Summary
Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.
Abstract
Lentiviralen Vektoren (LVs) sind ein mächtiges Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material, viele Arten von Zellen. Wegen Sicherheitsbedenken mit diesen HIV-1 abgeleiteten Vektoren verbunden sind, große Mengen von LVs ist eine Herausforderung. In diesem Beitrag berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung hohe Titer von Selbst-inaktivierende LVs. Wir retroviral transduzieren das tet-off stabilen Erzeuger-Zellinie GPR eine Zelllinie, GPRS, die alle viralen Komponenten, einschließlich einer dendritische Zellen spezifische Glykoprotein SVGmu Ausdruck erzeugen kann. Dann verwenden wir konkatemeren DNA Transfektion zur Transfektion der LV Transferplasmid Codierung ein Reportergen GFP in Kombination mit einem Selektionsmarker. Einige der resultierenden Klone können LV mit einem Titer 10-fach größer als das, was mit der transienten Transfektion erreichen erzeugen. Außerdem diese Viren effizient transduzieren dendritischen Zellen in vitro und erzeugen eine starke T-Zell-Immunantwort zu unserem Reporter-Antigen. Diese Methode kann eine gute Option sein, for Herstellung starke LV-basierte Impfstoffe für klinische Studien von Krebs oder Infektionskrankheiten.
Introduction
Viele Vektor-Systeme für den Gentransfer entwickelt worden. Vektoren auf Basis von Lentiviren haben unter den am häufigsten untersuchten viralen System gewesen. Diese Vektoren sind vorteilhaft, weil sie effizient Transduktion sowohl sich teilende und nicht teilende Zellen 1, eine langfristige Expression durch die Integration in das Wirtsgenom, weisen eine geringe natürliche Anti-Vektor-Immunität in den meisten menschlichen Populationen 2 und haben ein geringes Potenzial für Genotoxizität von Insertionsmutagenese 3,4.
Produktion von Lentiviren wurde stets von Sicherheitsbedenken wurde gefärbt. Lentivirale Vektoren sind in der Regel von HIV-1, dem Erreger von AIDS abgeleitet. Die transiente Transfektion von einzelnen Komponenten des lentivector (Transfer, Umschlag und Verpackung Plasmide) ist eine häufige und flexible Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material in Labor-Einstellungen. Allerdings ist Scaling-up transienten Transfektionen für klinische Anwendungen schwerfällig und may für die Entwicklung von Replikations-kompetente lentivirus 5,6 führen. Um diese Hürden zu überwinden, wurden mehrere stabile Verpackung und Produzent Zelllinien 6-11 entwickelt. Eine dieser Linien, die GPR Verpackungslinie 11, hat den Vorteil, dass sie attraktiv durch Tetracyclin reguliert. In diesem Beitrag zeigen wir, wie man dieses System anzupassen, um selbst-inaktivierenden lentiviralen Vektoren, die speziell auf dendritische Zellen (DC-LVs) 12 sind gezielt zu erzeugen.
Dendritische Zellen (DCs) sind die robust Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Sie haben das Thema von großem Interesse in der Krebs-Impfstoff-Entwicklung, weil sie direkt initiieren, Programm und regulieren Tumor-spezifische Immunantworten 13. Die Aufnahme einer Impfung Protokoll gehören DCs hat das Potenzial, eine stärkere Immunantwort als Antitumor-Peptid oder DNA-Impfstoffe zu entlocken. Vor kurzem haben wir einen lentiviralen Vektor entwickelt, specifically zielt dendritischen Zellen durch eine modifizierte Sindbisvirus Glykoprotein, SVGmu 14. Diese Vektoren sind einzigartig, weil sie eine hohe Spezifität für dendritische Zellen zeigen und erzeugen stärkere Immunantwort als unspezifische, VSVg-pseudotypisierten Vektoren.
Hier berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen dieser DC-bezogene lentiviralen Vektoren. Wir zeigen, dass diese DC-LVs können DCs infizieren und erzeugen starke CD8 + T-Zell-Immunantwort. Alle Verfahren, die Tiere wurden artgerecht, unter Zustimmung des USC Intitutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. Um in vivo und klinische Versuche durchzuführen, ist es wichtig, eine Zelllinie, die Viren mit einer hohen Titer produzieren zu erstellen. Die Durchführung der Transduktion und Transfektion Schritte genau wie beschrieben maximiert die Chancen der Erzeugung eines solchen Klons.
