Summary
Her bruger vi retroviral transduktion og concatemeric transfektion til at skabe en cellelinie, der kan udtrykke komponenterne i en lentivirusvektor (LV) i fravær af tetracyclin. Dette LV koder GFP og pseudotype med et glycoprotein, SVGmu, som er specifik for en receptor på dendritiske celler.
Abstract
Lentivirusvektorer (LVS), er et effektivt middel til at levere genetisk materiale til mange typer af celler. På grund af sikkerhedsmæssige bekymringer forbundet med disse HIV-1 afledte vektorer, der producerer store mængder af LVS er udfordrende. I dette papir, rapporterer vi en metode til fremstilling høje titre af selv-inaktiverende LVS. Vi retroviralt transducere tet-off stabil producent-cellelinje GPR at generere en cellelinie, GPRS, som kan udtrykke alle de virale komponenter, herunder en dendritisk celle-specifik glycoprotein SVGmu. Så vi bruger concatemeric DNA-transfektion til transfektion LV transferplasmidet koder et reportergen GFP i kombination med en selekterbar markør. Flere af de resulterende kloner kan producere LV på en titer 10 gange større end hvad vi opnår med transient transfektion. Plus, disse vira effektivt transducere dendritiske celler in vitro og generere en stærk T-celle immunrespons til vores reporter antigen. Denne metode kan være en god mulighed for producerer stærke LV-baserede vacciner til kliniske studier af kræft eller infektionssygdomme.
Introduction
Mange vektorsystemer er blevet udviklet til genlevering. Vektorer baseret på lentivira har været blandt de mest almindeligt undersøgte viral system. Disse vektorer er fordelagtige, fordi de effektivt kan transducere både dividere og ikke-delende celler 1, opnå langsigtet udtryk grundet integration i værtsgenomet, udvise lav naturlige anti-vektor immunitet i de fleste menneskelige befolkninger 2, og har et lavt potentiale for genotoksicitet fra insertionsmutagenese 3,4.
Produktion af lentivira har altid været farvet af sikkerhedsmæssige bekymringer. Lentivirusvektorer er generelt afledt fra HIV-1, det ætiologiske agens for AIDS. Transient transfektion af enkelte komponenter i lentivector (overførsel, konvolutten, og emballage plasmider) er et almindeligt og fleksibelt middel til levering af genetisk materiale i laboratoriet indstillinger. Men opskalering forbigående transfektioner til kliniske anvendelser er tung og may føre til udvikling af replikationskompetent lentivirus 5,6. For at overvinde disse forhindringer har flere stabile emballage og producerende cellelinier blevet udviklet 6-11. En af disse linjer, GPR pakkelinie 11, har den attraktive fordel reguleres af tetracyclin. I dette papir, viser vi, hvordan du tilpasse dette system til at producere selv inaktiveringsbetingelser lentivirusvektorer, der er specifikt målrettet mod dendritiske celler (DC-LVS) 12.
Dendritiske celler (DC'er) er de mest robuste antigenpræsenterende celler i immunsystemet. De har været genstand for stor interesse i cancer-vaccine udvikling, fordi de er direkte iværksætte, program og regulere tumor-specifikke immunreaktioner 13.. Omfatter en vaccinationsprotokol at omfatte DC'er har potentiale til at fremkalde en stærkere antitumor immunrespons end peptid-eller DNA vacciner. For nylig har vi udviklet et lentivirusvektor at specifically mål dendritiske celler gennem en modificeret Sindbis virus glycoprotein SVGmu 14.. Disse vektorer er unikke i, at de viser en høj specificitet til dendritiske celler og generere kraftigere immunrespons end uspecifik, VSVG-pseudotype vektorer.
Her rapporterer vi en metode til at producere store mængder af disse DC-målrettede lentivirusvektorer. Vi viser, at disse DC-LVS kan inficere DC'er og frembringer stærke CD8 + T-celle immunrespons. Alle procedurer, der involverer dyr blev udført humant, under godkendelsen af USC Intitutional Animal Care og brug Udvalg. For at udføre in vivo og kliniske forsøg, er det afgørende at skabe en cellelinie, som kan producere virus i en høj titer. Udførelse af transduktion og transfektion trin nøjagtigt som beskrevet, vil maksimere chancerne for at generere en sådan klon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC-LV stabile producerende celler er konstrueret baseret på GPR pakkecellelinie 11, der indeholder de nødvendige lentiviral komponenter gagpol, rev og tet-off system. Først retroviral transduktion bruges til at generere en GPRS pakkecellelinie der koder for et tet-afhængig SVGmu glycoprotein. Derefter er concatemer matrix transfektion anvendes til at transficere GPRS cellelinien med en lentivirusvektor transgen såsom GFP. Denne stabile producent-cellelinje, betegnet som LV-MGFP, kan testes in vitro og in vivo for sin evne til at producere en DC-LV vaccine mod GFP.
