Vi beskriver her en plattform som gjør kometmetoden påvisning av DNA-skader med enestående gjennomstrømming. Enheten mønstre pattedyrceller i en microarray og muliggjør parallell prosessering av 96 prøver. Tilnærmingen til rette for analyse av grunnleggende nivå for DNA-skade, eksponering-indusert DNA skade og DNA-reparasjonskinetikk.
DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.
Den eneste celle gel elektroforese (SCGE) assay (aka kometen analyse) er en mye brukt teknikk for kvantifisering av et bredt spekter av DNA-lesjoner, inkludert basis lesjoner, abasic nettsteder, enkelttrådbrudd, dobbel tråd pauser, cross og alkali sensitive sider. Det underliggende prinsipp for analysen er at skadet DNA migrerer lettere enn uskadet DNA på grunn av oppsplitting og tap av superhelical struktur. Graden av migrering er proporsjonal med mengden av DNA-skade, og kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi. Bilde-fangst og intensitet profilanalyse av individuelle komet formede DNA deretter levere parametermålinger som hale lengde, hale øyeblikk, og% DNA i halen for å avdekke nivået av DNA-skader i en celle 1-4.
Foreløpig er det to vanlige versjoner av kometmetoden: a) alkalisk komet analyse og b) nøytral kometmetoden. Den alkaliske kometmetoden er den mestbrukt versjon, som bruker en høy pH buffer for å slappe av DNA før elektroforese og dermed oppdager alle typer trådbrudd og alkali-sensitive områder. Den nøytrale komet assay, på den annen side, er mindre øvet fordi den bruker en nøytral buffer for å opprettholde de doble helikser og detektere bare dobbeltstrengbrudd 2,5. For kjemiske og fysiske stoffer som induserer DSB sin, er SSBs opprettet i konserten, og er dannet på mye høyere nivåer (f.eks γIR-indusert SSBs er en størrelsesorden mer vanlig enn DSB sin). For de fleste DNA skadelige eksponeringer, DSB sin er mye sjeldnere enn andre klasser av DNA-skader, og er dermed vanskeligere å oppdage. Vi har vist i tidligere publikasjoner deteksjonsvindu begge versjonene. 6,7
Selv om kometen analysen har blitt rutinemessig brukes for grunnleggende forskning på DNA skade og reparasjon og gentoksisitet testing 1,2,8-15, har analysen blitt rapportert å ha dårlig reproduserbarhet grunn av utvalg-til-prøven, person-til-person-og lab-til-lab variabilitet. I tillegg er analysen lav gjennomstrømning, delvis fordi bildeopptak og dataanalyse er arbeidskrevende. Sammen utgjør disse begrensningene bidrar til dens relativt lave aksept i store studier. Gjennom integrering av engineering teknologier og prinsipper, bringer CometChip en løsning på problemene med gjennomstrømming og selvmotsigelser som er forbundet med den tradisjonelle kometmetoden 6,7. Kort, for å skape den chip, blir en støpeform ved hjelp av fotolitografi microfabricated å skape microposts med en diameter så liten som for en enkelt celle. Støpeformen blir så brukt til å stemple den smeltede agarose, noe som resulterer i en matrise av mikrobrønnene etter at gelen stivner. Chips blir utviklet for å gi forskere med variabel størrelse brønner til kompatible med ulike celletyper. Slik legger du brikken, blir cellene i media lov til å bosette seg i brønnene av tyngdekraften; skytende celler blir vasket bort. Fanget cellene blir deretter innkapslet ossing et tynt lag av lavt smeltepunkt agarose, og en bunn 96 brønns plate blir deretter festet til gelen overflaten for å skape 96 macrowells, hver med hundrevis av mikrobrønner på dens bunnflate.
Denne protokollen beskriver de generelle prosedyrene for eksperimenter med denne brikken, som inkluderer gel forberedelse, celle lasting, dosering og reparasjon, cellelyse, elektroforese, og fluorescerende imaging. Vi viser to eksempler på doseresponsforsøk med lymphoblast celler eksponert kjent DNA-skadende midler, ved hjelp av alkaliske og nøytrale versjoner av analysen hhv. To reparasjonsforsøk er også vist å beskrive hvordan reparasjon respons etter eksponering kan evalueres ved hjelp av systemet.
