Summary
وصفنا هنا منصة تسمح الكشف مقايسة المذنب الحمض النووي من التلف مع سرعة غير مسبوقة. أنماط جهاز خلايا الثدييات في ميكروأري وتمكن المعالجة المتوازية من 96 عينات. النهج يسهل تحليل الحمض النووي من التلف مستوى القاعدة، التي يسببها التعرض للضرر وإصلاح الحمض النووي DNA حركية.
Introduction
وهلام الكهربائي خلية واحدة (SCGE) فحص (الملقب الفحص المذنب) هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقدير حجم مجموعة واسعة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك الآفات القاعدة، مواقع abasic، فواصل حبلا واحدة، فواصل حبلا مزدوجة، crosslinks والقلويات حساسة المواقع. مبدأ الكامنة وراء الفحص هو أن تلف الحمض النووي يهاجر بسهولة أكبر من الحمض النووي غير التالفة بسبب التشرذم وفقدان هيكل superhelical. مدى الهجرة يتناسب مع كمية من الحمض النووي من التلف، ويمكن تصور باستخدام المجهر مضان. التقاط الصور وتحليل الشخصية شدة DNA على شكل المذنب الفردي ثم تقديم القياسات المعلمة مثل طول الذيل، والذيل لحظة، وDNA٪ في الذيل للكشف عن مستوى الضرر الحمض النووي داخل الخلية 1-4.
حاليا هناك نسختين تستخدم عادة للمقايسة المذنب: أ) فحص القلوية المذنب وب) مقايسة المذنب محايد. فحص القلوية المذنب هو الأكثر انتشاراالنسخة المستخدمة، والذي يستخدم منطقة عازلة درجة الحموضة العالية للاسترخاء DNA قبل الكهربائي وبالتالي بالكشف عن جميع أنواع فواصل حبلا والقلويات مواقع حساسة. الفحص المذنب محايد، من ناحية أخرى، هو أقل متمرسة لأنه يستخدم عازلة محايد للحفاظ على اللوالب المزدوجة وكشف الوحيدة فواصل حبلا مزدوجة 2،5. الكيميائية والعوامل المادية التي تحفز DSBs، يتم إنشاء SSBS في الحفل، وتتشكل عند مستويات أعلى بكثير (على سبيل المثال، SSBS γIR التي يسببها هي أمر من حجم أكثر شيوعا من DSBs). بالنسبة لمعظم التعرض الضارة DNA، DSBs هي أقل تواترا بكثير من فئات أخرى من الحمض النووي من التلف، وبالتالي هي أكثر صعوبة للكشف. لقد أثبتنا في المنشورات السابقة نافذة الكشف عن كلا الإصدارين. 6،7
على الرغم من أن مقايسة المذنب قد استخدمت بشكل روتيني للبحوث الأساسية على الحمض النووي من التلف وإصلاح واختبار السمية الوراثية 1،2،8-15، تم الإبلاغ عن الفحص وجود الفقراء بسبب استنساخ عينة ل-عينة، من شخص إلى شخص وتقلب المختبر إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو انخفاض الإنتاجية، وذلك جزئيا بسبب الحصول على الصور وتحليل البيانات وشاقة. معا، تساهم هذه القيود لها لقبول منخفض نسبيا في الدراسات على نطاق واسع. من خلال دمج تقنيات ومبادئ الهندسة، وCometChip يجلب حلا لمشاكل إنتاجية والتناقضات التي ترتبط مع المذنب الفحص التقليدي 6،7. لفترة وجيزة، لإنشاء رقاقة، وmicrofabricated قالب باستخدام ضوئيه لخلق microposts بأقطار صغيرة مثل التي من خلية واحدة. ثم يتم استخدام القالب للقضاء على الاغاروز المنصهر، مما أدى إلى مجموعة من microwells بعد يتصلب هلام. ويجري حاليا وضع رقائق لتوفير الباحثين مع الآبار متغير الحجم لتتوافق مع أنواع مختلفة من الخلايا. لتحميل رقاقة، ويسمح للخلايا في وسائل الإعلام لتسوية في الآبار عن طريق الجاذبية. يتم غسلها الخلايا الزائدة بعيدا. خلايا المحاصرين ثم يتم تغليف لناجي طبقة رقيقة من نقطة انصهار منخفضة الاغاروز، ومن ثم فرضت في قعر 96 لوحة جيدا على سطح هلام لخلق 96 macrowells، ولكل منها مئات microwells على سطحه السفلي.