1.. Generering af en Tet-afhængig SVGmu cellelinie
Plasmid PRX-SVGmu er en konstruktion, hvor DC-specifik glycoprotein SVGmu klones nedstrøms for tTA-avancerede promotor retroviral plasmid pRetroX-Tet-off 1 (figur 1C). Kultur 293T celler i D10 (Dulbeccos modificerede Eagle-medium med10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin). Kultur GPR Pakkecellelinie i D10 med doxycyclin (1 ng / ml) og puromycin (2 ug / ml). Alle celler dyrkes i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- 16-18 timer før transient transfektion, plade 2 x 10 6 293T celler i 4 ml D10 i en 6-cm vævsdyrkningsskål sådan at cellerne nærmer 90% konfluens ved transfektion.
- Transfektion af retrovirale plasmider: mix 100 ul 1,25 M CaCl2 opløsning, steril Milli-Q-vand, og de følgende plasmider: 5 ug PRX-SVGmu, 2,5 ug pgag-Pol, 2,5 ug pVSV-G. Det endelige volumen er 500 pi. Til en 5 ml polystyren rundbundet rør, 500 pi 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCI, 12 mM dextrose, 280 mM NaCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7.05) tilsættes. Tilsæt plasmidet blandingen dråbevis i 2X HBS buffer mens boblede bufferen kraftigt med en glas Pasteur-pipette. Efter tilsætning af mixture, fortsætte bobler i yderligere 30 sek. Derefter tilsættes hele blandingen onto 293T celler i 6-cm kultur fad, og der inkuberes ved 37 ° C.
- 4 timer efter transfektion erstatte forsigtigt mediet i kulturen skål med 4 ml forvarmet D10.
- Spin infektion: 48 timer efter transfektion, høst SVGmu-koder retrovirale partikler i supernatanten ved at lede supernatanten gennem et 0,45 um filter. Plade GPR emballage celler i en 24-brønds parabol på 2 x 10 4 celler / brønd. Tilføj filtrerede supernatant til GPR pakkeceller i skålen (2 ml / brønd) og centrifugeres celler i 90 minutter ved 1.050 xg og 25 ° C. Skift medium i frisk D10 med doxycyclin (1 ng / ml) efter centrifugering-infektion (2 ml / brønd).
- 72 timer efter transfektion, udvide kultur af transducerede pakkeceller i D10 med doxycyclin (1 ng / ml) og puromycin (2 ng / ml).
- For at bekræfte ekspressionen af SVGmu, kultur cellerne uden doxycyclin i 48 timer. Mål overflade extryk for SVGmu med flowcytometri hjælp af anti-Sindbis serum. Disse celler betegnes som GPRS pakkende cellelinie.
2.. Construct DC-LV producerceller af Concatemer Array transfektion
Lentiviral transferplasmidet TL20-GFP er en selvstændig inaktiverende lentiviral transfer vektorplasmid baseret på pCL20c-MSCV-GFP med en Dox-regulerbar viralt RNA-genom ekspressionssystem og udskiftning af cytomegalovirus (CMV) enhancer med 7 tet operatører (figur 1C) 11 , 12,15. Plasmid PGK-ligt er et bleomycin resistente (ble) kassette drevet af en svag PGK promotor 2..
- Digest 20 ug plasmid TL20-GFP med restriktionsenzymet SfiI ved 50 ° C. Digest 20 pg plasmid PGK-ligt med PflMI ved 37 ° C.
- Oprense DNA-fragmenter (PGK-ligt kassette er 1011 bp og vektor TL20-GFP er 6861 bp) ved agarosegelelektroforese.
- Ligere TL20-GFP-vektoren og PGK-ble kassette i et molforhold på 25:1 (NEB T4 DNA ligase). Inkuber natten over ved stuetemperatur.
- Efter natten over ligering oprense DNA fra ligeringsblandingen (Qiagen DNeasy blod og væv Kit). Sikre mængden af renset DNA er omkring 5 ug.