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Protocol
DC-LV stabileres Zellen werden auf der Grundlage der GPR Verpackungs-Zelllinie 11, die die notwendigen Komponenten lentiviralen GagPol, rev und das Tet-Off-System enthält konstruiert. Zuerst wird retrovirale Transduktion verwendet, um eine GPRS Verpackungs-Zelllinie, die eine tet-abhängigen SVGmu Glykoprotein kodiert erzeugen. Dann wird Konkatemers Array Transfektion verwendet, um das GPRS-Zelllinie mit einem lentiviralen Vektor Transgen wie GFP transfiziert. Diese stabilen Erzeuger-Zellinie, wie LV-mGFP bezeichnet, können in vitro und in vivo auf ihre Fähigkeit, eine DC-LV Impfstoff gegen GFP erzeugen getestet werden.
1. Generieren eines Tet-abhängigen SVGmu Zelllinie
Plasmid PRX-SVGmu ist ein Konstrukt, in dem DC-spezifische Glykoprotein SVGmu stromabwärts des tTA-advanced-Promotor von retroviralen Plasmid pRetroX-Tet-off 1 (Abbildung 1C) geklont. Kultur 293T-Zellen in D10 (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin). Kultur GPR Verpackungs-Zelllinie in D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml). Alle Zellen werden in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 kultiviert.
- 16-18 Std. vor transienten Transfektion Platte 2 × 10 6 293T-Zellen in 4 ml D10 in einer 6-cm Zellkulturschalen so dass die Zellen 90% Konfluenz nähern zum Zeitpunkt der Transfektion.
- Transfektion von retroviralen Plasmide: mix 100 ul 1,25 M CaCl 2-Lösung, steril Milli-Q-Wasser und die folgenden Plasmide: 5 ug PRX-SVGmu, 2,5 ug pgag-Pol, 2,5 ug pVSV-G. Das Endvolumen beträgt 500 ul. Zu einem 5 ml Polystyrol mit rundem Boden Rohr, 500 ul 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCl, 12 mM Dextrose, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). In das Plasmid Mischung tropfenweise in die 2X HBS-Puffer während sprudelnden den Puffer kräftig mit einem Glas Pasteur Pipette. Nach dem Hinzufügen der mixture weiterhin sprudeln für weitere 30 sec. Dann fügen Sie die gesamte Mischung auf die 293T-Zellen in 6-cm Kulturschale und Inkubation bei 37 ° C
- 4 Stunden nach der Transfektion sorgfältig ersetzen das Medium in der Kulturschale mit 4 ml vorgewärmten D10.
- Spin-Infektion: 48 Stunden nach der Transfektion Ernte SVGmu kodierende retrovirale Partikel im Überstand, indem der Überstand durch ein 0,45-um-Filter. Teller die GPR Verpackung Zellen in einer 24-Well-Platte mit 2 x 10 4 Zellen / well. In abfiltrierten Überstands GPR Verpackungszellen in der Schale (2 ml / Vertiefung) und Zentrifuge Zellen für 90 min bei 1050 × g und 25 ° C. Ändern Medium in frischen D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) nach Spin-Infektion (2 ml / well).
- 72 Stunden nach der Transfektion, erweitern Sie die Kultur der transduzierten Zellen in Verpackungen D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 ng / ml).
- Um die Expression von SVGmu, Kultur die Zellen ohne Doxycyclin für 48 Stunden bestätigen. Messen Oberfläche expression von SVGmu mit Durchflusszytometrie unter Verwendung anti-Sindbis Serum. Diese Zellen werden als GPRS Verpackungs-Zelllinie bezeichnet.