Allestedsnærværende genotoxins i miljøet og også innenfor menneskeceller utøve uunngåelig stress og skade på mobilnettet DNA. Faktisk har det blitt anslått at det er 1000 s av DNA-lesjoner er til stede i humane celler ved steady state 18. Forstå skade mottakelighet og reparasjon kinetikk hos mennesker ikke bare bringer innsikt til grunnleggende forskning, men også fordeler narkotika utvikling. Ironisk nok, til tross for muligheten for skade på DNA for å fremme kreft, blir DNA-ødeleggende midler som brukes ved svært høye nivåer for å behandle kreft, noe kunnskap om DNA-skade og reparasjon relevant for personlig medisin. Den CometChip er en roman forskning enhet som utnytter microfabrication praksis for å revolusjonere en lang eksisterte DNA skade analysen. Bygge på de samme prinsippene for den tradisjonelle kometmetoden, gir chip betydelig høyere gjennomstrømning og bedre reproduserbarhet. Vi beskriver her metoder for bruk av denne brikken. For å klargjøre sin nytteverdi og robusthet, vi vise resultater from flere eksperimenter hvor brikken har blitt brukt for å vurdere skader forårsaket av flere ulike DNA skadelige stoffer, og der det har blitt brukt til å evaluere DNA-reparasjon. Sammen resultatene presentert her gi nyttig informasjon for bruk av chip og demonstrere sin brede anvendelighet til forskning på DNA skade og reparasjon.
En av de viktigste trinnene i denne protokollen er å oppnå effektiv celle lasting. Mange cellelinjer har blitt testet på dette systemet, inkludert både fjæring og heftende celler. Last effektivitet er avhengig av mange variabler slik som celletype, cellestørrelse, lastkonsentrasjon og tid. Suspensjon cellelinjer så som lymfoblastoide celler er lettest å arbeide med. Konsentrering av cellesuspensjonen kan variere fra 10 april-10 juni celler per 96-brønn og lasting fullfører vanligvis i 15-30 min. Høyere celletetthet forenkler lasting og forkorter tiden det tar for cellene å bosette seg i mikro.
Henter parametere for heftende celler kan avvike fra opphengs celler. Cellelinjer som kinesisk hamster Ovarian (CHO) celler, ble funnet å ha lignende lasteeffektivitet som oppheng celler (etter trypsinization) og dermed bruke lignende belastningsforhold. Andre celletyper, så som svulstceller som lett danner celleaggregater i suspensjon, krever ytterligere håndtering. Passerer cellesuspensjoner gjennom en enkelt celle filter og tilsetning trypsin til suspensjonen media kan undertrykke dannelsen av celleklynger under lasting. Til slutt, når det gjelder lasting tid, den tid som kreves for å fange adherente cellelinjer i mikrobrønnene kan variere fra 20 min til 1 time. Som et resultat, anbefales det at brukerne utføre pilotforsøk for å bestemme optimale belastningsforhold før du går videre til ytterligere undersøkelser. Lasting effekt kan visualiseres under et sterkt mikroskop felt eller mer nøyaktig avdekket ved å farge de innkapslede celler med DAPI eller annen DNAflekker før evaluering under fluorescerende mikroskop.
En stor fordel med denne metoden, og chip er allsidighet. Først blir forskere ikke begrenset til en bestemt arbeidscellekonsentrasjonen, fordi overskytende celler blir vasket bort, og microarray sikrer ensartet komet-tetthet. For det andre kan de mikrobrønner gjøres med variable størrelser for å romme celletyper med forskjellige størrelser. Under forhold som flere celler er fanget i en enkelt mikro, multi-celle kometer er selv kalibrert og avkastnings konsistente resultater i forhold til encellete kometer 6,7. En annen fordel med patterning celler i en microarray er at alle kometer er da på samme fokusplan med faste stillinger, redusere støy som skyldes ufokusert kometer og tilrettelegging automatisert bildebehandling og analyse. De betydelige forbedringer i gjennomstrømningen og følsomhet gitt av CometChip muliggjøre anvendelsen av analysen for stor-skala-studier. Til sammen brikken giSA verdifullt verktøy for DNA skadevurdering for forskere, toksikologer, klinikere og epidemiologer.