- 16-18 timer før transfektion, plade GPRS emballage celler i en 6-cm vævsdyrkningsskål således at sammenflydning vil være omkring 90% på tidspunktet for transfektion.
- Brug calciumphosphat transfektion metode beskrevet i trin 1.2 til at transficere 5 ug af det rensede concatemeric DNA i GPRS emballage celler i 6-cm vævsdyrkningsskål. 4 timer efter transfektion, omhyggeligt fjerne mediet og erstatte med 4 ml forvarmet D10 med doxycyclin (1 ng / ml).
- 48 timer efter transfektion, ændre mediet i D10 med doxycyclin (1 ng / ml) og puromycin (2 ug / ml). Selektere for transficerede kloner ved tilsætning zeocin (50 ug / ml) i dyrkningsmediet. Kultur cellerne i omkring 2 uger, indtil cellen kolonies kan ses i bunden af skålene.
- Mærk cellekolonier nederst retterne. Tag 24-brønds vævskulturplader, antal brønde og føje til hver brønd 2 ml D10 indeholdende zeocin (50 ug / ml), doxycyclin (1 ng / ml), og puromycin (2 ug / ml). Aspirer mediet af de transducerede celler, hvorefter der tilsættes en dråbe af trypsin på hver af kolonierne i mindre end et minut. Derefter tilsættes en eller flere dråber D10 på samme kolonier. Pick up kolonier én efter én med en pipette og overføre dem i separate brønde i 24-brønds plade til vævsdyrkning.
- Kultur og udvide alle cellekloner i D10 indeholdende zeocin (50 ug / ml), doxycyclin (1 ng / ml) og puromycin (2 ug / ml) til evalueringen af viral producerende evne.
3.. Vurdere Viral Produktion af hver celle klon
- Trypsinisér de producerende celler og plade omkring 4x10 6 celler i 6-cm vævsdyrkningsskål i D10 uden doxycyclin således at sammenflydningoverstiger 90%. Udskift mediet med frisk forvarmet D10 dagligt og indsamle mediet for titeren assay 72 timer efter fjernelse DOX.
- Harvest virale supernatant ved filtrering mediet med en 0,45 um filter.
- Plate målceller udtrykker DC-SIGN receptor (f.eks 293T.hDC-SIGN eller museknoglemarv dendritiske celler 16) og 293T som en negativ kontrol i 96-brønds dyrkningsskåle, 1 x 10 4 celler / brønd. Der tilsættes 2-fold seriefortyndinger af den virale supernatant til brøndene (100 ul / brønd). Normalt, 6-8 fortyndinger er tilstrækkelig til at nå det område, hvor transducerede GFP-positive celler er i en lineær sammenhæng til mængden af virus tilsat.
- Centrifuger cellerne og erstatte mediet som beskrevet i trin 1.4. BMDCs bør dyrkes i RPMI-medium med 10% FBS og GM-CSF (1:20 J558L konditioneret medium).
- Måle GFP-ekspression i transducerede celler ved flowcytometri 4-6 dage efter transduktion. Den lentiviral Vector titer beregnes i vektoren fortynding rækkevidde, når procentdelen af GFP-positive celler og vektor beløb er i en lineær sammenhæng. Vælg den celle klon med den højeste virusproduktion for efterfølgende ansøgninger.
4.. Producere og koncentrere lentivirusvektorer
- Kultur producenten cellelinie (LV-MGFP) i 15 cm vævskulturskåle.
- Trypsinisér de producerende celler og plade celler i 15-cm vævsdyrkningsskåle på mere end 90% konfluens i frisk D10 uden doxycyclin. Skift medium med frisk, forvarmet D10 dagligt.
- På tidspunktet for maksimal viral produktion (som bestemt af brugeren), høste de virale supernatant og filtrere den med et 0,45 um filter. Læg den filtrerede supernatant i tykke væg 32,5 ml ultracentrifugerør, forsegles med parafilm og centrifugeres ved 50.000 xg, 4 ° C i 90 min. Grundigt pellet resuspenderes i 50 pi eller et passende volumen PBS eller HBSS afhængigt af programmet. </ Li>
5.. Immunisere mus in vivo og Analyser Antigen-specifikt immunrespons
- Producere høj titer virus som beskrevet i afsnit 4..
- Injicere BALB / c-mus (6-8 uger gamle, hunner) via en trædepude rute med vektoren suspensionen (25 pi pr trædepuden).
