Summary
يتم تمكين إدخال مرونة تحقيقات مسرى مكروي العصبية عن طريق ربط لتحقيقات التقوية جامدة مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG). عملية تجميع فريد من نوعه يضمن موحدة والتعلق للتكرار. بعد الإدراج في الأنسجة، وPEG يذوب ويتم استخراج الميبس. طريقة الاختبار في المختبر بتقييم هذه التقنية في agarose هلام.
Abstract
ومن المتوقع أن قمنا بمد عمر وظيفية صفائف مسرى مكروي للأجهزة العصبية واجهة التي هي مصنوعة من حيويا رقيقة فيلم البوليمر لأن مادة مرنة يمكن تقليل استجابة الأنسجة الضارة التي تسببها micromotion. ومع ذلك، مرونتها يمنعهم من يتم إدراج بدقة في الأنسجة العصبية. يوضح هذا المقال طريقة لنعلق مؤقتا مسرى مكروي التحقيق مرنة لالميبس جامدة باستخدام biodissolvable البولي ايثيلين جلايكول (PEG) لتسهيل دقيقة، الإدراج الجراحية لجنة التحقيق. تصميم فريد من نوعه يسمح الميبس لتوزيع موحد لاصقة PEG على طول التحقيق. الترابط الوجه رقاقة، أداة شائعة تستخدم في مجال الالكترونيات الدقيقة التعبئة والتغليف، وتمكن محاذاة دقيقة وقابلة للتكرار والمرفقات من لجنة التحقيق إلى الميبس. التحقيق والميبس يتم زرعها جراحيا معا، ثم يسمح للPEG حل بحيث يمكن استخراج الميبس ترك التحقيقفي المكان. أخيرا، يتم استخدام طريقة الاختبار في المختبر لتقييم استخراج الميبس في نموذج agarose هلام من أنسجة المخ. وقد أثبت هذا النهج لزرع مفيد لأطول تحقيقات مرنة (> 3 ملم). كما يوفر وسيلة عملية لزرع تحقيقات مرنة الوجهين. حتى الآن، وقد استخدمت هذه التقنية للحصول المختلفة في الجسم الحي تسجيل البيانات من القشرة الفئران.
Introduction
صفائف مسرى مكروي هي أداة أساسية في علم الأعصاب وكذلك التطبيقات السريرية الناشئة مثل الأطراف الصناعية. على وجه الخصوص، اختراق تحقيقات الكهربائي الجزئي تمكين التحفيز وتسجيل نشاط الخلايا العصبية من خلال اتصال وثيق مع الخلايا في الدماغ والحبل الشوكي، والأعصاب الطرفية. ويتمثل التحدي الرئيسي لتحقيقات العصبية المزروع هو الاستقرار وطول العمر من التحفيز وتسجيل وظائف. وقد اقترح النمذجة والدراسات التجريبية للتفاعل بين تحقيقات مسرى مكروي والأنسجة العصبية التي آلية واحدة للتدهور هو تمزيق الصغيرة من الأنسجة العصبية بسبب الحركة النسبية طفيف بين التحقيق والأنسجة 1-3. حل واحد هو افتعال تحقيقات المرنة التي تتناسب بشكل وثيق خصائص صلابة الأكبر من الأنسجة العصبية من أجل تقليل micromotion النسبية. على هذا النحو، وقد تم اعتماد حيويا البوليمرات رقيقة مثل بوليميد وparylene بمثابة ركائز مواتية لmicroelectrode تحقيقات 4-8.
A المقايضة تحقيقات مرنة هو أنها يصعب إدراجها في الأنسجة العصبية. وقد اتخذت الباحثين الطرق المختلفة لتسهيل الإدراج تحقيقات مرنة مع الحفاظ على الخصائص الميكانيكية مرغوب فيه. فئة واحدة من التصاميم يعدل هندسة البوليمر التحقيق لزيادة صلابة في أقسام أو محاور معينة مع الحفاظ على الامتثال في أجزاء أخرى. وقد تم إنجاز هذا من خلال دمج الأضلاع أو طبقات من المواد الأخرى 9،10. نهج آخر يدمج قناة 3-D في تصميم البوليمر التحقيق التي يتم ملؤها بمواد قابلة للتحلل 11. هذا التحقيق يمكن تشديد مؤقتا، وبعد الإدراج المواد في قناة يذوب والمصارف بها. ومع ذلك، قد طرق مثل هذه أن تعديل الشكل الهندسي للجهاز مزروع النهائية بشكل دائم تنازلات بعض الميزات المرغوب فيه لجنة التحقيق مرنة.
أسلوب واحد أن يفعل نبعد التمديد تغيير هندسة نتائج التحقيق النهائي هو لتغليف الجهاز البوليمر مع المواد القابلة للتحلل لتشديد مؤقتا الجهاز 12-14. ومع ذلك، المواد القابلة للتحلل نموذجية لديك أوامر معاملات الرجوعية الشباب من حجم أصغر من أن من السيليكون وبالتالي سوف تتطلب سمك أكبر لتحقيق نفس صلابة. طلاء كاف التحقيق يمكن أن يؤدي إلى مزيد من غيض مدورة أو حادة، مما يجعل الإدراج أكثر صعوبة. أيضا، منذ يتعرضون الطلاء ذوبان، هناك خطر منهم بحل فور الاتصال، أو حتى مقربة، مع الأنسجة.
فئة أخرى من طرق يستخدم المواد الركيزة التحقيق الرواية التي تقلل من تصلب في بعد أن زرعها في الأنسجة. وتشمل هذه المواد شكل البوليمرات الذاكرة 15 وبمركب متناهي في الصغر على التكيف ميكانيكيا 16. هذه المواد هي قادرة على انخفاض في معامل المرونة بشكل ملحوظ بعد الإدراج، ويمكن أن يؤدي إلى أن تحقيقات MATC عن كثبح الخواص الميكانيكية للأنسجة العصبية. ومع ذلك، فإن مجموعة تحقيقه من صلابة لا تزال محدودة، لذلك فإنها قد لا تكون قادرة على توفير مستوى عال جدا تعادل صلابة لالسيليكون أو التنغستن الأسلاك. وبالتالي في حالة مرنة تحقيقات التي هي طويلة جدا (على سبيل المثال> 3 ملم) أو التي لديها منخفضة للغاية وصلابة، وربما لا تزال هناك حاجة إلى طريقة لربط مؤقتا الميبس أكثر جمودا.
بعد طريقة واعدة أخرى ذكرت هو معطف مكوك تشنج مع الذاتي تجميع أحادي الطبقة الدائمة (SAM) لتخصيص سطح التفاعل بين المكوك والتحقيق مرنة 17. عندما تجف، والتحقيق تتمسك المكوك المغلفة كهربية. بعد الإدراج، يهاجر المياه على سطح ماء، وفصل لجنة التحقيق من المكوك بحيث يمكن استخراج المكوك. وقد تجلى استخراج المكوك مع انخفاض النزوح التحقيق (85 ميكرون). ومع ذلك، مع التفاعلات كهرباء الوحيد الذي عقد لجنة التحقيق لركان المكوك، هناك بعض المخاطر من التحقيق انزلاق النسبية للمكوك قبل وأثناء الإدراج.
قمنا بتطوير الطريقة التي يتم إرفاق التحقيق مرنة لالميبس بمادة لاصقة biodissolvable المؤقتة التي تتولى التحقيق بشكل آمن أثناء الإدراج. تم إجراء تحقيقات المستخدمة من بوليميد، والذي يحتوي على معامل المرونة بناء على أمر من 2-4 برنامج العمل العالمي. كانت ملفقة والميبس من السيليكون، مع معامل مرونة من ~ 200 برنامج العمل العالمي. عندما تعلق، وصلابة من السيليكون يهيمن، وتسهيل الإدراج. مرة واحدة إدراجها في الأنسجة، والمواد اللاصقة يذوب ويتم استخراج الميبس لاستعادة مسبار لمرونته الأولي. اخترنا غليكول البولي إيثيلين (PEG) كمادة لاصقة biodissolvable. وقد استخدمت في التطبيقات PEG المزروع مثل المجسات العصبية وهندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات 11،18،19. وقد اقترح بعض الأدلة على أن PEG قد تخفف استجابة neuroinflammatory في الدماغالأنسجة 18،20. مقارنة مع المواد الأخرى الممكنة، بما في ذلك السكروز، اللبنيك، وحامض الجليكوليك المشترك بولي (PLGA)، والبولي فينيل الكحول (PVA)، PEG لديه الوقت للانحلال في السوائل البيولوجية التي هي في حجم مناسب للعديد من العمليات الجراحية زرع (بناء على أمر من عشرات من الدقائق، اعتمادا على الوزن الجزيئي). بالإضافة إلى ذلك، فمن الصلبة في درجة حرارة الغرفة والسائلة في درجات حرارة تتراوح 50-65 درجة مئوية. هذه الخاصية يجعلها مناسبة بشكل خاص لدينا عملية التجميع الدقة. وعلاوة على ذلك، على غرار SAM صفها في 17، وحلت PEG هو ماء، وتسهيل استخراج الميبس. يتم تمكين هذا النهج المفيد من خلال تصميم الميبس الرواية وعملية التجميع المنهجي التي تضمن تغطية لاصقة موحدة ومحاذاة دقيقة وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى عملية التجميع، نقدم طريقة تنفيذ الميبس القابلة للإزالة أثناء الجراحة، وكذلك إجراء في المختبر لتقييم استخراج الأمراض المنقولة جنسياffener.
بروتوكول الواردة في هذه الوثيقة يفترض أن المستخدم يمتلك مرونة البوليمر مسرى مكروي التحقيق. من جانب البروتوكول المتعلق تلفيق من الميبس وتجميع هذا التحقيق إلى الميبس يفترض الوصول إلى الأدوات المشتركة التي وجدت في منشأة التصنيع الدقيق. البروتوكول المتعلق الإدراج واستخراج من المرجح أن يؤديها في مختبر علم الأعصاب المنحى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمعية دقق لالميبس
هذا القسم من بروتوكول يصف اختلاق الميبس السيليكون، والتجمع من البوليمر التحقيق الأغشية الرقيقة إلى الميبس. الشكل 1 يوضح نموذجية التحقيق البوليمر العصبية جنبا إلى جنب مع الميبس المقترحة. وترد تفاصيل التصميم الميبس في الشكل 2. ميزة الرواية من هذا التصميم هو الضحلة "فتل" قناة تعمل على طوله الذي يستخدم لتوزيع المواد اللاصقة السائلة خلال التجمع. الجزء الأوسع من الميبس هو المفتاح للتعامل مع التجمع، وخلال الإدراج الجراحية. خزان على علامة التبويب يتصل القناة. ملفقة المكون من السيليكون باستخدام عمليات التصنيع الدقيق القياسية.
