Summary
लचीला तंत्रिका microelectrode जांच की प्रविष्टि polyethylene glycol (खूंटी) के साथ कठोर stiffeners को जांच संलग्न द्वारा सक्षम है. एक अनूठी विधानसभा प्रक्रिया वर्दी और repeatable लगाव सुनिश्चित करता है. ऊतक में सम्मिलन के बाद, खूंटी घुल और दृढकारी निकाला जाता है. इन विट्रो परीक्षण विधि agarose जेल में तकनीक का मूल्यांकन करता है.
Abstract
लचीला सामग्री micromotion की वजह से प्रतिकूल ऊतक प्रतिक्रिया को कम कर सकता है क्योंकि biocompatible पतली फिल्म बहुलक से बना रहे हैं कि तंत्रिका इंटरफ़ेस उपकरणों के लिए microelectrode सरणियों कार्यात्मक जीवनकाल बढ़ाया है की संभावना है. हालांकि, उनके लचीलेपन सही तंत्रिका ऊतक में डाला जा रहा से रोकता है. यह लेख अस्थायी रूप से जांच की सटीक, शल्य चिकित्सा सुविधा के लिए सम्मिलन biodissolvable polyethylene glycol (खूंटी) का उपयोग कर एक कठोर दृढकारी के लिए एक लचीला microelectrode जांच संलग्न करने के लिए एक विधि को दर्शाता है. एक अनूठी दृढकारी डिजाइन जांच की लंबाई के साथ खूंटी चिपकने के समान वितरण के लिए अनुमति देता है. फ्लिप चिप संबंध, माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक पैकेजिंग में इस्तेमाल एक आम उपकरण, दृढकारी के लिए सटीक और repeatable संरेखण और जांच की कुर्की सक्षम बनाता है. जांच और दृढकारी शल्य चिकित्सा द्वारा फिर खूंटी दृढकारी जांच छोड़ने निकाला जा सकता है तो उस भंग करने की अनुमति दी है, साथ में प्रत्यारोपित कर रहे हैंजगह में. अंत में, एक में इन विट्रो परीक्षण विधि मस्तिष्क के ऊतकों की एक agarose जेल मॉडल में दृढकारी निकासी का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आरोपण के लिए यह दृष्टिकोण (> 3 मिमी) लंबे समय तक लचीला जांच के लिए विशेष रूप से फायदेमंद साबित हो गया है. यह भी दोहरी तरफा लचीला जांच प्रत्यारोपण करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है. तिथि करने के लिए, तकनीक चूहा प्रांतस्था से विभिन्न vivo में रिकॉर्डिंग डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
Introduction
Microelectrode सरणियों एक तंत्रिका विज्ञान में आवश्यक उपकरण के रूप में भी इस तरह के कृत्रिम अंग के रूप में उभर नैदानिक आवेदन कर रहे हैं. विशेष रूप से, मर्मज्ञ सूक्ष्म इलेक्ट्रोड जांच मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी, और परिधीय नसों में कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क के माध्यम से neuronal गतिविधि की उत्तेजना और रिकॉर्डिंग सक्षम. प्रत्यारोपित तंत्रिका जांच के लिए एक बड़ी चुनौती उत्तेजना और रिकॉर्डिंग कार्यों की स्थिरता और दीर्घायु है. Microelectrode जांच और तंत्रिका ऊतक के बीच बातचीत का मॉडलिंग और प्रायोगिक अध्ययन गिरावट के लिए एक तंत्र की वजह से जांच और ऊतक 1-3 के बीच मामूली सापेक्ष गति के लिए तंत्रिका ऊतक के सूक्ष्म फाड़ है कि सुझाव दिया है. एक समाधान के लिए और अधिक बारीकी से रिश्तेदार micromotion कम करने के लिए तंत्रिका ऊतक के थोक कठोरता गुणों से मेल खाने वाली लचीला जांच को बनाना है. जैसे, ऐसे Polyimide और parylene रूप biocompatible पतली फिल्म पॉलिमर microelec के लिए अनुकूल substrates के रूप में अपनाया गया हैtrode 4-8 जांचता है.
लचीला जांच की एक tradeoff वे तंत्रिका ऊतक में सम्मिलित करने के लिए मुश्किल हो रहा है. शोधकर्ताओं ने वांछनीय यांत्रिक गुणों के संरक्षण, जबकि लचीला जांच की प्रविष्टि की सुविधा के लिए विभिन्न तरीकों में ले लिया है. डिजाइनों में से एक वर्ग अन्य भागों में अनुपालन को बनाए रखते हुए कुछ वर्गों या कुल्हाड़ियों में कठोरता को बढ़ाने के लिए बहुलक जांच ज्यामिति को संशोधित करता है. इस पसलियों या अन्य सामग्री 9,10 की परतों को शामिल करके पूरा किया गया है. एक और दृष्टिकोण biodegradable सामग्री 11 से भर जाता है कि बहुलक जांच डिजाइन में एक 3 डी चैनल एकीकृत करता है. यह जांच अस्थायी रूप से stiffened, और किया जा सकता है चैनल घुल और नालियों बाहर में सम्मिलन सामग्री के बाद. हालांकि, स्थायी रूप से अंतिम प्रत्यारोपित डिवाइस की ज्यामिति को संशोधित कि इन जैसे तरीकों लचीला जांच के वांछित सुविधाओं में से कुछ समझौता हो सकता है.
N करता है कि एक विधिअंतिम जांच ज्यामिति बदल ओ.टी. अस्थायी रूप से डिवाइस 12-14 ठोस बनाना biodegradable सामग्री के साथ बहुलक डिवाइस encapsulate करने के लिए है. हालांकि, ठेठ biodegradable सामग्री सिलिकॉन की तुलना में छोटे परिमाण की यंग moduli आदेश दिया है और फलस्वरूप एक ही कठोरता को प्राप्त करने के लिए बड़ा मोटाई की आवश्यकता होगी. पर्याप्त रूप से जांच प्रविष्टि और अधिक कठिन बना, एक और गोल या कुंद टिप में परिणाम कर सकते हैं कोटिंग. गलाऊ कोटिंग्स उजागर कर रहे हैं के बाद से ही, ऊतक के साथ एक संपर्क पर तुरंत भंग उनमें से जोखिम, या यहां तक कि करीब निकटता, वहाँ है.
तरीकों का एक अन्य वर्ग के ऊतकों में प्रत्यारोपित होने के बाद कठोरता में कम है कि उपन्यास जांच सब्सट्रेट सामग्री का उपयोग करता है. इस तरह की सामग्री आकार स्मृति पॉलिमर 15 और एक यंत्रवत् अनुकूली nanocomposite 16 में शामिल हैं. इन सामग्रियों में प्रविष्टि के बाद काफी लोचदार मापांक में कमी कर रहे हैं, और अधिक बारीकी से matc कि जांच में परिणाम कर सकते हैंतंत्रिका ऊतक के घंटे यांत्रिक गुणों. हालांकि, कठोरता से प्राप्त रेंज अभी भी सीमित है, इसलिए वे सिलिकॉन या टंगस्टन तारों को बहुत उच्च कठोरता समकक्ष प्रदान करने में सक्षम नहीं हो सकता है. इस प्रकार बहुत कम कठोरता है बहुत लंबी (जैसे> 3 मिमी) या कि हैं कि लचीला जांच के मामले में अस्थायी रूप से एक और अधिक कठोर दृढकारी संलग्न की एक विधि अभी भी आवश्यक हो सकता है.
