孔。 2倍系列稀释的病毒上清添加到各孔中（100μl/孔）。 ，6-8的稀释度一般足以达到在其中转导的GFP阳性细胞是在添加的病毒量成线性关系的范围内。
- 离心细胞，更换介质，在步骤1.4中所述。 DC培养上清应培养在RPMI培养基中含10％FBS和GM-CSF（1:20 J558L条件培养基）。
- 测量GFP表达的转染细胞，通过流式细胞仪检测转导后4-6天。慢病毒的VECTO的ŗ滴度计算向量中的稀释范围内时，GFP阳性细胞的百分比和矢量量的线性关系。具有最高的病毒生产用于后续的应用中选择的细胞克隆。
4。生产和集中慢病毒载体
- 文化生产者细胞系（LV-mGFP的），在15厘米的组织培养皿。
- 胰蛋白酶消化的的生产者细胞和板细胞在15厘米的组织培养皿中，在大于90％汇合在多西环素的新鲜D10无。更改介质每日新鲜的，预先加热D10。
- 峰值病毒生产（由用户确定）的时间，收获病毒上清，用0.45微米的过滤器过滤。装入过滤上清液成厚壁32.5毫升超速离心管，封口的封口膜和离心机以50,000 xg，4°C，90分钟。彻底将沉淀重悬于50μl或适当体积的PBS或HBSS中，根据不同的应用。</ LI>
5。免疫小鼠体内，并分析抗原特异性免疫反应
- 第4节所述产生高滴度的病毒。
- 通过载体悬浮（25微升每脚垫）脚垫路由注入BALB / c小鼠（6-8周龄，女）。
- 免疫后2周，隔离健脾和收获脾。培养脾细胞用GFP的表位肽和分析GFP特异的CD8 + T细胞，使用细胞内细胞因子染色的存在下，如前面所述17（ 图3B）。
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Representative Results
在该方法中所述的稳定的细胞系，可以专门针对树突状细胞的慢病毒载体，大批量地生产。 图1B中所示，分离单个克隆，得到的稳定细胞株的不同的质量12。在测试的26个克隆中，有8产生的慢病毒颗粒滴度大于10 6转导单位每毫升（TU /毫升），这是一个典型的为SVG的假型化慢病毒载体瞬时转染产生的基准。在同一时间，几个克隆产生小于10 4 TU /毫升，隔离是很重要的，以便获得一个强大的生产者的多个克隆。
一个克隆可靠地产生大于10 7 TU / ml的滴度的慢病毒载体。进一步的测试表明，该克隆的病毒生产这种级别的稳定多天，没有受到存在/不存在于培养基中的血清，和chievable在细胞培养3个月以上（ 图2）12。
，以确认这些病毒在体外不仅是有效的，它们也被用来免疫小鼠。的绿色荧光蛋白的特异性免疫反应的细胞内细胞因子染色分析发现，稳定地生产的DC-LV刺激GFP特异的CD8 + T细胞的扩大近4％，所有的CD8 +脾细胞（ 图3）12。
图1。代数四环素调控的慢病毒载体生产细胞（A）的管脚轮廓的程序，使直流定位的慢病毒载体的生产者细胞，包括逆转录病毒载体转导的与玻璃纤维的线续恒常SVGmu的包膜基因的感兴趣的基因（病毒载体）由concatemeric转染，转染（B）的 Zeocin的处理所选择的单克隆扩大1〜3周，后3天去除病毒上清的滴度测定强力霉素。如图所示，病毒滴度相差很大克隆（C）的质粒图。病毒载体质粒，TL20-GFP，编码绿色荧光蛋白的鼠干细胞病毒启动子和四环素阻遏的启动子的控制下，载体基因组的控制下。 PGK-BLE编码吉欧霉素抗性基因（SH BLE）下构磷酸激酶1基因启动子（PGK）。复古SVGmu包含SVGmu的糖蛋白的P下紧 TET敏感元件。 点击这里查看大图 。
图2。病毒载体的生产特征（A）除去，注明原因后，培养物上清液的病毒载体滴度，测定各天7天。病毒生产高峰在48 - 72小时后感应。在无血清培养基中培养的细胞产生的含10％FBS培养的那些几乎一样多的病毒（B）生产超过3个月的细胞培养和病毒生产的等分试样进行定期测试。观察到病毒生产无显着损失。
图3。稳定的直流定位的细胞系所产生的慢病毒载体可以选择性地在体外转导区议会和在体内产生免疫反应。>（A）LV-GFP和GFP的表达用流式细胞仪检测小鼠骨髓来源的树突状细胞感染。特定的CD11c +细胞，其中包括树突状细胞的GFP的表达（B）对小鼠进行免疫2×10 7 TU的纯化并浓缩LV-GFP。两个星期后，近4％，所有的CD8 + T细胞被激活，并表示IFNγ在GFP主导肽的介绍。
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Discussion
在这里，我们已经提出了一个方法生产大量使用慢病毒载体293T细胞稳定转关监管制度下TET所有慢病毒组件。至目前为止，大多数协议产生慢病毒载体依赖于标准的磷酸钙瞬时转染（见18）。这种方法已成功地在一个临床范围，但它可能遭受的一些限制，不太可能是存在于扩大生产的稳定细胞株。例如，与大量的LV质粒的共转染理论上可以增加复制能力的慢病毒19的发展机会。此外，瞬时转染更有可能产生不同的结果进行了大规模的比利用稳定生产线，由于大量的DNA所需投入12。在适当条件下，例如生产者线已被用来产生其他的γ-复古在大尺度上的病毒载体20,21。然而，利用慢病毒生产者线的研究是有限的，从而包含的鲁棒检测22检测到有复制能力的慢病毒在开发任何临床使用的细胞系将是至关重要的。
其他团体纷纷发表慢病毒产生稳定的细胞株6-11,23描述。然而，这些报告的一个共同的限制，其中许多人依靠转导细胞的慢病毒载体基因编码的兴趣，这可能会降低其临床使用的安全生产者。这里，我们利用concatemeric的阵列转染法11转导的细胞，它可以产生自我失活的慢病毒。此外，我们使用的TET关闭系统，提高临床使用方法的适用性。这个制度在细胞培养过程中的维护和防止毒性SVGmu允许下收集慢病毒载体抗生素IC-条件。
重要的是，在实验过程中，实验室工作人员时，使用适当的预防措施，处理的慢病毒载体。慢病毒载体均来自HIV-1，人类的病原体，机构生物安全委员会的指导下，所有程序都必须执行。据美国国立卫生研究院，BL2遏制一般适合工作与先进的慢病毒表达系统，如这里描述，增强BL2遏制虽然可能会表示，如果实验的比例高达24临床实践。
有几个关键步骤的过程中，需要特别照顾的。首先，细胞培养必须非常注重细节。我们已经发现，病毒滴度显着下降，如果生产细胞传代，每24个小时。同样，一些地段的FBS可能导致病毒生产的显着下降，所以重要的是要测试多个批次FBS BEF矿扩大了一个实验。可以制作高病毒滴度的克隆的选择是至关重要的下游应用。在以前的工作与25中 ，我们已发现，克隆出现分裂得更快，往往会产生更多的病毒。一旦已经发现高滴度的克隆，这些细胞被等分并冻结在FBS + 10％DMSO的尽快。然后，用新鲜解冻的等分试样，可以产生可能的最高滴度。按照这个法则，我们有最成功的生产通过瞬时转染病毒，我们预计类似的细胞线维修将有利于稳定产病毒细胞。
此方法的主要限制是，它要求了前面的努力，以产生稳定的生产线的一个显着量的。因此，这是不太可能在多种类型的慢病毒载体将被测试的情况下是适当的。瞬时转染成分股可能会更方便E型的应用。我们普遍预计用这种方法来产生大量的病毒载体后的载体已经在小格式测试。我们的特定的细胞系的另一个限制是所产生的GPRS小区的载体将只表达DC-SIGN，因为包膜蛋白，SVGmu这种受体结合具体的。要针对其他细胞受体，该程序可以修改成原来的GPR细胞系通过引入其他糖蛋白的质粒。同样，其他感兴趣的基因可以转成生产细胞株，使慢病毒载体能够提供更相关的蛋白质比GFP。
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Acknowledgments
笔者想承认迈克尔·周，戴冰冰，梁萧此稿件提供数据。我们也承认约翰·格雷博士在这项研究中所使用的试剂厚礼。 PB是由国立癌症中心博士后奖学金支持。这项研究是由来自美国国立卫生研究院（R01AI68978 P01CA132681 RCA170820A），比尔和梅林达·盖茨基金会，平移加速转化医学联合中心和加州艾滋病毒/艾滋病的资助赠款的资助拨款研究计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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