- كانت ملفقة والميبس السيليكون مع قناة فتل من (SOI) رقاقة السيليكون على العازل بسماكة الطبقة جهاز مساو لسمك المطلوب من الميبس (
- وضع بيليه من البولي ايثلين جليكول (PEG) من الوزن الجزيئي 10،000 جم / مول في المكمن (الشكل 4). تسخين الميبس إلى 65 درجة مئوية بحيث PEG يذوب والفتائل في القناة عن طريق عمل شعري. ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لترسيخ. ويبين الشكل 5 تعيين التخطيطي للرقاقة بوندر الوجه متابعة. وضع الميبس رأسا على عقب على المسرح قاعدة رقاقة بوندر الوجه، ثم التقط الميبس مع رئيس الأداة. وضع مسبار رأسا على عقب على المسرح القاعدة. باستخدام رقاقة بوندر الوجه، محاذاة الميبس والتحقيق ومن ثم خفض الميبس وضعه على لجنة التحقيق.
- يجب أن يكون مرحلة قاعدة رقاقة بوندر الوجه عنصر التدفئة لتطبيق الحرارة إلى الركيزة. بعد وضع الميبس، تسخين التجمع مرة أخرى إلى 65 درجة مئوية. تسمح دقيقة واحدة لPEG لإعادة الصهر وتبدأ لملء في واجهة بين التحقيق والميبس. تبرد ليصلب.
- تحويل التجمع مرارا وتفتيش من أعلى. يسخن حسب الحاجة للسماح للPEG لملء تماما واجهة بين التحقيق والميبس. وهذا يمكن أن يتم تقييم بصريا منذ التحقيق شفافا. كما التجميع هو يجلس على المدفأة أعلى (التحقيق) الجانب الأعلى، وضع 1-3 البريد يدوياالكريات إكسترا الصلبة PEG على علامة التبويب بحيث تذوب على لجنة التحقيق، وتقديم تعزيزات إضافية في هذه المنطقة (الشكل 6). أخيرا، تسمح الجمعية لتبريد بحيث PEG يتصلب. عند هذه النقطة، والجمعية مستعدة لالإدراج الجراحية.
2. الإدراج واستخراج
- جبل الجمعية مسبار الميبس إلى مياداة مجهرية كما هو موضح في الشكل 7A من خلال الالتزام الجزء الخلفي من الميبس إلى الذراع مياداة مجهرية في المنطقة التبويب. ويمكن أن يتم هذا مع الشريط على الوجهين أو الأسمنت، ولكن الحرص على عدم الاتصال مع لجنة التحقيق لاصقة. تأمين مؤقتا نهاية موصل من لجنة التحقيق إلى مياداة مجهرية مع قطعة صغيرة من المعجون اللاصق بحيث يمكن إزالتها بسهولة مع قوة منخفضة.
- وضع التجمع التحقيق أكثر من هدف وإدراج التحقيق مع سرعة الإدراج المطلوب. واستخدمت سرعات الإدراج من ،13-،5 ملم / ثانية عند وضع هذا البروتوكول. </ لى>
- على الفور إزالة نهاية موصل من لجنة التحقيق من مياداة مجهرية بلطف وضعه على سطح القريبة، مثل الذراع مناور الثاني (الشكل 7B). ويجب أن يتم هذا قبل أن تبدأ PEG حل لتجنب تشريد التحقيق.
- إتاحة الوقت لPEG حل. وهذا القدر من الوقت تعتمد على PEG الوزن الجزيئي ومنطقة التماس بين لجنة التحقيق والميبس. على سبيل المثال، مع PEG الوزن الجزيئي من 10،000 جم / مول، تحقيقا مسرى مكروي حوالي 6 مم والميبس المطابقة التي هي 306 ميكرون واسع، وقد وجد 15 دقيقة أن تكون كمية كافية من الوقت. الباب 3 من البروتوكول يمثل طريقة لاختبار حل الوقت المطلوب. خلال هذا الوقت، وتطبيق الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام قطارة حول نقطة الإدراج إلى علامة التبويب وحل أي PEG الذي هو فوق الهدف (الشكل 7C).
- باستخدام micropositioner الآلية، تبدأ استخراج الميبس عن طريق تطبيق تشريد100 ميكرون بسرعة من 5 ملم / ثانية. هذه الحركة السريعة الأولية يساعد على التغلب على أي تقليل الاحتكاك الساكن والتحقيق النزوح. ثم، واستكمال استخراج الميبس بسرعة أبطأ من حوالي 0.1 ملم / ثانية (الشكل 7D).
- في حالة وجود الجراحة الفعلية، ومواصلة الإجراءات العادية لتطبيق هلام، السيليكون، و / أو الاكريليك الأسنان في موقع الإدراج إلى تأمين وحماية لجنة التحقيق، كما هو موضح في 21.
3. الاغاروز اختبار جل
يصف هذا الجزء من البروتوكول وإعداد وإجراء فحص استخراج الميبس في 0.6٪ agarose هلام يقارب الخصائص الميكانيكية الأكبر، ودرجة الحموضة، والملوحة من أنسجة المخ 17،22. منذ هلام شفاف تقريبا من خلال مسافات قصيرة، ويمكن ملاحظة فصل الميبس والتحقيق النزوح.
- تحضير محلول 0.6٪ الاغاروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مزج في وايلىدرجة الحرارة vated لتذوب تماما مسحوق الاغاروز. صب الحل في مربع الاكريليك الضحلة، وينبغي أن يكون جل 3/4- 1 في عميق. السماح للهلام وضعت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
- ضمان أن الجل تصلب مشبعة مع برنامج تلفزيوني بحيث لا تجف، وتسخين هلام إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد مياداة مجهرية، مربع من agarose هلام، ونظام كاميرا مجهرية كما هو موضح في الشكل 8.
- إدراج إشارة إيمانية الزجاج داخل منطقة الجزاء من هلام عن طريق تحريك ذلك بين جل والجانب من مربع (الشكل 8). استخدام معول الأسنان لمواجهة الميزات على إيمانية إشارة إلى مجال الرؤية من المجهر الرقمي.
- جبل التجمع التحقيق إلى مياداة مجهرية كما هو موضح في الخطوة 2.1.
- وضع التجمع التحقيق على هلام حوالي 1 ملم وراء إيمانية المرجعية.
- إدراج التحقيق في هلام، وذلك باستخدام كاميرا لترشدها إلى عمق المطلوب في مجال الرؤية. </ لى>
- على الفور نقل نهاية موصل من لجنة التحقيق للراحة على سطح قريب.
- إجراء أي تعديلات المطلوبة إلى صورة الكاميرا للتركيز على التحقيق (قد تكون الإشارة ملامح إيمانية قليلا من التركيز). أخذ لقطة من موقع التحقيق.
- تسمح بحل PEG (قد تختلف هذه المرة، في واقع الأمر قد تكون معلمة لفحصها). تطبيق برنامج تلفزيوني بالقرب من علامة التبويب حل PEG الذي هو فوق هلام.
- بدء التقاط الفيديو إذا رغبت، وتبدأ استخراج الميبس كما هو موضح في الخطوة 2.5. عند اكتمال الاستخراج، أخذ لقطة النهائي للموقع التحقيق.
- استخدام أدوات معالجة الصور لمقارنة الصور قبل وبعد استخراج الميبس. استخدام ميزات على إيمانية المرجعية التي هي واضحة في مجال الرؤية لتسجيل (محاذاة) الصور. معايرة حجم الصورة استنادا إلى حجم المزايا المعروفة على التحقيق. قياس المسافة من التحقيق النزوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدمت هذه التقنية الإدراج بالتزامن مع LLNL الأغشية الرقيقة تحقيقات بوليميد، التي مرت ISO 10993 معايير توافق مع الحياة ويقصد لزرع المزمنة. ويتضح نموذجي الأغشية الرقيقة بوليميد التحقيق في الشكل 1 جنبا إلى جنب مع الميبس السيليكون التي هي حوالي 10 مم طويل في المنطقة الضيقة. هذا الميبس واحد فتل قناة على امتداد طوله، كما هو مبين في الشكل 2 الشكل 3 يوضح عملية mimcrofabrication المستخدمة في إنشاء هذا الميبس من السيليكون. الشكل 4 يوضح بيليه من PEG الصلبة التي وضعت في خزان من علامة التبويب، كما يتضح من خلال الكاميرا على نظام رقاقة بوندر الوجه. مرة واحدة تم تسخينه باستخدام سخان بنيت في مرحلة قاعدة رقاقة بوندر الوجه، ذاب PEG وبدأ الفتيل في القناة. يسمح لنا عرض الكاميرا لمراقبة عملية فتل حتى PEG مليئة تماما القناة، whicاستغرق ساعة تقريبا ساعة مع PEG من الوزن الجزيئي 10،000 جم / مول. كان PEG ثم resolidified وتم تعيين التحقيق والميبس حتى في رقاقة بوندر الوجه كما هو مبين في الشكل 5. يبين الشكل 9A وجهة نظر العلوي من التحقيق والميبس بعد أن الانحياز والمرفقة، مع ملء PEG واجهة تماما. الشكل 9B يوضح مثال لفقاعة الهواء حيث PEG غير موجود بسبب وجود الجسيمات. الخطوة النهائية في التجمع هو لإضافة PEG إلى المنطقة التبويب على الجزء برقية لجنة التحقيق، لتعزيز اضافية خلال المناولة. منذ لن يتم إدراج هذا المجال إلى الهدف، فمن المقبول أن يكون لها حجم أكبر من PEG هنا، كما هو مبين في الشكل (6). وقد استخدم هذا الأسلوب التجمع إرفاق الأشكال المختلفة للتحقيقات إلى التقوية، بما في ذلك أجهزة متعددة السيقان، كما في هو مبين في الشكل 10.
وقد استخدم في المختبر الاغاروز هلام اختبار لqualitativتقييم اعل معلمات مختلفة مثل PEG الوزن الجزيئي، الوقت المسموح به لPEG إلى حل، والهندسة الميبس. مع كل مجموعة من PEG والهندسة الميبس، سمح لمبلغ محدد من الوقت للانحلال. ثم، جرت محاولة استخراج مع مراعاة التحقيق التشريد في الوقت الحقيقي. إذا تم سحب التحقيق بشكل كبير (> 200 ميكرون) دون فصل واضح أو انزلاق نسبة إلى الميبس، استنتجنا أن PEG لم المنحل بالكامل. يعطي الجدول 1 بعض الملاحظات ممثل PEG حل مع أوقات متفاوتة ومتباينة الوزن الجزيئي مع الميبس وهذا هو 6 مم طويل و 306 ميكرون واسع. ومن الملاحظات الأخرى في اختبارات لاحقة أنه عندما الميبس هو أكثر ضيقا (مثل 220 ميكرون)، تم حل PEG في وقت أقل (اقل من 5 دقائق). وهذا هو المرجح لأن منطقة التماس لاصقة وانخفضت ونتيجة لذلك، كان هناك حجم أصغر من PEG حل. المعلمات التي لم تظهر للتأثير PEG كانت حل أو التحقيق النزوح سمك الميبس (سمك تتراوح بين 20 إلى 100 ميكرومتر تم اختبار ميكرون)، وعدد من القنوات فتل (1 مقابل 3).
كما تم استخدام الاختبار في المختبر لتحديد متوسط النزوح التحقيق لاجراء تحقيق / الميبس / تكوين لاصقة معينة. في هذا المثال، تم إجراء الاختبار باستخدام تسلسل الإدراج / استخراج موضح في الشكل 7 حيث يتم إدخال مسبار التجمع الميبس في agarose هلام، يتم نقل نهاية الموصل إلى سطح قريب، ولا يسمح للPEG إلى حل، و يتم استخراج الميبس أخيرا ترك التحقيق في المكان. التجريبية التي أنشئت في الشكل 8 يبين التجمع مسبار الميبس تعلق على ذراع مياداة مجهرية وضعه فوق هلام. كان إيمانية إشارة شريحة زجاجية صغيرة مع مجموعة من النقاط الذهبية وضعت ضد مربع الاكريليك في مجال الرؤية من المجهر الرقمي.
> وكانت الأجهزة في هذا المثال ما يقرب من 10 ميكرون سميكة و536 ميكرون واسع مع ثمانية أقطاب قطرها 100 ميكرون. وتألفت آثار معدن كومة تي الاتحاد الافريقي ومنظمة الشفافية الدولية. كان الميبس السيليكون 220 ميكرون واسع، 6 مم و 50 ميكرون سميكة. تم إدراج التجمع مسبار الميبس حوالي 5 ملم في هلام. الشكل 11 يظهر لقطات قبل وبعد استخراج من الميبس من تجميع التحقيق الذي تم اختباره في agarose هلام. ملامح ضوء الذهب في الصور هي من إيمانية المرجعية وكانت تستخدم لميزات إشارة إلى محاذاة الصور مع بعضها البعض. تم استخدام الملعب المعروف بين الأقطاب (200 ميكرون) لمعايرة حجم بكسل، لأن هذا البعد هو أقل حساسية للتغيرات في عملية التصنيع. ويقدر صافي النزوح التحقيق بسبب استخراج الميبس لتكون 28 ± 9 ميكرون (المتوسط ± الخطأ القياسي، ن = 5).
حتى الآن، وقد تم تمديد الطريقة المقترحة لالفعلية جراحة امال في عدة مناسبات لزرع التحقيق في القشرة الفئران. بعد التجميع، تم تعقيمها التحقيق والميبس 50 ميكرون سميكة معا في ETOH في درجة حرارة الغرفة. أجريت الإدراج واستخراج مع مياداة مجهرية تعلق على الإطار التجسيمي. تم إدراج التجمع مسبار الميبس في 0.13 مم / ثانية حوالي 4 مم في القشرة من الفئران. بعد 15 دقيقة، تم استخراج الميبس، وترك التحقيق في المكان. بعد الشفاء من الجراحة والتسجيلات العصبية، كما هو مبين في الشكل 12، تم الحصول عليها بنجاح من الحيوان مستيقظا مما يدل على جدوى هذا الأسلوب في العمليات الجراحية الحقيقية 23. كما تم استخدام هذه التقنية للحصول على زرع في الجسم الحي تسجيلات مع صفائف الوجهين التي لديها الأقطاب على كل من الجانبين الأمامي والخلفي، كما هو مبين في الشكل 13.
pload/50609/50609fig1.jpg "/>
الشكل 1. التخطيطي لجنة التحقيق العصبية نموذجية والميبس المقترحة. نموذجي رقيقة فيلم البوليمر التحقيق لديه أقطاب واحد أو أكثر على نهاية التحقيق. آثار المعدن تدار من الأقطاب الكهربائية على طول الجزء الكابل وإنهاء على وسادة موصول إلى موصل كهربائي. طول الميبس (في هذه الحالة حوالي 10 مم) يعتمد على عمق الإدراج لجنة التحقيق، وعلامة تبويب أوسع على الميبس يسمح للمناولة. (صورة المجاملة ديانا جورج)
الشكل 2. الميبس تفاصيل التصميم. قناة فتل يستغل عمل شعري لتوزيع مادة لاصقة السائل الذي أودعت في الخزان. الخزان على علامة التبويب المنطقة الأوسع التي تسهل التعامل معها. (صورة المجاملة ديانا جورج)
"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 3. تسلسل تلفيق لالميبس السيليكون. وملفقة الميبس السيليكون على عازل السيليكون على (SOI) رقاقة (A) أولا القنوات فتل جافة محفورا باستخدام عملية بوش القياسية (B). التالي، يتم تعريف الهندسة الميبس قبل حفر أطول أن يتوقف على طبقة أكسيد دفن (C) وأخيرا، يتم الإفراج عن التقوية عن طريق الحفر الرطب طبقة أكسيد دفن في حمض الهيدروفلوريك 49٪ (D).
الشكل 4. غليكول البولي إثيلين في الخزان الميبس. وتقشر من البولي ايثلين جليكول وضعها في خزان للالميبس. مرة واحدة ساخنة، وسوف تذوب، وملء الخزان، وتدفقفي القناة فتل.
الرقم 5. التخطيطي من الوجه رقاقة الترابط. يقام الميبس مع قناة بنسبة فراغ على رأس أداة من بوندر الوجه رقاقة. التحقيق العصبية تقع على مرحلة الأساس وجهه لأسفل.
الرقم 6. البولي ايثيلين جلايكول على علامة التبويب الميبس. يتم تطبيق إضافي البولي ايثيلين جلايكول بسخاء على علامة تبويب الميبس كتعزيز. الجزء برقية مسبار بوليميد مرئيا على رأس الميبس.
الرقم 7. التخطيطي فيsertion وتسلسل الاستخراج. أ) يتم إدراج التجمع مسبار الميبس في الأنسجة باستخدام مياداة مجهرية. B) يتم نقل نهاية موصل إلى السطح في مكان قريب. C) برنامج تلفزيوني هو تطبيق حل PEG على علامة تبويب الميبس. D) يتم استخراج الميبس، وترك التحقيق في الهدف.
الرقم 8. تعيين في المختبر اختبار ما يصل. والتي أنشئت من أجل الإدراج اختبار التحقيق واستخراج الميبس في 0.6٪ agarose هلام في الفوسفات مخزنة المالحة. يتم إرفاق التجمع مسبار الميبس إلى الذراع مياداة مجهرية وضعه فوق الهدف هلام قرب إيمانية المرجعية. ويستخدم مجهر رقمي لمراقبة التحقيق والميبس في agarose هلام.
الرقم 9. بحث انضمت إلى الميبس. أ) أعلى نظرا التحقيق تعلق على الميبس مع محاذاة جيدة وتغطية كاملة لاصقة. B) مثال على وجود فجوة في التغطية لاصقة بسبب الجسيمات.
الرقم 10. مثال على التحقيق متعددة السيقان. تم استخدام عملية التجميع المقترحة لإرفاق هذا التحقيق أربعة عرقوب إلي الميبس السيليكون مطابقة.
الرقم 11. مثال على نتائج استخراج الميبس. لقطات من قبل (أعلى) وبعد (أسفل) استخراج الميبس مع بوليميد التحقيق الأغشية الرقيقة في agarose هلام. النقاط هي على ضوء الذهبتستخدم الإشارة إيمانية وعن ميزات المرجعية لمقارنة الصور وقياس التحقيق النزوح. نزوح تقدر لجنة التحقيق هو 28 ± 9 ميكرون (المتوسط ± الخطأ القياسي، ن = 5).
الرقم 12. مثال التسجيلات الفسيولوجية. تم الحصول على هذه المسامير الخلايا العصبية واحدة من التحقيق مسرى مكروي مرنة مزروع مع الميبس القابلة للإزالة كما هو موضح في هذا البروتوكول.
الرقم 13. التسجيلات LFP من الوجهين التحقيق. الإدراج مع تمكين الميبس اختبار القابلة للإزالة من مجموعة المرنة التي كان أقطاب كهربائية على كل من الجبهة والسطوح الخلفي. أظهرت هذه التسجيلات LFP جالأداء الكهربائي omparable على كلا الجانبين بعد الزرع.
| PEG حله بعد: | |||||
| طول المسبار (ملم) | عرض الميبس (ميكرومتر) | PEG الوزن الجزيئي (ز / مول) | 10 دقيقة | 15 دقيقة | 30 دقيقة |
| 6 | 306 | 6،000 | نعم | نعم | |
| 10،000 | نعم | ||||
| 20،000 | لا | نعم | |||
الجدول 1. PEG الوقت في حل 0.6٪ agarose هلام. ملاحظات على حل PEG ذات أوزان جزيئية مختلفةيستخدم لإرفاق التحقيق مرنة لالميبس السيليكون، بعد كميات متفاوتة من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يوفر عملية تسيطر عليها بشكل جيد لنعلق تحقيقات البوليمر الأغشية الرقيقة إلى التقوية منفصلة مع مادة لاصقة biodissolvable. كما قدم هو إجراء العمليات الجراحية الموصى بها لتنفيذ هذه التقوية القابلة للإزالة وتقنية للتحقق من صحة الإجراءات المتبعة في المختبر لتكوين مسبار الميبس معين. منذ الميبس يمكن إجراء تعسفي جامدة، ويمكن للطريقة تسهيل الإدراج تحقيقات طويلة نسبيا (> 3 ملم). على هذا النحو، ومن المتوقع أن تكون التكنولوجيا مواتية للتطبيقات في التحفيز العميق الدماغ (DBS)، وتحفيز الحبل الشوكي، والأعصاب الطرفية واجهات طريقة الإدراج.