2. Construct DC-LV Producer-Zellen durch Transfektion Concatemer Array
Lentivirale Transferplasmid TL20-GFP ist ein selbst-inaktivierenden lentiviralen Transfer Vektorplasmid basierend auf pCL20c-MSCV-GFP mit einer Dox-regulierbaren virale RNA-Genom Ausdruck und Austausch des Cytomegalovirus (CMV)-Enhancer mit 7 tet-Operatoren (1C) 11 , 12,15. Plasmid PGK-ble ist ein beständig Bleomycin (BLE) Kassette durch eine schwache PGK-Promotor 2 angetrieben.
- Digest 20 ug Plasmid TL20-GFP mit dem Restriktionsenzym SfiI bei 50 ° C Digest 20 ug Plasmid PGK-ble mit PflMI bei 37 ° C
- Reinigen der DNA-Fragmente (die PGK-ble Kassette ist 1011 bp und der Vektor TL20-GFP ist 6861 bp) durch Agarosegelelektrophorese.
- Ligieren die TL20-GFP-Vektor und PGK-BLE Kassette in einem Molverhältnis von 25:1 (NEB T4 DNA Ligase). Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
- Nachdem über Nacht Ligation reinigen DNA aus dem Ligationsansatz (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Sicherstellen, dass die Menge des gereinigten DNA ist etwa 5 ug.
- 16-18 Stunden vor der Transfektion Platte GPRS Verpackungszellen in einer 6-cm Zellkulturschalen, dass die Konfluenz werden etwa 90% zum Zeitpunkt der Transfektion.
- Verwendung der Calciumphosphat-Transfektion Verfahren in Schritt 1.2 bis 5 ug des gereinigten konkatemeren DNA in die Verpackungszellen GPRS in 6-cm Zellkulturschalen zu transfizieren. 4 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie vorsichtig das Medium und ersetzen mit 4 ml vorgewärmten D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml).
- 48 Stunden nach der Transfektion ändern das Medium in D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml). Wählen Sie für transfizierte Klone durch Zugabe von Zeocin (50 ug / ml) in dem Kulturmedium. Kultur die Zellen für ca. 2 Wochen bis Zelle colonies können an der Unterseite des Geschirrs zu sehen.
- Beschriften Sie die Zelle Kolonien an der Unterseite des Geschirrs. Nehmen Sie 24-well Zellkulturschalen, die Anzahl der Brunnen, und fügen Sie in jede Vertiefung 2 ml D10 mit Zeocin (50 ug / ml), Doxycyclin (1 ng / ml), und Puromycin (2 pg / ml). Saugen Sie das Medium der transduzierten Zellen, dann einen Tropfen Trypsin auf jede der Kolonien für weniger als eine Minute. Dann fügen Sie eine oder mehrere Tropfen D10 auf den gleichen Kolonien. Pick up Kolonien eine nach der anderen mit einer Pipette und übertragen Sie sie in separate Vertiefungen der 24-Well-Platte Gewebekulturen.
- Kultur und erweitere alle Zellklone in D10 mit Zeocin (50 ug / ml), Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml) für die Bewertung der viralen Fähigkeit zur Produktion.
3. Bewerten Viral Produktion jeder Zelle Clone
- Trypsinize die Produzenten-Zellen und Platte um 4x10 6 Zellen in 6-cm Gewebekulturschale in D10 ohne Doxycyclin, so dass die Konfluenz90% übersteigt. Ersetzen Sie das Medium durch frisches vorgewärmte D10 täglich zu sammeln und das Medium für den Titer-Test 72 Stunden nach dem Entfernen dox.
- Ernte der viralen Überstand durch Filtration des Mediums mit einem 0,45-um-Filter.
- Teller Zielzellen exprimieren den Rezeptor DC-SIGN (zB 293T.hDC-SIGN oder Knochenmark der Maus abgeleitet dendritischen Zellen 16) und 293T als negative Kontrolle in 96-Well-Kulturschalen, 1 x 10 4 Zellen / well. In 2-fach serielle Verdünnungen des viralen Überstand in die Vertiefungen (100 ul / well). Üblicherweise werden 6-8 Verdünnungen ausreicht, um den Bereich, in dem GFP-positiven Zellen in einer linearen Beziehung zu der Menge an Virus hinzugefügt transduziert erreichen.
- Zentrifuge Zellen und ersetzen Sie das Medium wie in Schritt 1.4 beschrieben. BMDCs sollte in RPMI-Medium mit 10% FBS und GM-CSF (1:20 J558L konditioniertes Medium) kultiviert werden.
- Messen Sie die GFP-Expression in Zellen mittels Durchflusszytometrie 4-6 Tage nach der Transduktion transduzierten. Lentivirales vector-Titer in den Vektor Verdünnungsbereich berechnet, wenn der Prozentsatz von GFP-positiven Zellen und Vektor Betrag in einer linearen Beziehung stehen. Wählen Sie die Zell-Klon mit der höchsten Produktion viraler für spätere Anwendungen.
4. Produzieren und Konzentrat Lentivirusvektoren
- Kultur der Produzent Zelllinie (LV-mGFP) in 15-cm-Zellkulturschalen.
- Trypsinize die Produzenten-Zellen und Zellen Platte in 15-cm-Zellkulturschalen bei mehr als 90% Konfluenz in frischen D10 ohne Doxycyclin. Ändern Medium mit frischem, vorgewärmten D10 täglich.
- Zum Zeitpunkt des Peak virale Produktion (vom Anwender bestimmt), ernten die virale Überstand und filtern es mit einem 0,45-um-Filter. Laden Sie die gefilterten Überstand in dickwandigen 32,5 ml Ultrazentrifugenröhrchen, mit Parafilm versiegeln und Zentrifuge bei 50.000 xg, 4 ° C für 90 min. Gründlich das Pellet in 50 ul oder einem geeigneten Volumen PBS oder HBSS abhängig von der Anwendung. </ Li>
5. Impfen Mäuse in vivo und Analysieren Antigen-spezifische Immunantwort
- Produzieren mit hohem Titer-Virus, wie in Kapitel 4 beschrieben.
- Spritzen BALB / c-Mäuse (6-8 Wochen alt, weiblich) über einen Wegelagerer Route mit dem Vektor Suspension (25 ul pro Fußballen).
- 2 Wochen nach der Immunisierung isolieren Milz und Ernte Splenozyten. Kultur Splenozyten mit GFP-Epitop-Peptide und Analyse der Gegenwart von GFP-spezifische CD8 + T-Zellen mit intrazellulärem Zytokinfärbung, wie zuvor 17 (3B) beschrieben.
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Representative Results
Die stabile Zelllinie in diesem Verfahren beschriebenen können große Mengen von lentiviralen Vektoren, die spezifisch an dendritischen Zellen ausgerichtet sind. Wie in 1B gezeigt, ergab Isolierung einzelner Klone stabiler Zelllinien unterschiedlicher Qualität 12. Unter 26 getesteten Klonen erzeugt 8 lentivirale Partikel mit einem Titer von mehr als 10 6 Transduktion Einheiten pro ml (TU / ml), die ein typisches Benchmark für SVG-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren durch transiente Transfektion hergestellt ist. Zur gleichen Zeit erzeugt mehrere Klone weniger als 10 4 TU / ml, es ist wichtig, mehrere Klone zu isolieren, um einen starken Produzenten zu erhalten.
Ein Klon zuverlässig lentiviralen Vektoren mit einem Titer von mehr als 10 7 TU / ml hergestellt. Weitere Versuche an dieses Klons zeigte, dass das Niveau der viralen Produktion stabil für mehrere Tage, durch die Anwesenheit / Abwesenheit von Serum im Kulturmedium, und warchievable in Zellen, die für mehr als 3 Monate (Abbildung 2) 12 kultiviert.
Um zu bestätigen, dass diese Viren waren nicht nur wirksam in vitro, wurden sie auch verwendet werden, um Mäuse zu immunisieren. Analyse der GFP-spezifische Immunantwort durch intrazelluläre Zytokinfärbung gefunden, die stabil hergestellten DC-LV könnte die Expansion GFP-spezifische CD8 + T-Zellen fast 4% der CD8 + Splenozyten (3) 12 zu stimulieren.
Abbildung 1. Generierung von Tetracyclin-regulierten Lentivirusvektor Produzentenzellen. (A) Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von DC-bezogene Lentivirusvektor Produzent Zellen, einschließlich Transduktion von GRP Linien mit einem retroviralen Vektor containing die SVGmu Hüllgen und Transfektion des Gens von Interesse (viraler Vektor) durch konkatemeren Transfektion. (B) einzelne Klone von Zeocin Behandlung ausgewählt wurden 1-2 Wochen expandiert und der Titer des viralen Überstand wurde 3 Tage nach Entfernung gemessen von Doxycyclin. Wie gezeigt, variiert virale Titer weit von Klon. (C) Plasmid Karten. Der virale Vektor Plasmid, TL20-GFP, green fluorescent protein codiert, unter der Kontrolle eines Maus-Stammzellen-Virus-Promotor und der Vektor-Genom unter Kontrolle eines Tetracyclin-reprimierbare Promotor. PGK-ble codiert die Zeocinresistenzgen (Sh ble) unter der konstitutiven Phosphoglyceratkinase 1-Promotor (PGK). Retro-SVGmu enthält die SVGmu Glykoprotein unter dem P fest tet responsive element. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Merkmale von viraler Vektor-Produktion. (A) Nach dem Entfernen von DOX wurde der virale Vektor-Titer von Kulturüberständen gemessen jeden Tag für 7 Tage. 72 Stunden nach der Induktion - Virus-Produktion zwischen 48 ihren Höhepunkt. Zellen in serumfreien Medien kultiviert erzeugt annähernd so viel Virus als solche mit 10% FBS kultiviert. (B) Producer-Zellen wurden über 3 Monate kultiviert und Aliquote wurden periodisch für die Virusproduktion getestet. Keine signifikanten Verlust der Virusproduktion beobachtet.
Abbildung 3. Lentivirale Vektoren durch stabile DC-bezogene Zellinien selektiv transduzieren DCs in vitro und eine Immunreaktion in vivo. <strong> (A) Maus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen wurden mit LV-GFP und GFP-Expression wurde mit Durchflusszytometrie gemessen infiziert. GFP-Expression spezifisch war CD11c + Zellen, die dendritischen Zellen umfassen. (B) Mäuse mit 2 × 10 7 UE von gereinigtem und konzentriertem LV-GFP immunisiert wurden. Zwei Wochen später wurden fast 4% aller CD8 + T-Zellen aktiviert und IFN ausgedrückt in Reaktion auf die Präsentation des Peptids GFP dominant.
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Discussion
Hier haben wir ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von lentiviralen Vektoren mit 293T-Zellen, die stabil transduzierten mit allen lentiviralen Komponenten unter der tet off Regelungssystem beschrieben. Bisher stützen sich die meisten Protokolle lentiviralen Vektoren zu erzeugen auf Standard-Calciumphosphat transiente Transfektion (siehe 18, beispielsweise). Dieser Ansatz ist erfolgreich auf einem klinischen Maßstab, aber es kann von einigen Einschränkungen nicht vorhanden sein können bei der Ausweitung Herstellung von stabilen Zelllinien leiden. Zum Beispiel könnte Kotransfektion mit großen Mengen von LV Plasmide theoretisch die Chance erhöhen, für die Entwicklung von Replikations-kompetenten lentivirus 19. Darüber hinaus sind transienten Transfektionen eher variable Ergebnisse auf einem großen Maßstab zu produzieren als die Verwendung einer stabilen Produzent Linie aufgrund der großen Mengen an DNA-Eingänge erforderlich 12. Unter den richtigen Bedingungen haben wie Produzent Linien verwendet worden, um andere zu generieren γ-retroviralen Vektoren auf großen Skalen 20,21. Allerdings sind Studien mit lentiviralen Produzent Zeilen beschränkt und damit die Einbeziehung der robuste Assays 22 bis replikationskompetenten lentivirus erkennen wird entscheidend sein bei der Entwicklung jede Zelllinie für den klinischen Einsatz.