يصف هذا البروتوكول والإجراءات العامة لإجراء التجارب مع هذه الشريحة، والتي تشمل إعداد هلام، تحميل خلية، الجرعات وإصلاح، تحلل الخلية، الكهربي، والتصوير الفلورسنت. نحن لشرح مثالين من التجارب الاستجابة للجرعة مع الخلايا lymphoblast يتعرض كلاء ضررا الحمض النووي المعروف، وذلك باستخدام قلوية والإصدارات محايدة للمقايسة على التوالي. وتظهر تجربتين إصلاح أيضا لوصف كيف يمكن تقييم استجابة إصلاح بعد التعرض باستخدام نظام.
Protocol
1. إعداد رقاقة
- إزالة هلام رقاقة من حزمة والمكان إلى جانب فيلم بئر واحدة لوحة مستطيلة، هلام أسفل.
- غسل هلام في 25 مل 1X PBS لمدة 15 دقيقة، كرر مرتين.
- وضع الجل على لوحة من الزجاج والتوجه التسمية من هلام وفقا لذلك.
- اضغط بلطف على قعر وحة 96 جيدا مقلوب على هلام. تأكد من أن جميع الآبار من لوحة جيدا قعر ضمن مجال هلام.
- استخدام 1.5 'مقاطع الموثق على كل جانب من لوحة لتأمين لقط مع الزجاج.
- نضح قبالة PBS الزائدة العازلة في كل بئر.
2. تحميل خلايا
- إعداد تعليق خلية:
- للخطوط الخلايا تعليق، تمييع تعليق خلية في وسائل الإعلام للحصول على تركيز النهائي من 10 -10 5 6 خلية / مل.
- للخطوط الخلايا الملتصقة، اتبع العادية فصل / بروتوكولات trypsinization ودilute خلايا منفصلة في وسائل الإعلام إلى التركيز النهائي من 10 5 -10 6 خلية / مل. إذا خلايا الكلي، تمرير تعليق خلية في تصفية خلية للحصول على تعليق خلية واحدة.
- إضافة 100 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من 96 لوحة جيدا.
- لوحة الغلاف مع الفيلم هلام لمنع التبخر وسائل الإعلام.
- تسمح للخلايا لتحميل لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 ° C الحاضنة.
- إزالة رقاقة من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام من كل بئر.
- إزالة مقاطع الموثق وقعر صفيحة 96 أيضا؛ عقد رقاقة مع لوحة من الزجاج في زاوية وشطف بلطف مع 1X PBS لإزالة الخلايا الزائدة على الاغاروز.
- تحقق تحميل الخلية باستخدام المجهر حقل مشرق مع عدسة الهدف 4X. إذا لوحظ عدم كفاية تحميل، كرر من الخطوة 2.1.
- وضع رقاقة تحميلها على السطح حتى (المختبر مقاعد البدلاء). رقاقة تراكب مع 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز هذا هو ما قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية. استخدام حوالي 2̵هناك حاجة إلى 3 مل من LMP الاغاروز لكل رقاقة: 1.
- السماح تراكب ليصلب الأول في RT لمدة 3 دقائق ثم ينتقل إلى 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة 5 دقائق لدبق كاملة.
3. الجرعات وتصليح
ملاحظة: لدراسة خط الأساس DNA مستوى الضرر، انتقل إلى الخطوة 4.
- محاذاة بعناية الآبار من الشريحة (تم إنشاؤه من لقط السابق) مع آبار جديدة قعر وحة 96 جيدا. إعادة الصحافة قعر لوحة 96 جيدا على رأس وآمن لقط مع مقاطع الموثق.
- إضافة 100 ميكرولتر من الكيميائي للجرعة المطلوبة إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا. تؤدي الجرعات / أو العلاج على الجليد في 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة المبلغ المطلوب من الوقت.
- بعد الجرعات الكيميائية للنضح من كل بئر وشطف بعيدا الكيميائية المتبقية باستخدام برنامج تلفزيوني 1X. إذا تم دراستها الأضرار المباشرة هنا، انتقل إلى الخطوة 4.
- لدراسة حركية الإصلاح، وتسمح للخلايا في رقاقة لإصلاح فيوسائل الإعلام في 37 درجة مئوية. ليز (انتقل إلى الخطوة 4) في نقطة زمنية محددة.
ملاحظة: إصلاح لا يمكن أن يؤديها على رقاقة مع قعر لوحة 96 جيدا المرفقة، أو يمكن خفض الشريحة إلى قطع منفصلة بعد إزالة لوحة قعر البئر 96.
4. تحلل
- لإجراء فحص القلوية المذنب:
- جعل العمل العازلة تحلل القلوية بإضافة 1٪ تريتون X-100 إلى القلوية محلول المخزون تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نا 2 EDTA، 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 10). إعداد حوالي 25 مل من العمل العازلة تحلل لكل رقاقة.
- قبل البرد العمل العازلة تحلل القلوية في 4 درجات مئوية.
- غمر رقاقة بارد في العمل العازلة تحلل القلوية والسماح تحلل لأداء O / N في 4 ° C الثلاجة.
- لإجراء فحص محايد المذنب:
- جعل العمل تحلل العازلة محايد بإضافة 1٪ تريتون X-100 و 10٪ DMSO إلى محايد محلول المخزون تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نا 2 EDTA، 10ملي تريس، 1٪ N -Lauroylsarcosine، ودرجة الحموضة 9.5). إعداد حوالي 25 مل العمل تحلل العازلة لكل رقاقة.
- قبل الحارة العمل تحلل العازلة محايد في 43 درجة مئوية.
- يغرق في رقاقة دافئ العمل تحلل العازلة محايدة، والسماح تحلل لأداء O / N في 43 ° C الحاضنة.
5. الكهربائي
- لإجراء فحص القلوية المذنب:
- إزالة العازلة تحلل وبسرعة شطف رقاقة مع 1X PBS.
- رقاقة آمن في غرفة الكهربائي مع الجانب هلام فيلم تواجه أسفل باستخدام الشريط على الوجهين.
- جعل الغرفة إلى غرفة باردة 4 درجات مئوية.
- ملء الغرفة مع قلوية البارد عازلة الكهربائي (0.3 M هيدروكسيد الصوديوم، 1 ملم نا 2 EDTA) إلى المستوى الذي يغطي فقط هلام.
- تسمح بتفكيك قلوية لمدة 40 دقيقة.
- تشغيل الكهربائي في 1 V / سم و 300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة. ضبط مستوى الصوت من العازلة الكهربائي في تشاmber لتحقيق المطلوب الحالية قيد التشغيل.
- لإجراء فحص محايد المذنب:
- إزالة العازلة تحلل وشطف رقاقة مع العازلة الكهربائي محايد (2 ملي نا 2 EDTA، 90 ملي تريس، حمض البوريك 90 ملم، ودرجة الحموضة 8.5) لمدة 2 × 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- رقاقة آمن في غرفة الكهربائي مع الجانب هلام فيلم تواجه أسفل باستخدام الشريط على الوجهين.
- جعل الغرفة إلى غرفة باردة 4 درجات مئوية.
- ملء الغرفة مع البرد عازلة الكهربائي محايد (2 ملي نا 2 EDTA، 90 ملي تريس، حمض البوريك 90 ملم، ودرجة الحموضة 8.5) إلى المستوى الذي يغطي فقط هلام.
- السماح للهلام على الجلوس في غرفة باردة لمدة 60 دقيقة.
- تشغيل الكهربائي عند 0.6 V / سم و 6 مللي أمبير لمدة 60 دقيقة في غرفة باردة. ضبط مستوى الصوت من العازلة الكهربائي في الغرفة لتحقيق المطلوب تشغيل الحالية.
6. التصوير الفلورسنت
- إزالة رقاقة من غرفة الكهربائي من عمودغرفة د.
- تحييد المواد الهلامية في تحييد العازلة (0.4 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5) لمدة 2 × 15 دقيقة في 4 درجات مئوية الثلاجة.
- وصمة عار وصمة عار مع رقاقة الحمض النووي الفلورسنت الاختيار (أي الذهب SYBR، إيثيديوم بروميد) تحت مصنع أوصى الإجراءات. الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت.
تحليل البيانات 7.
تحليل الصور المذنب من قبل معيار البرمجيات مقايسة المذنب مثل كوميت 5.5.