والميبس الرواية مع قناة فتل وعملية التجميع الوجه رقاقة تستند هي مناسبة لمختلف المواد وتكوينات التحقيق. هندسيا، ليس لديها الميبس لمطابقة البصمة التحقيق ويمكن، على سبيل المثال، يكون أضيق من التحقيق. سمك الأمراض المنقولة جنسيا ffener قد تختلف أيضا. في حين وصفناها الميبس مصنوعة من السيليكون، مع مواد أخرى، قد يكون من الممكن تحقيق الخواص الميكانيكية أكثر من المرغوب فيه لبعض التطبيقات. عملية التجميع هو أيضا مناسبة لأنواع أخرى من المواد اللاصقة السائلة. PEG من السهل بشكل خاص للعمل مع لقدرته على أن يتعزز ومذاب ثانية عدة مرات. في حالة غيره من المواد اللاصقة السائلة التي ليس لديها هذه الخاصية، قد تحتاج عملية التجميع إلى تعديل. فمن الممكن استخدام الوزن الجزيئي مختلفة لPEG. وهناك ارتفاع الوزن الجزيئي يستغرق وقتا أطول في حل، والتي قد يكون من المرغوب فيه أثناء الجراحة. فإن منطقة الاتصال بين التحقيق والميبس تؤثر أيضا على الوقت اللازم لتذوب لاصقة بعد التحقيق الإدراج. فمن المستحسن أن التكوين مسبار الميبس مع الوزن الجزيئي اختار فحصها في المختبر كما هو موضح في القسم 3 لتوصيف الوقت اللازم لتذوب لاصقة.
_content "> وجدنا أن السيطرة على وجه التحديد سرعة استخراج أمر بالغ الأهمية لاستخراج الميبس مع الحد الأدنى من التحقيق النزوح. على وجه التحديد، وهي حركة سريعة الأولية يساعد على التغلب على الاحتكاك الساكن وفصل الميبس من التحقيق. بعد هذا، ما تبقى من استخراج يمكن تستكمل بسرعة أبطأ مع ضئيلة إضافية النزوح التحقيق، كما لوحظ في الاختبار agarose هلام. العديد من مختبرات علم الأعصاب استخدام نظم التجسيمي KOPF، وهناك وحدة mircopositioner بمحركات من KOPF (eg نموذج 2662) التي يمكن أن تضاف إلى هذه الأنظمة. اخترنا المحرك نيوبورت آلية لأنه كان الأداء الديناميكي مماثلة، ولكن كان أقل تكلفة، وكان أكثر مرونة التحكم في سرعة. (وكان من الضروري لصنع شريحة بسيطة لنعلق المحرك إلى نظام micropositioner لدينا.) نظام KOPF يمكن تطبيق اثنين من استخراج بسرعة مماثلة للبروتوكول وضعنا، ولكن الحد الأقصى لسرعة المحرك KOPF هو 4 ملم / ثانية، في حينكنا 5 ملم / ثانية لتشريد الأولي باستخدام نيوبورت المحرك.خلال في المختبر والمجراة في الاختبار، تم إجراء الإدراج في التجمع مسبار الميبس إما مع مياداة مجهرية مدفوعة يدويا، أو مياداة مجهرية الآلية، مع سرعات تتراوح ،13-،5 ملم / ثانية. لم يلاحظ أي ضرر أو التبطين من التحقيق. لم يتم تقييمها بسرعة الإدراج أعلى لتحديد مخاطر الأضرار التي لحقت التجمع مسبار الميبس.
تعديلات على إجراءات الإدراج / استخراج في التقدم لجعل العملية أكثر قوة. على وجه الخصوص، وهي خطوة حساسة للغاية تتحرك نهاية موصل من لجنة التحقيق الخروج من مياداة مجهرية على سطح قريب. هناك خطر في هذه الخطوة من إزعاج لجنة التحقيق قبل أن يتم تأمينها. فمن الممكن أيضا أن ينحني في كابل يمكن أن يسبب الإجهاد على الجزء المدرج من لجنة التحقيق، مما أدى إلى تشريد غير مقصودة لجنة التحقيقبعد استخراج الميبس. حاليا، يتم تخفيف هذه المخاطر باستخدام مسبار مع الكابل الذي هو 2.5 سم على الأقل طويلة. ومع ذلك، من المرغوب فيه أن عملية الإدراج / استخراج تكون أقل اعتمادا على تصميم التحقيق. سوف التعديلات إلى نهاية أداة مياداة مجهرية أو إضافة تنظيم المواعيد التي يمكن أن تدعم مؤقتا موصل المرجح تسمح استخراج أكثر موثوقية من الميبس.