Mens kometen analysen er kjent for sitt gode følsomhet i å oppdage et bredt spekter av DNA-skade, denne analysen også lider av lav spesifisitet. Ved hjelp av denne protokollen forbedrer reproduserbarhet og gjennomstrømming av analysen, men viser ikke avansement i spesifisitet. Likevel, multiplekses for analysen med andre metoder er blitt rapportert å være effektive for å oppnå større spesifisitet. Et eksempel er inkluderingen av renset lesjon-spesifikke enzymer. Disse enzymene kan konvertere ellers ikke målbare basis lesjoner i påvisbare trådbrudd og abasic nettsider 1,19-21. Et mye brukt eksempel er reparasjon endonuclease Formamidopyrimidin-DNA glykosylase (Fpg), som avslører oksidative DNA modifikasjoner 19,22. Fordi enzymet fordøyelsen trinn påføres etter cellelyse, kan systemet bli behandlet på samme måte som enSA tradisjonelle agarose lysbilde uten endringer i protokollen. Selv om den detaljerte protokollen ikke er beskrevet her, har denne tilnærmingen blitt bearbeidet av mange tradisjonelle kometmetoden brukere i det siste og protokollene kan lett finnes. I en tidligere publikasjon, brukte vi denne metoden til å identifisere fluorescerende lys-indusert skade 22.
Den store fordelen med denne metoden er gjennomstrømningen det gir, som åpner dørene til studier som tidligere var nesten umulig. Evnen til å behandle 96 prøver på samme plattform reduserer ikke bare arbeidskraft og tid, men også reduserer eksperimentelle lyder og forbedrer reproduserbarhet. Inter prøvevariasjon er vesentlig lavere enn de tradisjonelle slide-til-bilde variant, som kan være 2 ganger høyere enn variasjonen observert med denne brikken 6,7. Redusert støy fører også til forbedret følsomhet, slik at deteksjon av flere små forskjeller mellom prøvene. Fordi enheten bruker en standard 96-brønners format, er den kompatibel med generell forskningsutstyr og HTS teknologier. Vurdere en studie som krever evaluering av 100 prøver, forutsatt at en gjennomsnittlig forsker kan behandle ~ 30 glassplater i løpet av flere dager. Gitt at hver prøve må utføres i tre eksemplarer, ville det ta omtrent en måned å fullføre en slik studie, som også ville uunngåelig lider prøve til prøve variasjon. I motsetning til dette prosess 100 forhold, hver i triplikat, med denne brikken krever bare noen få plater, og kan bli utført i tre dager. Denne stor forbedring i gjennomstrømningen åpner døren til studier som tidligere var uoppnåelig.
Protokollen presenteres her beskriver både de grunnleggende prosedyrer for utførelse av standard kometmetoden og de modifiserte trinn kreves for å bruke CometChip plattformen. Med evnen til å måle både iboende DNA skadenivåer og den etterfølgende reparasjonsrespons, er svært relevant for analysenen rekke biologiske og kliniske anvendelser. Informasjon om virkningen av spesifikke kjemiske eksponeringer på genomet letter sykdomsforebygging og behandling. Videre er det også betydelig interesse for å bestemme variasjoner i DNA-skade følsomhet og reparasjon kapasitet hos individer 23,24. Denne teknikken gir en gjennomstrømning som kreves for slike store studier. Kunnskap om interindividuelle variasjoner er kritisk for å identifisere mottakelige personer og for å utforme individuelle behandlinger eller preventions strategier. Tatt sammen, teknologien som presenteres her gir en høy gjennomstrømning, objektiv og kvantitativ DNA skade analyse plattform som har potensial til å bli en standard metodikk i nær fremtid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble først og fremst støtte med 5-UO1-ES016045 med delvis støtte fra ett-R21-ES019498 og R44-ES021116. DMW ble støttet av NIEHS Training Grant i miljøtoksikologi T32-ES007020. Utstyr ble gitt av Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
Name of Equipments | Company | Catalog Number | Comments |
CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
Bottomless 96-wel plate | VWR | 655000-06 | |
1.5″ binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |