Summary
החדרה של בדיקות microelectrode עצביות גמישות מופעלת על ידי הצמדת בדיקות לstiffeners הנוקשה עם פוליאתילן גליקול (PEG). תהליך הרכבה ייחודי מבטיח אחיד וקובץ מצורף הדיר. לאחר כניסה לרקמה, PEG מתמוסס ומקשח מופק. שיטת בדיקה במבחנה מעריכה את הטכניקה בagarose ג'ל.
Abstract
מערכי microelectrode עבור התקני ממשק עצביים שעשויים מפולימר סרט דק ביולוגית צפויים הרחיבו את החיים תפקודיים בגלל החומר גמיש עשוי למזער את תגובת רקמה שלילית הנגרמת על ידי micromotion. עם זאת, הגמישות שלהם מונעת מהם להיות מוכנס באופן מדויק לרקמה עצבית. מאמר זה מדגים שיטה לצרף באופן זמני בדיקה microelectrode גמישה למקשח נוקשה באמצעות פוליאתילן גליקול biodissolvable (PEG) כדי להקל על כניסה מדויקת, כירורגית של החללית. עיצוב מקשח ייחודי מאפשר פיזור אחיד של דבק PEG לאורכו של החללית. מליטה Flip-שבב, כלי נפוץ בשימוש באריזת מיקרואלקטרוניקה, מאפשר יישור לשחזור מדויק וקובץ מצורף של החללית למקשח. הבדיקה ומקשח בניתוח מושתל ביחד, אז PEG מותר לפזר כך שמקשח ניתן לחלץ עוזב את החלליתבמקום. לבסוף, שיטת בדיקה במבחנה משמשת להערכת חילוץ מקשח במודל agarose ג'ל של רקמת המוח. גישה זו להשתלה הוכיחה יתרון במיוחד עבור בדיקות גמישות יותר (> 3 מ"מ). הוא גם מספק שיטה אפשרית להשתיל בדיקות גמישות כפולה צדדיות. נכון להיום, את הטכניקה נעשתה שימוש כדי להשיג in vivo נתונים הקלטה שונים מקליפת מוח החולדה.
Introduction
מערכי microelectrode הם כלי חיוני במדעי המוח, כמו גם יישומים קליניים מתפתחים כגון תותבות. בפרט, בדיקות מיקרו אלקטרודה לחדור לאפשר גירוי והקלטה של פעילות עצבית באמצעות מגע הדוק עם תאים במוח, חוט השדרה ועצבים היקפיים. אתגר גדול עבור בדיקות עצביות מושתלים הוא יציבות ואריכות ימים של פונקציות הגירוי וצריבה. לימודי דוגמנות וניסיוני של האינטראקציה בין בדיקות microelectrode ורקמה עצבית הראו כי מנגנון אחד לשפלה הוא מיקרו קריעה של רקמה עצבית עקב תנועה היחסית קלה בין החללית והרקמות 1-3. פתרון אחד הוא לפברק בדיקות גמישות שתתאמנה באופן הדוק יותר את מאפייני קשיחות חלק הארי של רקמה עצבית על מנת למזער micromotion יחסית. ככזה, פולימרים סרט דקים ביולוגית כגון polyimide וparylene אומצו כמו מצעים נוחים לmicroelecתרמס בדיקות 4-8.
איזון של בדיקות גמישות הוא שהם קשה להכניס לתוך הרקמה העצבית. חוקרים לקחו גישות שונות כדי להקל על כניסה של בדיקות גמישות תוך שמירה על התכונות מכאניות רצויות. כיתה אחת של עיצובים משנה את הגיאומטריה הבדיקה הפולימר להגדיל נוקשות בסעיפים או צירים מסוימים תוך שמירה על תאימות בחלקים אחרים. זה הושג על ידי שילוב של צלעות או שכבות של חומרים אחרים 9,10. גישה נוספת משתלבת ערוץ 3-D לעיצוב הבדיקה הפולימר כי הוא מלא בחומרים מתכלים 11. בדיקה זו יכולה להיות התקשחה באופן זמני, ולאחר הכניסה המהותיות במתמוסס הערוץ ומתנקז החוצה. עם זאת, שיטות כגון אלה שאופן קבוע לשנות את הגיאומטריה של המכשיר המושתל הסופי עלולות לפגוע בחלק מהתכונות הרצויה של החללית גמישה.
שיטה אחת שעושה not לשנות את הגיאומטריה הבדיקה הסופית הוא לתמצת את מכשיר הפולימר עם חומרים מתכלים כדי להקשיח את המכשיר 12-14 באופן זמני. עם זאת, יש חומרים מתכלים טיפוסיים הזמנות moduli של יאנג בסדר גודל קטן יותר מזה של סיליקון וכתוצאה מכך הייתי דורשים עובי גדול יותר כדי להשיג את אותה קשיחות. כראוי ציפוי הבדיקה יכולה לגרום לקצה מעוגל יותר או קהה, מה שהופך את ההחדרה קשה יותר. כמו כן, מאחר ציפויים נמסים נחשפים, קיים סיכון שלהם מתמוסס מייד עם מגע, או אפילו קרבה, עם הרקמה.
מחלקה נוספת של שיטות משתמשת בחומרי מצע בדיקה חדשנית המפחיתים בנוקשות לאחר שמושתלים לתוך רקמות. חומרים כאלה כוללים פולימרים צורת זיכרון 15 וnanocomposite מכאני אדפטיבית 16. חומרים אלה מסוגלים להקטין במודולוס אלסטיות משמעותית לאחר כניסה, ויכולים לגרום לבדיקות שmatc באופן הדוק יותרשעות התכונות מכאניות של רקמה עצבית. עם זאת, בטווח השגה של קשיחות הוא עדיין מוגבל, ולכן ייתכן שהם לא יוכלו לספק שווי ערך קשיחות גבוה מאוד לחוטי סיליקון או טונגסטן. כך במקרה של בדיקות גמישות, כי הם מאוד ארוכים (לדוגמא> 3 מ"מ) או שיש להם נמוך מאוד נוקשות, ייתכן שעדיין תהיה צורך בשיטה של באופן זמני מצרף מקשח נוקשה יותר.
עוד שיטה מבטיחה שדווחה היא למעייל הסעות התקשות עם monolayer הרכבה עצמית קבוע (SAM) כדי להתאים אישית את האינטראקציה הפנים בין המעבורת והבדיקה גמישה 17. כאשר יבש, החללית שומרת על המעבורת המצופה אלקטרוסטטי. לאחר כניסה, מים נודדים על גבי המשטח הידרופילי, להפריד את החללית מהמעבורת, כך שניתן לחלץ את המעבורת. חילוץ הסעות עם תזוזת חללית מופחתת הודגם (85 מיקרומטר). עם זאת, עם אינטראקציות אלקטרוסטטיות יחידות שעוצרות את הבדיקה כדי לאהוא מעבורת, יש סיכון מסוים של גלישת חללית ביחס למעבורת לפני ובמהלך כניסה.
פיתחנו שיטה שבה הבדיקה גמישה מחוברת למקשח עם חומר הדבקה biodissolvable זמני שמחזיק באופן מאובטח את החללית במהלך כניסה. הבדיקות בשימוש היו עשויים polyimide, שבו יש מודולוס אלסטיות בסדר הגודל של 2-4 GPA. מקשח היה מפוברק מסיליקון, עם מודולוס אלסטיות של ~ 200 GPA. כאשר מצורפים, את הנוקשות של סיליקון שולטת, בהנחיית כניסה. ברגע שמוכנס לתוך הרקמה, החומר הדבקה מתמוסס ומקשח מופק להחזיר את החללית לגמישות הראשונית שלה. בחרנו בפוליאתילן גליקול (PEG) כחומר הדבקה biodissolvable. PEG כבר בשימוש ביישומים מושתלים כגון בדיקות עצביות, הנדסת רקמות, ו11,18,19 משלוח סמים. עדות מסוימת הציעה כי PEG עשוי להחליש תגובת neuroinflammatory במוחרקמה 18,20. לעומת חומרים אפשריים נוספים, ובכלל זה סוכרוז, קטית-Co-גליקולית חומצת פולי (PLGA), ואלכוהול פוליוויניל (PVA), יש PEG זמן פירוק בנוזלים ביולוגיים שהוא בקנה מידה של מתאים עבור רבים ניתוחי שתל (בסדר הגודל של עשרות דקות, תלוי במשקל מולקולרי). בנוסף, הוא מוצק בטמפרטורת חדר ונוזלי בטמפרטורות הנעות 50-65 ° C. רכוש זה עושה זה מתאים בעיקר לתהליך ההרכבה דיוקנו. יתר על כן, בדומה לSAM מתואר ב17, PEG המומס הוא הידרופילי, בהנחיית חילוץ של מקשח. גישה טובה זו מופעלת על ידי עיצוב רומן מקשח ותהליך הרכבה שיטתי המבטיחים כיסוי דביק מדי ויישור מדויק ודיר. בנוסף לתהליך ההרכבה, אנו מציגים את אופן יישום מקשח הנשלף במהלך ניתוח, כמו גם הליך במבחנה כדי להעריך חילוץ של Stiffener.
הפרוטוקול המובא במסמך זה מבוסס על ההנחה שהמשתמש מחזיק בדיקה microelectrode הפולימר גמישה. חלק מהפרוטוקול הנוגע הייצור של מקשח וההרכבה של חללית זו כדי מקשח מניח גישה לכלים נפוצים שנמצאו במתקן microfabrication. הפרוטוקול המתייחס להכנסה והוצאה עשוי להיות מבוצע במעבדה אוריינטציה מדעי המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבה של Probe למקשח
חלק זה של הפרוטוקול מתאר ייצור של מקשח סיליקון, ואת ההרכבה של חללית פולימר סרט דק למקשח. איור 1 מדגים בדיקה עצבית פולימר טיפוסית יחד עם מקשח המוצע. הפרטים של העיצוב מקשח מוצגים באיור 2. התכונה החדשנית של העיצוב הזה היא רדוד "הפתילה" ערוץ פועל לאורכו המשמש להפצת דבק נוזלי במהלך עצרת. החלק הרחב יותר של מקשח הוא לשונית לטיפול בזמן הרכבה והחדרה כירורגית. מאגר בכרטיסייה מתחבר לערוץ. הרכיב מפוברק בין סיליקון באמצעות תהליכי microfabrication סטנדרטיים.
- מקשח סיליקון עם ערוץ הפתילה היה מפוברק מרקיק סיליקון על המבודד (SOI) בעובי שכבת מכשיר שווה לעובי הרצוי של מקשח (
- הנח גלולה של פוליאתילן גליקול (PEG) של משקל המולקולרי 10,000 g / mol לתוך המאגר (איור 4). מחממים את מקשח ל65 מעלות צלזיוס, כך שPEG נמס ופתילות לערוץ על ידי פעולת נימים. לאחר מכן לקרר לטמפרטורת חדר כדי לחזק. איור 5 מראה סכמטי של ונדר השבב להעיף להגדיר. הנח את מקשח במהופך על הבמה בסיס ונדר השבב להעיף, ולאחר מכן להרים את מקשח עם ראש הכלי. מניחים את החללית במהופך על הבמה הבסיס. השימוש בונדר השבב להעיף, ליישר מקשח והבדיקה ולאחר מכן להוריד את מקשח ולמקם אותו על גבי החללית.
- שלב הבסיס של ונדר השבב להעיף צריך גוף חימום להחיל חום למצע. לאחר שהניח את מקשח, מחמם את ההרכבה שוב 65 ° C. אפשר לרגע אחד לPEG ליתיך מחדש ולהתחיל למלא את הממשק בין החללית ומקשח. מגניב כדי לחזק.
- הפוך את המכלול שוב ולבדוק מלמעלה. לחמם לפי צורך כדי לאפשר PEG כדי למלא את הממשק בין החללית ומקשח לחלוטין. זה יכול להיות מוערך מבחינה ויזואלית מאז הבדיקה היא שקופה. כאסיפה יושבת על תנור החימום העליון (בדיקה-) צד כלפי מעלה, במקום 1-3 דואר באופן ידניכדורי Xtra של PEG המוצק על גבי הכרטיסייה, כך שהם נמסים על החללית, ומספקים חיזוק נוסף באזור זה (איור 6). לבסוף, לאפשר ההרכבה להתקרר כך שPEG מתמצק. בשלב זה, את המכלול מוכן להחדרה כירורגית.
2. החדרה והפקה
- הר ההרכבה חללית-מקשח לmicromanipulator כפי שמודגמת באיור 7 א על ידי עמידה האחורית של מקשח לזרוע micromanipulator באזור הכרטיסייה. ניתן לעשות זאת עם קלטת או מלט דו צדדית, אך היזהר שלא ליצור קשר עם החללית עם דבק. באופן זמני לאבטח את קצה המחבר של החללית לmicromanipulator עם חתיכה קטנה של מרק דבק כזה שניתן להסיר בקלות עם כוח נמוך.
- מקם את ההרכבה החללית על פני היעד ולהכניס את החללית עם מהירות כניסה הרצויה. מהירויות החדרת .13-.5 מ"מ / השני שימשו בעת פיתוח פרוטוקול זה. </ Li>
- מייד להסיר את קצה המחבר של החללית מmicromanipulator בעדינות ולתת לו לנוח על משטח סמוך, כגון יד שנייה מניפולטור (איור 7). זה חייב להיעשות לפני PEG מתחיל להתמוסס כדי להימנע מעקירתם הבדיקה.
- לאפשר זמן לPEG לפזר. זה משך הזמן יהיה תלוי במשקל מולקולרי PEG ואזור המגע בין החללית ומקשח. לדוגמא, עם משקל מולקולרי PEG של 10,000 g / mol, בדיקה microelectrode כ -6 מ"מ ומקשח התאמה שהוא 306 מיקרומטר רחב, 15 דקות כבר מצאו להיות כמות מספקת של זמן. סעיף 3 של הפרוטוקול מציג שיטה לבדוק את זמן פירוק הנדרש. במהלך תקופה זו, חל בופר פוספט (PBS) באמצעות טפטפת סביב נקודת הכרטיסייה וההכנסה לפזר כל PEG שהוא מעל ליעד (איור 7C).
- שימוש micropositioner ממונע, תתחיל חילוץ של מקשח ידי יישום עקירתם שלבמהירות של 5 מ"מ / שנייה 100 מיקרומטר. תנועה מהירה ראשונית זה עוזרת להתגבר על כל חיכוך הסטטי ולמזער תזוזת חללית. לאחר מכן, להשלים את החילוץ מקשח במהירות איטית יותר של כ 0.1 מ"מ / שני (איור 7D).
- במקרה של ניתוח עצמו, להמשיך בהליכים רגילים כדי להחיל ג'ל, סיליקון, ו / או אקריליק שיניים באתר ההכנסה כדי לאבטח ולהגן על החללית, כפי שמודגם ב21.
3. מבחן ג'ל agarose
חלק זה של הפרוטוקול מתאר הליך להגדיר ולבחון את המיצוי של מקשח בג'ל agarose 0.6% המדמה את המאפיינים בתפזורת מכאניים, ה-pH, ומליחות של רקמת מוח 17,22. מאז ג'ל הוא כמעט שקוף דרך מרחקים קצרים, ניתן לצפות הפרדה מקשח ועקירת בדיקה.
- הכן פתרון של agarose 0.6% בופר פוספט (PBS). מערבבים בeleטמפרטורת vated לפזר אבקת agarose לחלוטין. יוצקים את התמיסה לתוך תיבת אקריליק רדודה; ג'ל צריך להיות 3/4- 1 בעמוק. לאפשר לג'ל להגדיר בטמפרטורת חדר למשך שעה.
- להבטיח כי הג'ל הקשוח רווי עם PBS, כך שזה לא יתייבש, ולחמם את הג'ל ל37 ° C.
- הגדר את micromanipulator, מערכת מצלמה מיקרוסקופית התיבה של agarose ג'ל, וכפי שמוצג באיור 8.
- הכנס fiducial התייחסות זכוכית לתוך הקופסה של הג'ל על ידי החלקתה בין ג'ל והצד של הקופסה (איור 8). השתמש בבחירת שיניים לרבע את התכונות על fiducial ההתייחסות לשדה הראייה של המיקרוסקופ הדיגיטלי.
- הר ההרכבה החללית לmicromanipulator כמתואר בשלב 2.1.
- מקם את ההרכבה החללית על פני ג'ל על 1 מ"מ מאחורי fiducial ההתייחסות.
- הכנס את החללית לתוך הג'ל, שימוש במצלמה כדי להנחות אותו לעומק רצוי בשדה הראייה. </ Li>
- מייד להעביר את קצה המחבר של החללית לנוח על משטח סמוך.
- בצע את כל התאמות הנדרשות לתמונת המצלמה להתמקד בבדיקה (תכונות fiducial ההתייחסות עשויות להיות קצת מחוץ לפוקוס). קח את תמונת מצב של המיקום החללית.
- לאפשר PEG לפזר (הפעם עשוי להשתנות, ולמעשה עשוי להיות פרמטר שנבדק). החל PBS ליד הכרטיסייה לפזר PEG שהוא מעל לג'ל.
- התחל לכידת וידאו אם רוצה, ולהתחיל הפקת מקשח כמתואר בשלב 2.5. כאשר החילוץ הושלם, לקחת תמונה סופית של מיקום חללית.
- השתמש בכלי עיבוד תמונה כדי להשוות את התמונות לפני ואחרי החילוץ מקשח. השתמש בתכונות בfiducial ההתייחסות הנראות בשדה הראייה לרישום (ליישר) התמונות. לכייל את קנה המידה של התמונה על סמך הגודל של תכונות ידועות על הבדיקה. מדוד את המרחק של תזוזת חללית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקת החדרה זו משמשת בשילוב עם בדיקות LLNL סרט דק polyimide, אשר חלפו ISO 10993 סטנדרטים biocompatibility ומיועדים להשתלה כרונית. בדיקה polyimide סרט דק אופיינית מודגמת באיור 1 יחד עם מקשח סיליקון שהוא מ"מ כ 10 ארוך באזור הצר. יש מקשח ערוץ זה הפתילה אחד מהם פועל לאורכה, כפי שמוצג באיור 2. איור 3 ממחיש את תהליך mimcrofabrication משמש ליצירה מקשח זה מתוך סיליקון. איור 4 מראה גלולה של PEG המוצק שהונחה למאגר של הכרטיסייה, כפי שניתן לראות דרך המצלמה על מערכת ונדר השבב להעיף. ברגע שזה היה מחומם באמצעות התנור מובנה בתוך הבמה בסיס ונדר השבב להעיף, PEG נמס והחל פתיל לתוך התעלה. תצוגת המצלמה אפשרה לנו לפקח על תהליך הפתילה עד PEG מילא את הערוץ, אשר לחלוטיןשעות לקחו כשעה עם PEG של g / mol במשקל 10,000 המולקולרי. PEG היה אז resolidified והחללית ומקשח הוקמו בונדר השבב להעיף כפי שמוצגים באיור 5. איור 9 א מציג תצוגה עליונה של חללית ומקשח לאחר שמיושר וצמוד, עם PEG מילוי הממשק לחלוטין. איור 9 ב מראה דוגמא של בועת אוויר שבו PEG אינו נוכח בגלל חלקיקים. השלב האחרון בהרכבה הוא להוסיף PEG לאזור הכרטיסייה על חלק הכבל של החללית, לחיזוק נוסף במהלך טיפול. מאחר שהשטח לא להיות מוכנס לתוך היעד, שזה מקובל שיש נפח גדול יותר של PEG כאן, כפי שמוצג באיור 6. שיטת הרכבה זו נעשתה שימוש כדי לצרף צורות שונות של בדיקות לstiffeners, כולל מכשירים רב שוק, כמו שבמוצגת באיור 10.
במבחנה בדיקת agarose ג'ל נעשתה שימוש כדי qualitativאיליי להעריך פרמטרים שונים כגון משקל PEG מולקולרי, זמן המוותר לPEG לפזר, וגיאומטריה מקשח. עם כל שילוב של PEG וגיאומטריה מקשח, פרק זמן מוגדר היה מותר לפירוק. לאחר מכן, היה ניסיון חילוץ תוך התבוננות עקירת בדיקה בזמן אמת. אם הבדיקה נגררה באופן משמעותי (> 200 מיקרומטר) ללא בעליל הפרדה או הזזה יחסית למקשח, הגיע למסקנה כי PEG לא נמס לגמרי. טבלת 1 נותנת כמה תצפיות נציג של פירוק PEG עם משתנה פעמים ומשתנים משקל מולקולרי עם מקשח שהוא 6 מ"מ ארוך ו306 מיקרומטר רחב. תצפית נוספת בבדיקות שלאחר מכן הייתה שכאשר מקשח הוא יותר צר (למשל 220 מיקרומטר), PEG פורקה בפחות זמן (קטן כמו 5 דקות). זה ככל הנראה משום ששטח מגע דבק ירד וכתוצאה מכך, לא היה נפח קטן יותר של PEG לפזר. פרמטרים שלא נראו להשפיע PEG פירוק או תזוזת חללית היה עובי מקשח (עובי החל 20 מיקרומטר 100 מיקרומטר נבדק) ומספר ערוצי הפתילה (לעומת 1 3).
הבדיקה במבחנה שימשה גם לכמת עקירת בדיקה ממוצעת לבדיקה / מקשח / תצורת דבק נתון. בדוגמא זו, הבדיקה בוצעה באמצעות רצף החדרה / חילוץ שמודגם באיור 7 בי ההרכבה חללית-מקשח מוכנסת לתוך הג'ל agarose, את קצה המחבר מועבר למשטח בקרבת מקום, PEG מותר לפזר, ו מקשח סופו של דבר חולץ עוזב את החללית במקום. הניסיון להגדיר באיור 8 מראה את ההרכבה חללית-מקשח מצורף זרוע micromanipulator וממוקם מעל ג'ל. Fiducial ההתייחסות הייתה שבב זכוכית קטן עם מערך של נקודות זהב להציב נגד תיבת אקריליק בשדה הראייה של המיקרוסקופ הדיגיטלי.
> המכשירים בדוגמא זו היו כ 10 מיקרומטר עבה ו536 מיקרומטר רחב עם שמונה אלקטרודות קוטר 100-מיקרומטר. העקבות כללו ערימת מתכת Ti-Au-Ti. מקשח סיליקון היה 220 מיקרומטר רחב, ארוך 6 מ"מ ו50 מיקרומטר עבה. ההרכבה חללית-מקשח הוכנסה כ 5 מ"מ לתוך הג'ל. איור 11 מראה תמונות לפני ואחרי החילוץ של מקשח מהרכבת חללית שנבדקה בagarose ג'ל. תכונות זהב אור בתמונות הן מfiducial ההתייחסות ושמשו כתכונות התייחסות ליישר תמונות אחד לשני. המגרש הידוע בין האלקטרודות (200 מיקרומטר) שימש כדי לכייל את גודל פיקסל, שכן ממד זה הוא פחות רגיש לשינויים בתהליך הייצור. תזוזת חללית נטו בשל מיצוי מקשח הייתה מוערכת להיות 28 ± 9 מיקרומטר (ממוצע שגיאה סטנדרטית ±, n = 5).
עד כה, השיטה המוצעת הורחבה בפועל ניתוח imal בכמה הזדמנויות להשתיל בדיקה לתוך קליפת המוח חולדה. לאחר הרכבה, הבדיקה ומקשח 50 מיקרומטר בעובי עוקרו יחד בEtOH בטמפרטורת חדר. הכניסה והחילוץ בוצעו עם micromanipulator המצורף למסגרת stereotaxic. ההרכבה חללית-מקשח הוכנסה ב0.13 מ"מ / השני כ -4 מ"מ לתוך קליפת המוח של חולדה. לאחר 15 דקות, מקשח היה שחולץ, והותיר את החללית במקום. לאחר התאוששות מניתוח, הקלטות עצביות, כפי שמוצג באיור 12, התקבלו בהצלחה מהחיה ערה הוכחת כדאיותה של שיטה זו בניתוחים אמיתיים 23. טכניקת השתלה זו שימשה גם כדי להשיג in vivo הקלטות עם כפולים צדדיים מערכים שיש לי אלקטרודות משני צידי הקדמי ואחורי, כפי שמוצג באיור 13.
pload/50609/50609fig1.jpg "/>
איור 1. סכמטי של בדיקה עצבית טיפוסית ומקשח המוצעים. יש בדיקה פולימר סרט דק אופייני אלקטרודות אחד או יותר בסוף הבדיקה. עקבות מתכת לרוץ מאלקטרודות לאורכו של החלק בכבלים ולסיים על משטח שמחובר למחבר חשמלי. האורך מקשח (במקרה זה כ 10 מ"מ) תלוי בעומק ההחדרה של החללית, וכרטיסייה רחבה יותר על מקשח מאפשרת לטיפול. (תמונה באדיבות דיאנה ג'ורג')
איור 2. פרטי עיצוב מקשח. ערוץ הפתילה מנצל פעולת נימים להפיץ דבק נוזלי שכבר הופקד במאגר. המאגר הוא באזור כרטיסייה רחב יותר המאפשר טיפול. (תמונה באדיבות דיאנה ג'ורג')
"Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 3. רצף ייצור למקשח סיליקון. מקשח סיליקון מפוברק על מבודד סיליקון על רקיק (SOI) (). ראשית ערוצי הפתילה יבשים חרוט באמצעות התהליך הסטנדרטי בוש (ב '). בשלב הבא, את הגיאומטריה מקשח מוגדרת על ידי לחרוט עוד שעוצר על שכבת תחמוצת הקבור (C). לבסוף, stiffeners פורסם על ידי תחריט הרטובה שכבת תחמוצת נקברה ב49% חומצה הידרופלואורית (ד ').
איור 4. פוליאתילן גליקול במאגר מקשח. פתית של פוליאתילן גליקול להציב במאגר של מקשח. מחומם פעם, זה יתמוסס, למלא את המאגר, ולזרוםלערוץ הפתילה.
איור 5. סכמטי של מליטה להעיף שבב. מקשח מתקיים עם הערוץ על ידי ואקום בראש הכלי של ונדר להעיף השבב. הבדיקה העצבית נמצאת על הבמה הבסיס כלפי מטה.
איור 6. פוליאתילן גליקול על כרטיסייה מקשח. פוליאתילן גליקול במיוחד מיושם בנדיבות בכרטיסייה של מקשח כחיזוק. חלק הכבל של חללית polyimide גלוי על גבי מקשח.
איור 7. סכמטי של בsertion ורצף חילוץ. א) ההרכבה חללית-מקשח מוכנסת לתוך רקמות באמצעות micromanipulator. ב ') את קצה המחבר מועבר למשטח סמוך. C) PBS הוא להחיל לפזר PEG בכרטיסייה של מקשח. ד) מקשח מופק, עוזב הבדיקה ביעד.
איור 8. במבחנה בדיקה להגדיר. להגדיר להכנסה בדיקה לבדיקה והפקה מקשח ב0.6% agarose ג'ל בופר פוספט. ההרכבה חללית-מקשח מחוברת לזרוע micromanipulator וממוקם מעל יעד ג'ל ליד fiducial ההתייחסות. מיקרוסקופ דיגיטלי משמש כדי לבחון את החללית ומקשח בagarose ג'ל.
איור 9. לחקור דבק מקשח. א) להציג לראש הבדיקה המצורפת מקשח עם יישור טוב וכיסוי דבק מלא. ב ') דוגמא לפער בכיסוי הדבק בשל חלקיקים.
איור 10. דוגמא לבדיקה מרובה שוק. תהליך ההרכבה המוצעת שימש לצרף בדיקה ארבעה שוק זה למקשח סיליקון התואם.
איור 11. דוגמא לתוצאות חילוץ מקשח. הבזקים מלפני (למעלה) ואחרי מיצוי מקשח (תחתון) עם בדיקה polyimide סרט דק בagarose ג'ל. נקודות זהב האור הן עלfiducial וההתייחסות משמשות כתכונות התייחסות להשוות את התמונות ומדידת תזוזת חללית. העקירה המשוערת של החללית היא 28 ± 9 מיקרומטר (ממוצע שגיאה סטנדרטית ±, n = 5).
איור 12. דוגמא של הקלטות פיסיולוגיות. הקוצים נוירון בודדים אלה התקבלו מחללית microelectrode גמישה מושתלת עם מקשח נשלף כמתואר בפרוטוקול זה.
איור 13. הקלטות LFP מבדיקה כפולה צדדית. קלטי עם בדיקות מקשח אפשר להסרה של מערך גמיש שאלקטרודות בחזית והן המשטחים בחזרה. הקלטות LFP אלה הראו גביצועי omparable האלקטרודה בשני הצדדים לאחר השתלה.
| לאחר PEG מומס: | |||||
| אורך בדיקה (מ"מ) | רוחב מקשח (מיקרומטר) | משקל מולקולרי PEG (g / mol) | 10 דקות | 15 דקות | 30 דקות |
| 6 | 306 | 6,000 | כן | כן | |
| 10,000 | כן | ||||
| 20,000 | לא | כן | |||
טבלת 1. זמן פירוק PEG ב0.6% agarose ג'ל. תצפיות על פירוקה של PEG של משקולות מולקולריות שונותמשמש לצרף בדיקה גמישה למקשח סיליקון, אחרי כמויות משתנות של זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מספקת תהליך מבוקר היטב לצרף בדיקות פולימר סרט דק לstiffeners הנפרד עם דבק biodissolvable. כמו כן מוצג הנו ההליך הניתוחי המומלץ ליישם stiffeners הנשלף אלה וטכניקה כדי לאמת את ההליך במבחנה לתצורת חללית-מקשח נתון. מאז מקשח יכול להתבצע באופן שרירותי נוקשה, השיטה יכולה להקל על הכניסה של בדיקות ארוכות יחסית (> 3 מ"מ). ככזה, שיטת ההחדרה צפויה להיות טכנולוגיה המאפשרת ליישומים בגירוי מוחי עמוק (DBS), גירוי חוט השדרה, וממשקים עצביים היקפיים.
מקשח הרומן עם ערוץ הפתילה ותהליך ההרכבה מבוסס להעיף שבב מתאים לחומרים שונים ותצורות בדיקה. גיאומטרי, מקשח לא חייב להתאים את טביעת רגל הבדיקה ויכול, למשל, להיות צר יותר מהחללית. העובי של Sti ffener עשוי גם להשתנות. אמנם יש לנו תיארתי מקשח עשוי סיליקון, עם חומר אחר, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג תכונות מכאניות רצויות יותר עבור יישומים מסוימים. תהליך ההרכבה מתאים גם עבור סוגים אחרים של דבק נוזלי. PEG הוא קל במיוחד לעבודה עם בגלל היכולת שלה להיות הקרושה וremelted מספר רב של פעמים. במקרה של דבקי נוזל אחרים שאין להם נכס זה, את רצף ההרכבה עשוי צריך להיות שונה. ניתן להשתמש במשקל מולקולרי שונה עבור PEG. משקל מולקולרי גבוה יותר יידרש זמן כדי להמס, אשר עשוי להיות רצוי במהלך ניתוח. שטח המגע בין החללית ומקשח ישפיע גם על הזמן הדרוש כדי להמס את הדבק לאחר כניסה חללית. מומלץ כי תצורת חללית-מקשח עם המשקל המולקולרי נבחר להיבדק במבחנה כפי שתוארה בסעיף 3 לאפיין את הזמן הדרוש כדי להמס את הדבק.
_content "> מצאנו שדווקא שליטה על מהירות החילוץ היא קריטית לחילוץ מקשח עם עקירת בדיקה מינימאלית. באופן ספציפי, בתנועה מהירה ראשונית מסייעת להתגבר על חיכוך הסטטי ולהפריד את מקשח מהחללית. אחרי זה, את שארית המיצוי יכול יושלם במהירות איטית יותר עם עקירת בדיקה נוספת זניחה, כפי שנצפה בבדיקת agarose ג'ל. מעבדות מדעי המוח רבות משתמשות במערכות stereotaxic קופף, ויש מודול mircopositioner ממונע מKOPF (למשל 2662 דגם) שניתן להוסיף למערכות אלו. בחרנו מפעיל ניופורט ממונע, כי היה לו ביצועים דינמיים דומים, אבל היה פחות יקר ולא היו בקרת מהירות גמישה יותר. (זה היה הכרחי כדי להמציא סוגר פשוט לצרף מפעיל למערכת micropositioner שלנו.) מערכת KOPF ניתן להחיל שני חילוץ מהירויות דומות לפרוטוקול שפיתחנו. עם זאת, המהירות המרבית של מפעיל KOPF היא 4 מ"מ / השני, ואילוהיינו 5 מ"מ / השני לתזוזה הראשונית באמצעות מפעיל ניופורט.במהלך במבחנה בבדיקת vivo, החדרת ההרכבה חללית-מקשח בוצעה גם עם micromanipulator מונע באופן ידני, או micromanipulator ממונע, עם מהירויות הנעות 0.13-0.5 מ"מ / שנייה. אין נזק או delamination של החללית נצפה. מהירויות הכנסה גבוהות יותר לא נבדקו כדי לקבוע את הסיכון של נזק להרכבת חללית-מקשח.
שינויים בהליך החדרה / החילוץ נמצאים בהתקדמות כדי להפוך את התהליך חזק יותר. בפרט, צעד מאוד רגיש עובר את קצה המחבר של החללית משל micromanipulator על גבי משטח בקרבת מקום. קיים סיכון בשלב זה של הפרעה לבדיקה לפני שהיא כבר מאובטחת. ייתכן גם שהעיקול בכבלים יכולים לגרום ללחץ על החלק המוכנס של החללית, שהוביל לעקירה מכוונת של החלליתלאחר מיצוי מקשח. נכון לעכשיו, את הסיכונים האלה מתקזזים באמצעות בדיקה עם כבל שאורכו לפחות 2.5 סנטימטר. עם זאת, רצוי שתהליך ההחדרה / החילוץ להיות תלוי פחות בעיצוב הבדיקה. שינויים בסופו של דבר כלי micromanipulator או התוספת של היערכות גופי שיכולים באופן זמני לתמוך המחבר צפוי לאפשר מיצוי אמין יותר של מקשח.
יש כמה שאלות פתוחות שעלולות להוביל למחקרים עתידיים המשתרעים משיטה זו. ראשית, בעוד agarose ג'ל 0.6% סיפק את ניתוח ההדמיה הידוע ביותר בפונדקאי רקמת מוח מבחנה ואיפשר עקירה חללית, זה לא בדיוק לשכפל את רקמת מוח. יש צורך במחקרים כדי לבחון מיקום ותזוזה של הבדיקה in vivo. שנית, יש צורך בהשתלה לטווח ארוך ובדיקה היסטולוגית לכמת יתרונות של החללית גמישה עם מקשח נשלף. מחקרים כאלה עשויים לחקור את התאוריהכי ציות הבדיקה מפחית micromotion ומרחיב את ביצועי האלקטרודה. לבסוף, זה יהיה מועיל כדי לאפיין קצב הידרדרות של PEG בצורה מדויקת יותר. זה יכול לסייע בכוונון טוב יותר של פעמים פירוק לצרכי ניתוחיים מסוימים. מדידות מסוג זה יכול גם לכמת כמה זמן PEG מומס נשאר בין החללית ומקשח, וזה חשוב שכן האופי הידרופילי של PEG מאפשר מיצוי של מקשח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH NIDCD Y1-DC-8,002-01. עבודה זו בוצעה בחסות מחלקת אנרגיה של ארה"ב על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol, 10,000 g/mol | Sigma Aldrich | 309028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Flexible Sub-micron Die Bonder | Finetech | Fineplacer lambda | |
| Micromanipulator | KOPF | 1760-61 | |
| Digital Microscope | Hirox | KH-7700 | |
| Dual Illumination Revolver Zoom Lens | Hirox | MXG-2500REZ | |
| Precision Motorized Actuator | Newport | LTA-HS | w/ CONEX-CC controller |
References
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Lee, Y. T., Hitchcock, R. W., Bridge, M. J., Tresco, P. A. Chronic response of adult rat brain tissue to implants anchored to the skull. Biomaterials. 25 (12), 2229-2237 (2004).
- Subbaroyan, J., Martic, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2, 103-113 (2005).
- Lacour Sun, Y., S,, et al. Assessment of the biocompatibility of photosensitive polyimide for implantable medical device use. Journal of Biomedical Materials Research A. 90 (3), 648-655 (2009).
- Kipke, D. R., Pellinen, D. S., Vetter, R. J. Advanced neural implants using thin-film polymers. IEEE International Symposium on Circuits and Systems. 4, 173-176 (2002).
- Mercanzini, A., Cheung, K., et al. Demonstration of cortical recording using novel flexible polymer neural probes. Sensors and Actuators A. 143, 90-96 (2008).
- Stieglitz, T. Flexible biomedical microdevices with double-sided electrode arrangements for neural applications. Sensor and Actuators A. 90, 203-211 (2001).
- Tooker, A., Tolosa, V., Shah, K. G., Sheth, H., Felix, S., Delima, T., Pannu, S. Polymer neural interface with dual-sided electrodes for neural stimulation and recording. Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society. , 5999-6002 (2012).
- Parylene microprobes with engineered stiffness and shape for improved insertion. Egert, D., Peterson, R. L., Najafi, K. Proceedings of Transducers '11, Beijing, China, , (2011).
- Lee, K. -K., He, J., et al. Polyimide-based intracortical neural implant with improved structural stiffness. Journal of Micromechanics and Microengineering. 14, 32-37 (2004).
- Takeuchi, S., Ziegler, D., et al. Parylene flexible neural probes integrated with microfluidic channels. Lab On A Chip. 5, 519-523 (2005).
- Improving mechanical stiffness of coated benzocyclobutene (bcb) based neural implant. Singh, A., Zhu, H., He, J. Proceeding of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, , 4298-4301 (2004).
- Lewitus, D., Smith, K. L., et al. Ultrafast resorbing polymers for use as carriers for cortical neural probes. Acta Biomaterialia. 7, 2483-2491 (2011).
- An ultra-compliant, scalable neural probe with molded biodissolvable delivery vehicle. Gilgunn, P. J., Khilwani, R., et al. Proceedings of the 2012 IEEE 25th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), , 56-59 (2012).
- Ware, T., Simon, D., et al. Fabrication of responsive, softening neural interfaces. Advanced Functional Materials. 22 (16), 3470-3479 (2012).
- Harris, J. P., Capadona, J. R., et al. Mechanically adaptive intracortical implants improve the proximity of neuronal cell bodies. Journal of Neural Engineering. 8, 1-13 (2011).
- Kozai, T. D. Y., Kipke, D. R. Insertion shuttle with carboxyl terminated self-assembled monolayer coatings for implanting flexible polymer neural probes in the brain. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 199-205 (2009).
- Bjugstad, K. B., Lampe, D. S., Kern, D. S., Mahoney, M. Biocompatibility of poly(ethylene glycol)-based hydrogels in the brain: An analysis of the glial response across space and time. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (1), 79-91 (2010).
- Greenwalk, R. B., Choe, Y. H., McGuire, J., Conover, C. D. Effective drug delivery by pegylated drug conjugates. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 217-250 (2003).
- Effects of adsorbed proteins and an antifouling agent on the impedance of silicon-based neural microelectrodes. Sommakia, S. S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Proceedings of the 31st Annual IEEE EMBC International Conference, , 7139-7142 (2009).
- Gage, G. J., Stoetzner, C. R., Richner, T., Brodnick, S. K., Williams, J. C., Kipke, D. R. Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals. J. Vis. Exp. (60), e3565 (2012).
- Chen, Z. -J., Gillies, G. T., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive. Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, , 871-874 (2012).