Andere Gruppen haben Beschreibungen für lentivirus produzierenden stabilen Zelllinien 6-11,23 veröffentlicht. Allerdings ist eine gemeinsame Begrenzung dieser berichtet, dass viele von ihnen auf Transduzieren der Produzenten-Zellen mit lentiviralen Vektoren, die das Gen von Interesse, was ihre Sicherheit für den klinischen Gebrauch zu verringern verlassen. Hier nutzen wir die konkatemeren Array Transfektionsmethode 11 Zellen, die Selbst-inaktivierende lentivirus produzieren kann Transduktion. Darüber hinaus verbessert unsere Nutzung der Tet off-System der Methode Eignung für die klinische Anwendung. Dieses Regelungssystem verhindert Toxizität von SVGmu während der Zellkultur Wartung und ermöglicht die Sammlung von lentiviralen Vektoren, die unter Antibiotic-freien Bedingungen.
Während des Verfahrens, ist es wichtig, dass Laboranten entsprechende Vorsichtsmaßnahmen anwenden beim Umgang mit den lentiviralen Vektoren. Lentiviralen Vektoren von HIV-1, ein humanes Pathogen abgeleitet und alle Verfahren sollte unter der Leitung eines Instituts Biosicherheit Ausschuss durchgeführt werden. Nach der NIH ist BL2 Containment im Allgemeinen angemessen für die Arbeit mit fortgeschrittenen lentiviralen Systemen wie dem hier beschriebenen, obwohl verbesserte BL2 Containment kann angezeigt, wenn Experimente up für die klinische Praxis 24 skaliert werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in dem Verfahren, die besondere Sorgfalt erfordern. Zunächst müssen Zellkultur mit viel Liebe zum Detail durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass Virustiter merklich zurückgehen, wenn Produzentenzellen nicht alle 24 Stunden passagiert werden. Ebenso können einige viel FBS zu deutlichen Rückgängen in Virus-Produktion führen, so ist es wichtig, mehrere Lose FBS bef testenErz Skalierung ein Experiment. Die Auswahl eines Klons, der hohe Virustiter erzeugen kann, ist wesentlich für Downstream-Anwendungen. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten 25 haben wir gefunden, dass die Klone, die sich schneller trennen scheinen mehr Virus produzieren neigen. Sobald ein High-Titer-Klon gefunden wurde, sollte diese Zellen aliquotiert und eingefroren werden FBS + 10% DMSO so schnell wie möglich. Dann, mit frisch aufgetauten Aliquots hilft, den höchsten Titer möglich zu generieren. Durch Anschluss an diese Faustregel, hatten wir den meisten Erfolg Herstellung Virus durch transiente Transfektionen, und wir erwarten, dass ähnliche Zelllinie Wartung stabile Virus-produzierenden Zellen profitieren.
Diese Methode der große Einschränkung ist, dass es eine erhebliche Menge an Aufwand im Vorfeld, um eine stabile Produzent Linie erzeugen erfordert. Somit ist es nicht wahrscheinlich, dass in Situationen, in denen unterschiedliche Arten von lentiviralen Vektoren getestet werden angemessen. Transienten Transfektionen kann bequemer für these Arten von Anwendungen. Wir sehen meistens mit dieser Methode, um große Mengen der viralen Vektor zu erzeugen, nachdem die Videos bereits in einem kleinen Format getestet. Eine weitere Einschränkung unserer spezifischen Zelllinie ist, dass die Vektoren von den GPRS-Zellen produziert wird nur spezifisch für Zellen, DC-SIGN, weil das Hüllprotein, SVGmu bindet an diesen Rezeptor. Um andere zelluläre Rezeptoren abzielen, kann das Verfahren durch die Einführung von anderen Glykoprotein-Plasmide in die ursprüngliche GPR Zelllinie modifiziert werden. In ähnlicher Weise können andere Gene von Interesse in die Produzenten-Zelllinien transfiziert werden, so dass lentivirale Vektoren können weitere relevante Proteine als GFP liefern.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Michael Chou, Bingbing Dai, und Liang Xiao für einen Beitrag für diese Handschrift erkennen. Wir erkennen auch Dr. John Gray für die großzügigen Gaben der Reagenzien in dieser Studie verwendet. PB wird durch ein Postdoc-Stipendium von der National Cancer Center unterstützt. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 und RCA170820A), einen Zuschuss von der Bill and Melinda Gates Foundation, eine translatorische Beschleunigung Zuschuss aus dem Joint Center for Translational Medicine und einen Zuschuss von der California HIV / AIDS unterstützt Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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