Representative Results
في هذا المثال الأول، نحن تصف النهج لقياس المستويات الأولية من الحمض النووي من التلف في الخلايا lymphoblastoid الإنسان بعد التعرض لأضرار الأكسدة باستخدام H 2 O 2. من أجل تقييم H 2 O 2 يسببها الآفات قاعدة وفواصل حبلا واحدة، وتستخدم الظروف المذنب قلوية. بعد تحميل كاملة وتم تغليف الخلايا مع تراكب الاغاروز، يتم الضغط قعر لوحة 96 جيدا على سطح لخلق 96 المقصورات على الرقاقة. كل من الآبار 96 يمكن مداوي مع نوع مختلف أو تركيز المواد الكيميائية. هنا استخدمت أربع جرعات مختلفة من H 2 O 2، وكان يستخدم برنامج تلفزيوني 1X وسيطرة سلبية. وتظهر الصور التمثيلية المذنبات المحتشدة في الشكل 1A، حيث غير المعالجة (أعلى)، 50 ميكرومتر (وسط) و 100 ميكرومتر (القاع) H 2 O 2 أظهرت عينات -exposed مستويات مختلفة من ذيول المذنبات. تحليل الصور المذنب يمكن ادائهاميد باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا، التي تقيس مستويات الضرر عموما على أساس كثافة مضان والهجرة المسافة الإجمالية لكل ذيل المذنب. يتم إجراء قياسات عادة على 50 إلى 100 المذنبات في حالة والقيمة المتوسطة (إما DNA٪ الذيل أو طول الذيل) يتم احتساب. يوضح الشكل 1B منحنى استجابة DNA نسبة ذيل تحليلها من TK6 المذنبات الخلايا lymphoblastoid تتعرض لأربعة تركيزات مختلفة من H 2 O 2. الاتساق بين تجارب مستقلة يدل على فعالية هذا النهج في تقييم الحمض النووي ردا الضرر من مستويات مختلفة من العلاجات الكيميائية في الخلايا.
لمعرفة المزيد عن التباين بين العينات (على سبيل المثال، بين macrowells) وبين من يكرر نفس التجربة، وقد تآمر بين العينة والتباين بين التجريبي في الشكل 2A و 2B على التوالي. في كل تجربة، كل بئر للث 96الذراع رقاقة يعادل عينة مختلفة، وبالتالي الاختلاف جيد إلى جيد يكشف التباين بين عينة من الجهاز. هنا، تم علاج الخلايا TK6 تحميلها في 12 بئرا من 96 رقاقة جيدا مع نفس الجرعة من H 2 O 2 و lysed مباشرة بعد العلاج. تم تنفيذ جميع الخطوات تجريبية أخرى بالتوازي وتم رسم الوساطات لا تقل عن 50 المذنبات من كل macrowell في الشكل 2A. متوسط الوساطات هو 77.53٪ DNA في الذيل، مع الانحراف المعياري هو 3.99٪. من هذه البيانات، نحسب أن معامل التباين بين العينات 5.2٪، وهو أقل عدة أضعاف من الفحص التقليدي، مما يدل على متانة محسنة لهذا الاختبار 6،16. لمعرفة المزيد عن استنساخ للمقايسة، فإننا تتعرض خلايا TK6 في رقاقة مع 75 ميكرومتر H 2 O 2 وتحليل مستوى فوري الحمض النووي من التلف. وتكررت هذه التجربة تم رسم ست مرات والبيانات من كل تجربة في Figure 2B. تحت ظروف تجريبية متطابقة، حصلنا على نتائج تتراوح بين 41.76٪ إلى 57.87٪، كما هو موضح القضبان الرمادية في الشكل. متوسط ستة يكرر هو 49.57٪، مع الخطأ المعياري للمتوسط من 2.04٪ فقط. الاختلاف بين منخفض يعني أن يكرر الفحص المذنب أجريت على هذا الجهاز الجديد هو تكرار للغاية.
لتقييم حركية إصلاح، ويسمح للخلايا لإصلاح الحمض النووي في وسائل الإعلام الجديدة بعد العلاج. Lysing macrowells في نقاط زمنية مختلفة يكشف عن تغيير في الحمض النووي من التلف مع مرور الوقت. ويرد مثال في الشكل 3. في هذه التجربة، تم تغليف الخلايا TK6 لأول مرة في رقاقة، وتعامل مع 50 ميكرومتر H 2 O 2، وسمح لإصلاح ما يصل إلى 60 دقيقة بعد التعرض. هي lysed خلايا في 0، 20، 45 و 60 دقيقة على التوالي. وتظهر الصور المذنب ممثلة في نقاط زمنية مختلفة في الشكل 3A، ويتم رسم التغير في مستويات الحمض النووي من التلف مع مرور الوقت في الشكل3B. وكشفت هذه البيانات التي يتم إصلاحها ما يقرب من جميع الأضرار خلال 45 دقيقة آخر H 2 O 2 العلاج. يمكن أن العديد من المتغيرات تؤثر على معدل إصلاح، بما في ذلك نوع من خط الخلية والعوامل الكيميائية المستخدمة. وبالتالي يمكن للباحثين إجراء تعديلات على البروتوكول (أي تمديد وقت الإصلاح) لتلبية احتياجات إضافية في تحقيقاتها. هنا نقدم مثالا آخر على تجربة إصلاح باستخدام هذه الشريحة، حيث يتم الطعن خلايا TK6 مع وكيل سام للجينات مختلفة N -Methyl- N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) وكيلا مؤلكل المعروف للحث على الآفات قاعدة بينهم 7-methylguanine و3 methyladenine. يتم تحويل هذه الآفات إلى مواقع abasic إما عن طريق نزع البورينات عفوية أو عن طريق إزالة الأنزيمية التي glycosylases DNA. يمكن المشقوق الموقع abasic الناتج تحت ظروف قلوية وبالتالي الكشف على الرقاقة. يسبب التعرض الأولي زيادة كبيرة في الضرر، واضحة من فترة طويلةذيول، وبمرور الوقت يتم تخفيض هذه الذيول واستعادة الخلايا DNA سليمة خلال إصلاح. على الرغم من الألكلة والضرر التأكسدي على حد سواء إصلاحه في المقام الأول إصلاح قاعدة الختان المسار، ومقدار الآفات ولدت والبروتينات المشاركة في إصلاح تختلف. هذه الاختلافات يمكن أن تؤدي إلى معدلات مختلفة من التحول إلى مواقع abasic، وكذلك أسعار مختلفة ترميم المواقع abasic الناتجة عن ذلك. في الشكل 4، حركية إصلاح الخلايا TK6 تتعرض ل0.1، 1، وتظهر 3 ميكروغرام / مل من MNNG. في هذه التجربة، ونحن مدد الوقت لتجربة 2 ساعة بعد التعرض لضرر MNNG التي يسببها يبدو أن تستمر لفترة أطول ويتم مسح بمعدل أبطأ بالمقارنة مع H 2 O 2 يسببها الضرر.
تحليل DSBs باستخدام الظروف المحايدة هي مشابهة جدا لبروتوكول لتحليل الآفات واحدة حبلا باستخدام الظروف القلوية. لإظهار مستويات الضرر الأولية، تعرضت خلايا TK6 إلى مستويات متفاوتة من البنت، والخلايا الناتجة هي lysed وelectrophoresed في درجة الحموضة محايد (الشكل 5A). ومن الجدير بالذكر أن مورفولوجية ذيول المذنب يختلف عن الظروف فحص قلوية. لتحقيق DNA مجزأ يمكن ملاحظتها باستخدام هذا الاختبار، جرعة الأشعة تحت الحمراء المستخدمة هي أعلى بكثير (0-100 غراي) من الجرعة المطلوبة لنرى الضرر باستخدام الظروف القلوية. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن طول الذيل المعلمة الأكثر حساسية في التعبير عن مدى الضرر DNA عند استخدام الفحص المذنب محايد 7. ويتضح منحنى الاستجابة للجرعة التي تم تحليلها في الشكل 5B. يمكن أيضا إصلاح الحمض النووي فواصل حبلا مزدوجة في الخلايا يتم تقييم، ولقد ثبت من خلال Weingeist آخرون. ال 7. أخذت معا، وCometChip محايدة تقدم أداة قيمة لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي DSBs.
1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. H 2 O 2 جرعة استجابة الخلايا TK6 باستخدام القلوية المذنب مقايسة. (A) المذنبات microwell العريض من دون علاج الابيضاض اللمفاوي TK6 (أعلى) والخلايا TK6 تتعرض ل50 ميكرومتر (وسط) و 100 ميكرومتر (القاع) H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. شريط النطاق هو 100 ميكرون. (B) H 2 O 2 الاستجابة للجرعة الخلايا TK6 تتعرض لمستوى مختلف من H 2 O 2. كل نقطة البيانات هي متوسط ثلاث تجارب مستقلة، حيث تم الحصول على الحمض النووي متوسط نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية في كل تجربة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المشترك بين العينة التجريبية وبين التغير. (A) تباين عينة إلى عينة. تم تحميلها TK6 خلايا lymphoblast الإنسان في 12 بئرا من الشريحة 96 جيدا. تعرضت كل بئر إلى 100 ميكرولتر من 50 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الخلايا هي lysed فورا ويعاير لDNA٪ الذيل. وأظهرت بيانات من كل بئر هنا. يمثل كل مربع متوسط لا يقل عن 50 المذنبات الفردية من كل بئر. يعني من 12 بئرا هو 77.53٪، الانحراف المعياري هو 3.99٪، ويتم حساب معامل الاختلاف لتكون 5.2٪. (B) تجربة إلى تجربة الاختلاف. تم تحميل TK6 خلايا lymphoblast الإنسان في 96 رقاقة جيدا، ويتعرضون ل100 ميكرولتر من 75 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الخلايا هي lysed فورا ويعاير لDNA٪ الذيل.وتكررت التجربة نفسها 6 مرات ويتم عرض البيانات من كل تكرار كشريط الرمادي. يمثل كل مربع ومتوسط DNA٪ ذيل المذنبات لا يقل عن 100 فرد من كل تكرار. متوسط 6 تكرارات هو 49.57٪، كما هو موضح في شريط هنا مرة أخرى. الانحراف المعياري 6 تكرارات هو 4.99٪، ويتم احتساب الخطأ المعياري للمتوسط لتكون 2.04٪، ممثلة شريط خطأ في الشكل.
الرقم 3. إصلاح H 2 O 2 يسببها الضرر في الابيضاض اللمفاوي TK6. (A) تخطيطي لدراسة إصلاح مع المذنبات التمثيلية. يتم التعامل مع خلايا TK6 مع وكلاء ضررا والسماح للإصلاح في وسائل الإعلام في 37 ° C قبل تحلل. (B) حركية إصلاح خلايا TK6 بعد العلاج مع 50 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة على 4 & #176؛ C. كل نقطة البيانات هي متوسط ثلاث تجارب مستقلة، حيث تم الحصول على الحمض النووي متوسط نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية في كل تجربة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط من تكرار التجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. إصلاح الأضرار التي يسببها MNNG في الابيضاض اللمفاوي TK6. يتم التعامل مع خلايا TK6 0.1، 1، و 3 ميكروغرام / مل MNNG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وسمحت لإصلاح في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية تصل إلى 120 دقيقة آخر التعرض. تم الحصول على الحمض النووي متوسط نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية لكل من ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياريللمتوسط من ثلاث تجارب مستقلة.
الرقم 5. الاستجابة للجرعة الأشعة تحت الحمراء من خلايا TK6 باستخدام مقايسة المذنب محايد. (A) العريض المذنبات microwell من الابيضاض اللمفاوي غير المعالجة TK6 (أعلى) والخلايا TK6 تتعرض ل40 غراي (وسط) و 80 غراي (القاع) أشعة جاما. شريط النطاق هو 100 ميكرون. (B) IR الاستجابة للجرعة الخلايا TK6 تتعرض لمستوى مختلف من أشعة جاما. كل نقطة بيانات تمثل متوسط طول الذيل (ميكرومتر) لا يقل عن 300 المذنبات مجمعة من ستة macrowells على الرقاقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
genotoxins في كل مكان في البيئة وأيضا داخل الخلايا البشرية تمارس الضغط لا مفر منه وتلف الحمض النووي الخلوي. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن هناك 1،000s من آفات الحمض النووي الموجودة في الخلايا البشرية في حالة مستقرة 18. فهم الضرر قابلية وحركية الإصلاح في البشر ليس فقط يجلب البصيرة إلى البحوث الأساسية، ولكن أيضا فوائد تطوير الأدوية. ومن المفارقات، على الرغم من قدرة الحمض النووي من التلف لتعزيز السرطان، وتستخدم وكلاء ضررا DNA عند مستويات مرتفعة جدا لعلاج السرطان، مما يجعل المعرفة عن الحمض النووي من التلف وإصلاح ذات الصلة الطب الشخصي. وCometChip هو جهاز البحوث الرواية التي تستخدم ممارسات التصنيع الدقيق للثورة وكانت موجودة منذ فترة طويلة فحص الحمض النووي من التلف. بناء على نفس مبادئ الفحص المذنب التقليدي، يوفر رقاقة أعلى بكثير الإنتاجية وتحسين التكاثر. وصفنا هنا طرق لاستخدام هذه الشريحة. لتوضيح فائدتها ومتانة، وتبين لنا النتائج جيئة وذهابام العديد من التجارب حيث تم استخدام رقاقة لتقييم الأضرار الناجمة عن عدة عوامل ضارة DNA مختلف، وحيث تم استخدامه لتقييم إصلاح الحمض النووي. معا، والنتائج المقدمة هنا توفر معلومات مفيدة لاستخدام رقاقة وتظهر إمكانية تطبيقه على نطاق واسع لبحث الحمض النووي من التلف والإصلاح.
واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هو إنجاز الفعلي لتحميل الخلية. وقد تم اختبار العديد من خطوط الخلايا على هذا النظام، بما في ذلك تعليق والخلايا الملتصقة. تحميل كفاءة يعتمد على العديد من المتغيرات مثل نوع من الخلايا، حجم الخلية، وتركيز التحميل والوقت. خطوط الخلايا مثل الخلايا تعليق lymphoblastoid هي أسهل للعمل مع. تركيز تعليق خلية يمكن أن تتفاوت من 10 أبريل - 10 يونيو خلايا في 96 جيدا وتحميل يكمل عادة في 15-30 دقيقة. كثافة الخلية أعلى تسهل التحميل ويقصر مقدار الوقت اللازم للخلايا ليستقر في microwells.
يمكن تحميل المعلمات للخلايا ملتصقة تختلف من خلايا تعليق. تم العثور على خطوط الخلايا مثل الصينية الهامستر المبيض (CHO) خلايا، لديك كفاءة مماثلة تحميل كخلايا تعليق (trypsinization التالية)، وبالتالي استخدام ظروف التحميل مماثلة. أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا السرطانية التي تشكل بسهولة المجاميع خلية في التعليق، وتتطلب معالجة إضافية. يمكن تمرير تعليق خلية من خلال مرشح وحيد الخلية وإضافة التربسين إلى وسائل الإعلام تعليق قمع تشكيل مجموعات الخلايا أثناء التحميل. أخيرا، من حيث وقت التحميل، والوقت اللازم لالتقاط خطوط الخلايا الملتصقة في microwells يمكن أن تتفاوت من 20 دقيقة إلى 1 ساعة. ونتيجة لذلك، فمن المستحسن أن المستخدمين إجراء التجارب الرائدة لتحديد ظروف التحميل الأمثل قبل الشروع في مزيد من التحقيقات. يمكن تصور فعالية تحميل تحت المجهر حقل مشرق أو كشف أكثر دقة عن طريق تلطيخ الخلايا مغلفة مع دابي أو DNA الآخرينالبقع السابقة للتقييم تحت المجهر الفلورسنت.
واحد الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي رقاقة وبراعة. أولا، لا تقتصر الباحثين إلى تركيز خلية عمل معين لأن الخلايا الزائدة وجرفت، وميكروأري يضمن موحدة المذنب الكثافة. ثانيا، يمكن جعل microwells مع أحجام متغيرة لاستيعاب أنواع الخلايا ذات أحجام مختلفة. في ظل الظروف التي يتم التقاطها خلايا متعددة في microwell واحد، المذنبات متعددة الخلايا هي النتائج متسقة معايرة الذاتي والعائد بالمقارنة مع المذنبات وحيدة الخلية 6،7. فائدة أخرى من الزخرفة الخلايا في ميكروأري هي أن جميع المذنبات هي ثم في نفس المستوى البؤري مع مواقع ثابتة، والحد من الضوضاء بسبب المذنبات غير مركزة وتسهيل التصوير والتحليل الآلي. تمكن تحسينات كبيرة في الإنتاجية والحساسية التي تقدمها CometChip تطبيق الفحص للدراسات واسعة النطاق. أخذت معا، ورقاقة توفيرسا أداة قيمة لتقييم الأضرار الحمض النووي للباحثين وعلماء السموم والأطباء وعلماء الأوبئة.
بينما يتم الفحص المذنب المعروف حساسية ممتازة في الكشف عن مجموعة واسعة من الحمض النووي من التلف، يعاني هذا الاختبار أيضا من انخفاض خصوصية. باستخدام هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير استنساخ والإنتاجية للمقايسة، ولكنها لا تثبت التقدم في خصوصية. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن مضاعفة فحص مع منهجيات أخرى لتكون فعالة في تحقيق أعلى خصوصية. ومن الأمثلة على ذلك إدراج تنقية الانزيمات آفة محددة. هذه الانزيمات يمكن تحويل قاعدة الآفات لا يمكن اكتشافها إلا في فواصل حبلا اكتشافها ومواقع abasic 1،19-21. والمثال استخداما هو إصلاح الحمض النووي نوكلياز داخلية formamidopyrimidine glycosylase (FPG)، الذي يكشف عن تعديلات الحمض النووي الأكسدة 19،22. لأنه يتم تطبيق الخطوة انزيم الهضم بعد تحلل الخلية، يمكن للنظام أن يعامل بنفس الطريقةسا الشريحة الاغاروز التقليدية دون إجراء أي تعديلات على البروتوكول. على الرغم من أن بروتوكول مفصلة لم يتم وصفه هنا، وقد تم تكييف هذا النهج من قبل العديد من المستخدمين مقايسة المذنب التقليدي في الماضي والبروتوكولات يمكن العثور بسهولة. في منشور السابق، استخدمنا هذا الأسلوب لتحديد الفلورسنت التي يسببها ضوء الضرر 22.
والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يوفر الإنتاجية، والذي يفتح الأبواب للدراسات التي كانت في السابق مستحيلا. القدرة على معالجة 96 عينة على نفس المنصة لا يقلل فقط من العمل والوقت، ولكن أيضا يقلل من الضوضاء التجريبية، ويعزز إلى حد كبير استنساخ. تباين عينة أمور أقل بكثير من التباين التقليدي شريحة إلى الشريحة، التي يمكن أن تكون 2 أضعاف أعلى من التباين وحظ مع هذه الشريحة 6،7. يؤدي خفض الضوضاء أيضا في تحسين حساسية، مما كشف عن الاختلافات أكثر دهاء بين العينات. لأن الجهاز يعمل على ستاndard شكل 96 جيدا، وهو متوافق مع المعدات البحثية العامة وHTS التكنولوجيات. النظر في الدراسة التي تتطلب تقييم 100 عينة، على افتراض أن متوسط الباحث يمكن معالجة ~ 30 الشرائح الزجاجية على مدار عدة أيام. وبالنظر إلى أن كل عينة تحتاج إلى أن يؤديها في ثلاث نسخ، ان الامر سيستغرق نحو شهر لاستكمال هذه الدراسة، التي من شأنها أيضا تعاني حتما من عينة لعينة الاختلاف. في المقابل، معالجة 100 حالة، كل في ثلاث نسخ، مع هذه الشريحة تتطلب سوى بضع لوحات، ويمكن أداؤها في ثلاثة أيام. هذا تحسن كبير في الإنتاجية يفتح الباب أمام الدراسات التي كانت سابقا غير قابلة للتحقيق.
بروتوكول المعروضة هنا يصف كل من الإجراءات الأساسية لإجراء الفحص المذنب القياسية والخطوات اللازمة لتعديل استخدام منصة CometChip. مع القدرة على قياس كل المتأصلة مستويات الحمض النووي من التلف والرد إصلاح اللاحقة، والاختبار هو ذات أهمية كبيرة لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية والسريرية. معلومات عن تأثير التعرض للمواد الكيميائية المحددة على الجينوم تسهل الوقاية من الأمراض والعلاج. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا اهتمام كبير في تحديد الاختلافات في الحمض النووي الضرر الحساسية والقدرة على إصلاح بين الأفراد 23،24. توفر هذه التقنية سرعة نقل المطلوب لمثل هذه الدراسات على نطاق واسع. المعرفة حول الاختلافات بين الأفراد هو أمر حاسم لتحديد الأشخاص المعرضين لتصميم وعلاجات فردية أو استراتيجيات المنع. أخذت معا، والتكنولوجيا المقدمة هنا توفر إنتاجية عالية وموضوعية وكمية منصة تحليل الحمض النووي من التلف الذي لديه القدرة على أن تصبح منهجية موحدة في المستقبل القريب.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل في المقام الأول 5 UO1-ES016045 بدعم جزئي من 1-R21-R44-ES019498 وES021116. وأيد DMW من التدريب غرانت علوم الصحة البيئية في علم السموم البيئية T32-ES007020. تم توفير المعدات من قبل مركز علوم الصحة البيئية P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