- 2 uger efter immunisering, isolere milt og høst splenocytter. Kultur splenocytter med GFP epitoppeptider og analysere tilstedeværelsen af GFP-specifik CD8 + T-celler med intracellulær cytokin farvning, som tidligere beskrevet 17 (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den stabile cellelinie beskrevet i denne metode kan producere store mængder af lentivirale vektorer, der er specifikt rettet mod dendritiske celler. Som vist i figur 1B, isolering af individuelle kloner gav stabile cellelinjer af varierende kvalitet 12.. Mellem 26 testede kloner, produceret 8 lentivirale partikler ved en titer på mere end 10 6 transduktion enheder pr ml (TU / ml), som er et typisk benchmark for SVG-pseudotype lentivirusvektorer fremstillet ved transient transfektion. På samme tid, produceret flere kloner mindre end 10 4 TU / ml, er det vigtigt at isolere multiple kloner for at opnå en stærk producent.
En klon pålideligt produceret lentivirusvektorer ved en titer på mere end 10 7 TU / ml. Yderligere testning på denne klon viste, at dette niveau af viral produktion var stabil i flere dage, upåvirket af tilstedeværelsen / fraværet af serum i dyrkningsmediet, og enchievable i celler dyrket i mere end 3 måneder (Figur 2) 12.
At bekræfte, at disse vira ikke kun var effektive in vitro, blev de også anvendt til at immunisere mus. Analyse af GFP-specifik immunreaktion ved intracellulær cytokin farvning fandt, at stabilt produceret DC-LV kan stimulere udvidelsen af GFP-specifik CD8 + T-celler til næsten 4% af alle CD8 + Splenocytter (figur 3) 12.
Figur 1. Generering af tetracyclin-regulerede lentivirusvektor producerende celler. (A) Skematisk oversigt over proceduren for DC målrettede lentivirusvektor producerende celler, herunder transduktion af GRP linjer med en retroviral vektor containing den SVGmu kappegenet og transfektion af genet af interesse (viral vektor) ved concatemeric transfektion. (B) Single kloner udvalgt af zeocin behandling blev ekspanderet over 1-2 uger, og titeren af den virale supernatant blev målt 3 dage efter fjernelse af doxycyclin. Som vist virale titere varierede meget ved klon. (C) plasmidkort. Den virale vektor plasmid TL20-GFP koder grønt fluorescerende protein under kontrol af en murin stamcelle virus promotoren og vektor-genomet under kontrol af en tetracyclin-repressibel promotor. PGK-ligt koder zeocinresistens genet (Sh ble) under det konstituerende phosphoglyceratkinase 1 promotor (PGK). Retro-SVGmu indeholder SVGmu glycoprotein under P stramme tet responsive element. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Karakteristik af viral vektor produktion. (A) Efter fjernelse af DOX, blev den virale vektor titeren af kultursupernatanter målt hver dag i 7 dage. Virusproduktion toppede mellem 48 - 72 timer efter induktion. Celler dyrket i serum-frie medier producerede næsten lige så meget virus som dem dyrket med 10% FBS. (B) Producer celler blev dyrket over 3 måneder, og portioner blev testet jævnligt for virusproduktion. Ingen signifikant tab af virus produktion blev observeret.
Figur 3. Lentivirusvektorer produceret af stabile DC-målrettede cellelinier kan selektivt transducere udviklingslandene in vitro og generere et immunrespons in vivo. <strong> (A) Mouse knoglemarv-afledte dendritiske celler blev inficeret med LV-GFP og GFP-ekspression blev målt med flowcytometri. GFP-ekspression var specifik for CD11c + celler, som omfatter dendritiske celler. (B) Mus blev immuniseret med 2 x 10 7 TUS af renset og koncentreret LV-GFP. To uger senere blev næsten 4% af alle CD8 + T-celler aktiveres og udtrykte IFNY som reaktion på præsentationen af GFP dominerende peptid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skitseret en fremgangsmåde til fremstilling af store mængder af lentivirusvektorer hjælp 293T celler stabilt transduceret med alle lentivirale komponenter under tet off reguleringssystem. Til dato er afhængige fleste protokoller til at producere lentivirusvektorer på standard calciumphosphat transient transfektion (se 18, for eksempel). Denne tilgang har været en succes på en klinisk skala, men den kan lide af nogle begrænsninger ikke kan være til stede i opskalering produktion fra stabile cellelinjer. For eksempel kunne co-transfektion med store mængder LV plasmider teoretisk øge chancen for udvikling af replikationskompetent lentivirus 19. Desuden forbigående transfektioner er mere tilbøjelige til at producere variable resultater på en stor skala end at bruge en stabil producent linje på grund af de store mængder DNA input kræves 12. Under de rette betingelser, har sådanne producentorganisationer linjer blevet brugt til at generere andre γ-retrovirale vektorer på store skalaer 20,21. Imidlertid er undersøgelser anvender lentivirale producent linjer begrænset, og dermed optagelse af robuste assays 22 at detektere replikationskompetent lentivirus vil være afgørende for at udvikle nogen cellelinie til klinisk brug.
Andre grupper har offentliggjort beskrivelser af lentivirus-producerende stabile cellelinjer 6-11,23. Men en fælles begrænsning af disse rapporter er, at mange af dem er afhængige transduktion de producerende celler med lentivirale vektorer, der koder for genet af interesse, som kan reducere deres sikkerhed til klinisk brug. Her vi udnytter concatemeric vifte transfektionsmetode 11 til transducere celler, der kan producere selv-inaktiverende lentivirus. Desuden er vores brug af tet off system forbedrer metodens egnethed for klinisk brug. Denne lovgivningsmæssige forhindrer toksicitet fra SVGmu under cellekultur vedligeholdelse og giver mulighed for indsamling af lentivirusvektorer under Antibiotic-frie betingelser.
Under proceduren er det vigtigt, at laboratoriepersonale tage passende forholdsregler, når du håndterer lentivirusvektorer. Lentivirusvektorer er afledt af HIV-1, et humant patogen og alle procedurer bør udføres under vejledning af en institution biosikkerhed udvalg. Ifølge NIH, er BL2 indeslutning generelt hensigtsmæssigt at arbejde med avancerede lentivirale systemer som den er beskrevet her, selv om forbedret BL2 indeslutning kan være indiceret, hvis eksperimenter er opskaleret til klinisk praksis 24..
Der er flere kritiske trin i proceduren, der kræver særlig pleje. Først skal cellekultur udføres med stor opmærksomhed til detaljer. Vi har fundet, at virustitere falde mærkbart hvis producerende celler ikke er passeret hver 24. time. Ligeledes kan nogle partier FBS føre til betydelige fald i virusproduktion, så det er vigtigt at teste flere partier FBS befmalm opskalering et eksperiment. Udvælgelsen af en klon, der kan producere høje virustitere er afgørende for efterfølgende anvendelser. I overensstemmelse med tidligere arbejde 25, har vi fundet, at kloner, der synes at opdele hurtigere tendens til at producere mere virus. Når en høj-titer klon er fundet, bør disse celler i portioner og fryses i FBS + 10% DMSO så hurtigt som muligt. Derefter, ved hjælp af frisk optøede alikvoter med til at generere den højeste titer muligt. Ved at følge denne tommelfingerregel, vi har haft mest succes producerer virus via forbigående transfektioner, og vi forventer, at lignende cellelinje vedligeholdelse vil gavne stabile virus-producerende celler.
Denne metode største begrænsning er, at det kræver en betydelig mængde af op foran indsats for at generere en stabil producent linje. Således er det ikke sandsynligt at være hensigtsmæssig i situationer, hvor flere forskellige typer lentivirusvektorer vil blive testet. Forbigående transfektioner kan være mere bekvemt for THESe typer af applikationer. Vi generelt forudser bruge denne metode til at generere store mængder af viral vektor efter vektoren allerede er blevet testet i et lille format. En anden begrænsning af vores specifikke cellelinje er, at vektorer produceret af GPRS celler kun vil være specifikke for celler, der udtrykker DC-SIGN fordi kappeproteinet, SVGmu, binder til denne receptor. At målrette andre cellulære receptorer, kan fremgangsmåden modificeres ved at indføre andre glycoprotein plasmider i den oprindelige GPR cellelinie. På samme måde kan andre gener af interesse transficeres ind i producerende cellelinjer, så lentivirusvektorer kan levere mere relevante proteiner end GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Michael Chou, Bingbing Dai og Liang Xiao for at bidrage data til dette manuskript. Vi anerkender også Dr. John Gray for de generøse gaver af reagenser, der anvendes i denne undersøgelse. PB er understøttet af en postdoc stipendium fra National Cancer Center. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 og RCA170820A), et tilskud fra Bill og Melinda Gates Foundation, en translationel acceleration tilskud fra Fælles Center for Translationel Medicin og en bevilling fra California HIV / AIDS forskningsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