هناك العديد من الأسئلة المفتوحة التي يمكن أن تؤدي إلى دراسات مستقبلية تمتد من هذا الأسلوب. الأولى، في حين وفرت 0.6٪ هلام الاغاروز تحليل التصوير المعروفة في المختبر بديل أنسجة المخ وسمح التحقيق من التشرد، فإنه لا تكرار بالضبط أنسجة المخ. هناك حاجة لدراسات لفحص الموقع والنزوح من لجنة التحقيق في الجسم الحي. ثانيا، هناك حاجة إلى زرع المدى الطويل والاختبار النسيجي لتحديد فوائد التحقيق مرنة مع الميبس القابلة للإزالة. يمكن تحقيق مثل هذه الدراسات النظريةأن الامتثال التحقيق يقلل micromotion ويمتد الأداء الكهربائي. أخيرا، سيكون من المفيد لتوصيف أكثر دقة معدل تدهور PEG. هذا يمكن أن يساعد في ضبط أفضل من المرات حل لاحتياجات معينة الجراحية. يمكن لهذه القياسات أيضا تحديد متى يبقى PEG المنحل بين التحقيق والميبس، وهو أمر مهم لأن طبيعة ماء من PEG يسهل استخراج الميبس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIDCD Y1-DC-8002-01. تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة في الولايات المتحدة من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني في إطار العقد DE-AC52-07NA27344.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol, 10,000 g/mol | Sigma Aldrich | 309028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Flexible Sub-micron Die Bonder | Finetech | Fineplacer lambda | |
| Micromanipulator | KOPF | 1760-61 | |
| Digital Microscope | Hirox | KH-7700 | |
| Dual Illumination Revolver Zoom Lens | Hirox | MXG-2500REZ | |
| Precision Motorized Actuator | Newport | LTA-HS | w/ CONEX-CC controller |
References
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Lee, Y. T., Hitchcock, R. W., Bridge, M. J., Tresco, P. A. Chronic response of adult rat brain tissue to implants anchored to the skull. Biomaterials. 25 (12), 2229-2237 (2004).
- Subbaroyan, J., Martic, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2, 103-113 (2005).
- Lacour Sun, Y., S,, et al. Assessment of the biocompatibility of photosensitive polyimide for implantable medical device use. Journal of Biomedical Materials Research A. 90 (3), 648-655 (2009).
- Kipke, D. R., Pellinen, D. S., Vetter, R. J. Advanced neural implants using thin-film polymers. IEEE International Symposium on Circuits and Systems. 4, 173-176 (2002).
- Mercanzini, A., Cheung, K., et al. Demonstration of cortical recording using novel flexible polymer neural probes. Sensors and Actuators A. 143, 90-96 (2008).
- Stieglitz, T. Flexible biomedical microdevices with double-sided electrode arrangements for neural applications. Sensor and Actuators A. 90, 203-211 (2001).
- Tooker, A., Tolosa, V., Shah, K. G., Sheth, H., Felix, S., Delima, T., Pannu, S. Polymer neural interface with dual-sided electrodes for neural stimulation and recording. Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society. , 5999-6002 (2012).
- Parylene microprobes with engineered stiffness and shape for improved insertion. Egert, D., Peterson, R. L., Najafi, K. Proceedings of Transducers '11, Beijing, China, , (2011).
- Lee, K. -K., He, J., et al. Polyimide-based intracortical neural implant with improved structural stiffness. Journal of Micromechanics and Microengineering. 14, 32-37 (2004).
- Takeuchi, S., Ziegler, D., et al. Parylene flexible neural probes integrated with microfluidic channels. Lab On A Chip. 5, 519-523 (2005).
- Improving mechanical stiffness of coated benzocyclobutene (bcb) based neural implant. Singh, A., Zhu, H., He, J. Proceeding of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, , 4298-4301 (2004).
- Lewitus, D., Smith, K. L., et al. Ultrafast resorbing polymers for use as carriers for cortical neural probes. Acta Biomaterialia. 7, 2483-2491 (2011).
- An ultra-compliant, scalable neural probe with molded biodissolvable delivery vehicle. Gilgunn, P. J., Khilwani, R., et al. Proceedings of the 2012 IEEE 25th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), , 56-59 (2012).
- Ware, T., Simon, D., et al. Fabrication of responsive, softening neural interfaces. Advanced Functional Materials. 22 (16), 3470-3479 (2012).
- Harris, J. P., Capadona, J. R., et al. Mechanically adaptive intracortical implants improve the proximity of neuronal cell bodies. Journal of Neural Engineering. 8, 1-13 (2011).
- Kozai, T. D. Y., Kipke, D. R. Insertion shuttle with carboxyl terminated self-assembled monolayer coatings for implanting flexible polymer neural probes in the brain. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 199-205 (2009).
- Bjugstad, K. B., Lampe, D. S., Kern, D. S., Mahoney, M. Biocompatibility of poly(ethylene glycol)-based hydrogels in the brain: An analysis of the glial response across space and time. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (1), 79-91 (2010).
- Greenwalk, R. B., Choe, Y. H., McGuire, J., Conover, C. D. Effective drug delivery by pegylated drug conjugates. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 217-250 (2003).
- Effects of adsorbed proteins and an antifouling agent on the impedance of silicon-based neural microelectrodes. Sommakia, S. S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Proceedings of the 31st Annual IEEE EMBC International Conference, , 7139-7142 (2009).
- Gage, G. J., Stoetzner, C. R., Richner, T., Brodnick, S. K., Williams, J. C., Kipke, D. R. Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals. J. Vis. Exp. (60), e3565 (2012).
- Chen, Z. -J., Gillies, G. T., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive. Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, , 871-874 (2012).