रिपोर्ट की अभी तक एक और होनहार विधि कोट करने के लिए शटल और लचीला जांच 17 के बीच सतह बातचीत अनुकूलित करने के लिए एक स्थायी स्वयं कोडांतरण monolayer (एसएएम) के साथ एक stiffening शटल है. जब सूखे, जांच electrostatically लेपित शटल का पालन करता है. प्रविष्टि के बाद, पानी शटल निकाला जा सकता है, ताकि शटल से जांच को अलग करने, हाइड्रोफिलिक सतह पर प्रवास करती है. कम जांच विस्थापन के साथ शटल निष्कर्षण (85 माइक्रोन) का प्रदर्शन किया गया था. हालांकि, केवल electrostatic बातचीत करने के लिए टी जांच जोत के साथवह शटल, सम्मिलन से पहले और दौरान शटल के सापेक्ष जांच फिसलन के कुछ जोखिम है.
हम लचीला जांच सुरक्षित रूप से प्रविष्टि के दौरान जांच रखती है कि एक अस्थायी biodissolvable चिपकने वाला पदार्थ के साथ एक दृढकारी से जुड़ा हुआ है जिसमें एक विधि विकसित की है. प्रयोग किया जांच 2-4 GPa के आदेश पर एक लोचदार मापांक है जो Polyimide, के बने थे. दृढकारी ~ 200 GPa के एक लोचदार मापांक साथ, सिलिकॉन से निर्मित किया गया था. संलग्न करते हैं, सिलिकॉन की कठोरता प्रविष्टि की सुविधा हावी है. एक बार ऊतक में डाला, चिपकने वाला पदार्थ घुल और दृढकारी अपनी प्रारंभिक लचीलापन जांच बहाल करने के लिए निकाला जाता है. हम biodissolvable चिपकने वाला पदार्थ के रूप में पॉलीथीन glycol (खूंटी) का चयन किया. खूंटी ऐसे तंत्रिका जांच, ऊतक इंजीनियरिंग, और दवा वितरण 11,18,19 रूप में प्रत्यारोपित अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है. कुछ सबूत खूंटी मस्तिष्क में neuroinflammatory प्रतिक्रिया attenuate सकता है कि सुझाव दिया गया हैऊतक 18,20. सुक्रोज, पाली लैक्टिक सह एसिड (PLGA), और polyvinyl शराब (PVA) सहित अन्य संभव सामग्री, की तुलना में, खूंटी के आदेश पर (कई प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए एक उचित स्तर की है कि जैविक तरल पदार्थ में एक विघटन समय है आणविक वजन पर निर्भर करता है मिनट के दसियों,). इसके अलावा, यह लेकर तापमान पर कमरे के तापमान और तरल पर ठोस है 50-65 डिग्री सेल्सियस से यह गुण हमारे परिशुद्धता विधानसभा की प्रक्रिया के लिए यह विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है. इसके अलावा, सैम के लिए इसी तरह की 17 में वर्णित है, भंग खूंटी दृढकारी की निकासी की सुविधा, हाइड्रोफिलिक है. यह फायदेमंद दृष्टिकोण वर्दी चिपकने वाला कवरेज और सटीक और repeatable संरेखण सुनिश्चित जो एक उपन्यास दृढकारी डिजाइन और व्यवस्थित विधानसभा की प्रक्रिया से सक्षम है. विधानसभा की प्रक्रिया के अलावा, हम सर्जरी के दौरान हटाने योग्य दृढकारी को लागू करने की विधि है, साथ ही एसटीआई की निकासी का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो प्रक्रिया पेशffener.
इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता एक लचीला बहुलक microelectrode जांच के पास रखती है. एक दृढकारी को इस जांच का दृढकारी और विधानसभा के निर्माण से संबंधित प्रोटोकॉल का हिस्सा एक microfabrication सुविधा में पाया आम उपकरणों के लिए उपयोग हो जाती है. सम्मिलन और निकासी से संबंधित प्रोटोकॉल की संभावना एक तंत्रिका विज्ञान उन्मुख प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जाएगा.
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Protocol
1. दृढकारी जांच की सभा
प्रोटोकॉल के इस खंड दृढकारी के लिए एक सिलिकॉन दृढकारी का निर्माण, और एक पतली फिल्म बहुलक जांच की विधानसभा का वर्णन करता है. 1 प्रस्तावित दृढकारी के साथ एक ठेठ बहुलक तंत्रिका जांच दिखाता है चित्रा. दृढकारी डिजाइन के विवरण चित्रा 2 में दिखाया गया. इस डिजाइन के उपन्यास सुविधा चैनल विधानसभा के दौरान तरल चिपकने वाला वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो इसकी लंबाई के साथ चल रहा है "wicking" उथला है. दृढकारी के व्यापक हिस्से को विधानसभा और शल्य प्रविष्टि के दौरान निपटने के लिए एक टैब है. टैब पर एक जलाशय चैनल को जोड़ता है. घटक मानक microfabrication प्रक्रियाओं का उपयोग सिलिकॉन से निर्मित है.
- एक wicking चैनल के साथ सिलिकॉन दृढकारी दृढकारी की इच्छित मोटाई के बराबर एक युक्ति परत मोटाई के साथ एक सिलिकॉन पर इन्सुलेटर (एसओआई) मे (से गढ़ा गया था
- जलाशय में आणविक वजन 10,000 छ / mol की पॉलीथीन ग्लाइकॉल की एक गोली (खूंटी) (चित्रा 4) रखें. खूंटी पिघला देता है और केशिका क्रिया द्वारा चैनल में wicks इतना है कि 65 डिग्री सेल्सियस तक दृढकारी गरम करें. फिर जमना को कमरे के तापमान को शांत करते हैं. चित्रा 5 चिप फ्लिप bonder के एक योजनाबद्ध की स्थापना से पता चलता है. तब उपकरण सिर के साथ दृढकारी लेने, उल्टा फ्लिप चिप bonder के आधार मंच पर दृढकारी रखें. उल्टा आधार मंच पर जांच जगह. फ्लिप चिप bonder का प्रयोग, दृढकारी और जांच संरेखित और फिर दृढकारी कम है और जांच पर यह जगह.
- फ्लिप चिप bonder के आधार चरण सब्सट्रेट करने के लिए गर्मी लागू करने के लिए एक हीटिंग तत्व होना चाहिए. दृढकारी रखने के बाद, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए एक बार फिर से विधानसभा में गर्मी खूंटी के लिए एक मिनट remelt और जांच और दृढकारी के बीच इंटरफेस में भरने के लिए शुरू करने की अनुमति. जमना शांत करने के लिए.
- पर विधानसभा की बारी है और ऊपर से निरीक्षण किया. खूंटी पूरी तरह से जांच और दृढकारी बीच इंटरफेस को भरने के लिए अनुमति देने के लिए जरूरत के रूप में गर्म कर लें. जांच पारदर्शी है क्योंकि यह नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता. विधानसभा शीर्ष (जांच) ऊपर की ओर हीटर पर बैठा है, मैन्युअल रूप से 1-3 ई जगहटैब पर ठोस खूंटी के एक्स्ट्रा छर्रों वे इस क्षेत्र में अतिरिक्त सुदृढीकरण (चित्रा 6) प्रदान करने, जांच के ऊपर पिघला सकें. अंत में, विधानसभा खूंटी solidifies कि इतना शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. इस बिंदु पर, विधानसभा शल्य प्रविष्टि के लिए तैयार है.
2. निवेशन और निष्कर्षण
- टैब क्षेत्र में micromanipulator हाथ करने के लिए दृढकारी के पीछे पालन करके चित्रा 7A में सचित्र के रूप में एक micromanipulator से जांच दृढकारी विधानसभा माउंट. यह दो तरफा टेप या सीमेंट के साथ किया, लेकिन चिपकने के साथ जांच संपर्क करने के लिए नहीं ख्याल रखना हो सकता है. यह अस्थायी रूप से आसानी से कम बल के साथ हटाया जा सकता है कि इस तरह के चिपकने पोटीन के एक छोटे से टुकड़े के साथ micromanipulator से जांच की कनेक्टर सिरे सुरक्षित.
- लक्ष्य से अधिक जांच विधानसभा की स्थिति और यात्रा की प्रविष्टि की गति के साथ जांच डालें. इस प्रोटोकॉल के विकास जब 0.13-0.5 मिमी / सेकंड की प्रविष्टि गति का उपयोग किया गया. </ ली>
- इसके तत्काल बाद धीरे micromanipulator से जांच की कनेक्टर सिरे को हटाने और इस तरह एक दूसरे जोड़तोड़ हाथ (चित्रा 7B) के रूप में, पास के एक सतह पर आराम. खूंटी जांच विस्थापन से बचने के लिए भंग करने के लिए शुरू होता है इस से पहले किया जाना चाहिए.
- खूंटी को भंग करने के लिए समय की अनुमति दें. समय की यह राशि खूंटी आणविक वजन और जांच और दृढकारी के बीच संपर्क के क्षेत्र पर निर्भर करेगा. उदाहरण के लिए, 10,000 छ / mol, एक microelectrode जांच के बारे में 6 मिमी और विस्तृत 306 माइक्रोन है कि एक मेल दृढकारी की खूंटी आणविक वजन के साथ 15 मिनट के समय की एक पर्याप्त राशि होना पाया गया है. प्रोटोकॉल की धारा 3 आवश्यक विघटन समय परीक्षण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. इस समय के दौरान, लक्ष्य (चित्रा 7C) ऊपर है कि किसी भी खूंटी भंग करने के लिए टैब और सम्मिलन बिंदु के आसपास एक dropper का उपयोग फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) लागू होते हैं.
- एक मोटर चालित micropositioner का उपयोग करना, की एक विस्थापन लगाने से दृढकारी की निकासी शुरू5 मिमी / सेकंड की गति से 100 माइक्रोन. यह प्रारंभिक तेज गति किसी भी स्थिर घर्षण को दूर करने और जांच के विस्थापन को कम करने में मदद करता है. फिर, लगभग 0.1 मिमी / सेकंड (चित्रा 7 दिन) की धीमी गति पर दृढकारी निकासी को पूरा करें.
- एक वास्तविक शल्य चिकित्सा के मामले में, 21 में प्रदर्शन के रूप में, जांच को सुरक्षित और रक्षा के लिए प्रविष्टि साइट पर जेल, सिलिकॉन, और / या दंत ऐक्रेलिक लागू करने के लिए सामान्य प्रक्रिया के साथ जारी है.
3. Agarose जेल टेस्ट
प्रोटोकॉल के इस खंड थोक यांत्रिक गुणों, पीएच, और मस्तिष्क के ऊतकों 17,22 की लवणता का अनुमान लगाती है कि एक 0.6% agarose जेल में दृढकारी की निकासी की जांच के लिए एक स्थापित करने और प्रक्रिया का वर्णन है. जेल कम दूरी के माध्यम से लगभग पारदर्शी है, दृढकारी जुदाई और जांच विस्थापन मनाया जा सकता है.
- फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में 0.6% agarose की एक समाधान तैयार करें. एक हाथी पर मिक्सपूरी तरह से agarose पाउडर भंग करने के लिए बढ़ा तापमान. एक उथले एक्रिलिक बॉक्स में समाधान डालो, जेल गहरे में 3/4- 1 होना चाहिए. एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेट जेल की अनुमति दें.
- यह बाहर सूखा नहीं है कि इतनी कठोर जेल पीबीएस के साथ संतृप्त है कि यह सुनिश्चित करने, और 37 डिग्री सेल्सियस तक जेल गर्मी
- 8 चित्र में दिखाया गया है agarose जेल की micromanipulator, बॉक्स, और सूक्ष्म कैमरा प्रणाली की स्थापना की.
- जेल और बॉक्स के किनारे (8 चित्रा) के बीच यह रपट द्वारा जेल के बक्से में एक गिलास संदर्भ विश्वस्त डालें. डिजिटल माइक्रोस्कोप से देखने के क्षेत्र के लिए संदर्भ विश्वस्त पर सुविधाओं वर्ग के लिए एक दंत लेने का उपयोग.
- 2.1 कदम के रूप में वर्णित micromanipulator से जांच विधानसभा माउंट.
- के बारे में 1 मिमी संदर्भ असंदिग्ध के पीछे जेल के ऊपर जांच विधानसभा की स्थिति.
- देखने के क्षेत्र में एक वांछित गहराई को यह मार्गदर्शन करने के लिए कैमरे का उपयोग कर, जेल में जांच डालें. </ ली>
- तुरंत पास के एक सतह पर आराम करने के लिए जांच की कनेक्टर सिरे चाल है.
- जांच (संदर्भ विश्वस्त सुविधाओं से थोड़ा ध्यान से बाहर हो सकता है) पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कैमरा छवि के लिए किसी भी आवश्यक समायोजन करें. जांच स्थान का एक स्नैपशॉट ले.
- खूंटी (इस समय भिन्न हो सकते हैं, और वास्तव में परीक्षण किया जा करने के लिए एक पैरामीटर हो सकता है) को भंग करने की अनुमति दें. जेल से ऊपर है कि खूंटी भंग करने के लिए टैब के पास पीबीएस लागू करें.
- अगर वांछित वीडियो पर कब्जा प्रारंभ करें, और 2.5 कदम के रूप में वर्णित दृढकारी की निकासी शुरू करते हैं. निकासी के पूरा होने पर, जांच स्थान के अंतिम स्नैपशॉट ले.
- दृढकारी निकासी पहले और बाद में चित्रों की तुलना करने के लिए छवि प्रसंस्करण उपकरण का प्रयोग करें. छवियों (संरेखित) रजिस्टर करने के लिए देखने के क्षेत्र में दिखाई दे रहे हैं कि संदर्भ विश्वस्त पर सुविधाओं का उपयोग करें. जांच पर ज्ञात सुविधाओं के आकार के आधार पर छवि के पैमाने जांचना. जांच विस्थापन की दूरी को मापने.
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Representative Results
इस प्रविष्टि तकनीक आईएसओ 10993 biocompatibility मानकों बीत चुके हैं और पुरानी आरोपण के लिए इरादा कर रहे हैं जो LLNL पतली फिल्म Polyimide जांच के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक ठेठ पतली फिल्म Polyimide जांच संकीर्ण क्षेत्र में लंबे समय से लगभग 10 मिमी है कि एक सिलिकॉन दृढकारी के साथ चित्र 1 में सचित्र है. चित्रा 2 में दिखाया गया है इस दृढकारी, इसकी लंबाई के साथ चल रहे एक wicking चैनल है. 3 सिलिकॉन के बाहर इस दृढकारी बनाने के लिए इस्तेमाल mimcrofabrication प्रक्रिया दिखाता है चित्रा. 4 टैब के जलाशय में रखा गया था कि ठोस खूंटी की एक गोली से पता चलता है, फ्लिप चिप bonder प्रणाली पर कैमरे के माध्यम के रूप में देखा. यह चिप फ्लिप bonder के आधार चरण में निर्मित हीटर का उपयोग किया गया था गर्म एक बार, खूंटी पिघल गए और चैनल में बाती करने लगे. कैमरा देख खूंटी पूरी तरह से जो चैनल, भरे जब तक हमें wicking प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए अनुमति दीज आणविक भार 10,000 छ / mol की खूंटी के साथ लगभग एक घंटा लग गया. खूंटी तो resolidified गया था और चित्रा 5 में दिखाया गया है और जांच दृढकारी फ्लिप चिप bonder में स्थापित किया गया था. चित्रा 9A पूरी तरह से अंतरफलक भरने गठबंधन और खूंटी के साथ संलग्न किए जाने के बाद एक जांच और दृढकारी के एक शीर्ष देखने से पता चलता है. चित्रा 9B खूंटी क्योंकि एक कण के मौजूद नहीं है जहां एक हवाई बुलबुले का एक उदाहरण दिखाता है. विधानसभा में अंतिम कदम से निपटने के दौरान अतिरिक्त सुदृढीकरण के लिए, जांच के केबल भाग पर टैब क्षेत्र के लिए खूंटी जोड़ने के लिए है. इस क्षेत्र लक्ष्य में सम्मिलित नहीं किया जाएगा के बाद से 6 चित्र में दिखाया गया है, यह, यहाँ खूंटी की एक बड़ी मात्रा है करने के लिए स्वीकार्य है. 10 चित्र में दिखाया के रूप में इस विधानसभा विधि, बहु टांग उपकरणों सहित, stiffeners के लिए जांच की विभिन्न आकृतियों संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
इन विट्रो agarose जेल परीक्षण qualitativ के लिए इस्तेमाल किया गया हैइली ऐसे खूंटी आणविक भार, खूंटी को भंग करने के लिए अनुमति दी समय, और दृढकारी ज्यामिति के रूप में विभिन्न मापदंडों का मूल्यांकन. खूंटी और दृढकारी ज्यामिति के प्रत्येक संयोजन के साथ, समय का एक निर्धारित राशि विघटन के लिए अनुमति दी गई थी. वास्तविक समय में जांच विस्थापन देख तब, जबकि निकासी का प्रयास किया गया था. जांच दिख दृढकारी के सापेक्ष अलग करने या फिसलने के बिना काफी (> 200 माइक्रोन) घसीटा गया था, तो हम खूंटी पूरी तरह से भंग नहीं किया गया था कि संपन्न हुआ. तालिका 1 बार अलग और एक दृढकारी साथ आणविक वजन के साथ अलग खूंटी विघटन के कुछ प्रतिनिधि टिप्पणियों देता है कि लंबे और 306 मीटर चौड़े 6 मिमी है. बाद के परीक्षणों में एक और अवलोकन दृढकारी (जैसे 220 मीटर) अधिक संकीर्ण है जब, खूंटी (5 मिनट के रूप में छोटे रूप में) कम समय में भंग कर दिया गया था. चिपकने वाला संपर्क क्षेत्र में कमी आई है और एक परिणाम के रूप में, भंग करने के लिए खूंटी की एक छोटी मात्रा था वहाँ था, क्योंकि यह संभावना है. खूंटी को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं किया था कि पैरामीटर्सविघटन या जांच विस्थापन दृढकारी (मोटाई माइक्रोन परीक्षण किया गया 20 माइक्रोन से 100 से लेकर) मोटाई और wicking चैनलों की संख्या (1 बनाम 3) थे.
इन विट्रो परीक्षण भी एक दिया जांच / दृढकारी / चिपकने वाला विन्यास के लिए औसत जांच विस्थापन यों इस्तेमाल किया गया है. इस उदाहरण में, परीक्षण जांच दृढकारी विधानसभा agarose जेल में डाला जाता है, जिसमें कनेक्टर सिरे पास के एक सतह के लिए ले जाया जाता है 7 चित्र में सचित्र प्रविष्टि / निकालना अनुक्रम उपयोग किया गया था, खूंटी को भंग करने की अनुमति दी है, और दृढकारी अंत में जगह में जांच छोड़ने निकाला जाता है. 8 चित्रा में स्थापित प्रयोगात्मक micromanipulator हाथ से जुड़ी है और जेल पर तैनात जांच दृढकारी विधानसभा से पता चलता है. संदर्भ विश्वस्त डिजिटल माइक्रोस्कोप से देखने के क्षेत्र में एक्रिलिक बॉक्स खिलाफ रखा सोना डॉट्स की एक सरणी के साथ एक छोटे से गिलास चिप था.
11 agarose जेल में परीक्षण किया गया था कि एक जांच विधानसभा से एक दृढकारी की निकासी के पहले और बाद में फोटो से पता चलता है. छवियों में प्रकाश सोने सुविधाओं संदर्भ असंदिग्ध से कर रहे हैं और एक दूसरे के लिए छवियों को संरेखित करने के लिए संदर्भ सुविधाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया. इस आयाम निर्माण की प्रक्रिया में बदलाव के प्रति संवेदनशील है क्योंकि इलेक्ट्रोड (200 माइक्रोन) के बीच में जाना जाता पिच, पिक्सेल आकार जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कारण दृढकारी निकासी के लिए नेट जांच विस्थापन 28 ± 9 मीटर होने का अनुमान किया गया था (मतलब ± मानक त्रुटि, एन = 5).
तिथि करने के लिए, प्रस्तावित विधि वास्तविक एक के लिए बढ़ा दिया गया है एक चूहा प्रांतस्था में एक जांच प्रत्यारोपण करने के लिए कई अवसरों पर imal सर्जरी. विधानसभा के बाद, जांच और 50 माइक्रोन मोटी दृढकारी कमरे के तापमान पर EtOH में एक साथ निष्फल रहे थे. सम्मिलन और निष्कर्षण एक stereotaxic फ्रेम से जुड़ी एक micromanipulator के साथ प्रदर्शन किया गया. जांच दृढकारी विधानसभा एक चूहे के प्रांतस्था में 0.13 मिमी / सेक लगभग 4 मिमी पर डाला गया था. 15 मिनट के बाद, दृढकारी जगह में जांच, जा निकाला गया था. सर्जरी से वसूली के बाद, तंत्रिका रिकॉर्डिंग, चित्रा 12 में दिखाया गया है, सफलतापूर्वक वास्तविक सर्जरी 23 में इस विधि की व्यवहार्यता का प्रदर्शन जाग पशु से प्राप्त किया गया. चित्रा 13 में दिखाया गया है इस आरोपण तकनीक भी, आगे और पीछे दोनों तरफ इलेक्ट्रोड है कि दोहरी तरफा सरणियों साथ vivo में रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
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चित्रा 1. एक ठेठ तंत्रिका जांच और प्रस्तावित दृढकारी के योजनाबद्ध. एक ठेठ पतली फिल्म बहुलक जांच जांच छोर पर एक या एक से अधिक इलेक्ट्रोड है. धातु निशान केबल भाग की लंबाई के साथ इलेक्ट्रोड से चलाने के लिए और एक बिजली संबंधक से जुड़ा हुआ है कि एक पैड पर समाप्त. दृढकारी लम्बाई (इस मामले में लगभग 10 मिमी) जांच की प्रविष्टि गहराई पर निर्भर करता है, और दृढकारी पर एक व्यापक टैब से निपटने के लिए अनुमति देता है. (छवि सौजन्य डायना जॉर्ज)
चित्रा 2. दृढकारी डिजाइन विवरण. एक wicking चैनल जलाशय में जमा किया गया है कि एक तरल चिपकने वाला वितरित करने के लिए केशिका क्रिया कारनामे. जलाशय से निपटने की सुविधा है कि एक व्यापक टैब क्षेत्र पर है. (छवि सौजन्य डायना जॉर्ज)
सिलिकॉन दृढकारी के लिए चित्रा 3. निर्माण अनुक्रम. सिलिकॉन दृढकारी एक सिलिकॉन पर इन्सुलेटर (एसओआई) मे (ए) पर निर्मित है. पहले wicking चैनल हैं मानक बॉश प्रक्रिया (बी) का उपयोग सूखी etched. अगला, दृढकारी ज्यामिति बंद हो जाता है कि एक लंबे समय तक खोदना द्वारा परिभाषित किया गया है दफन ऑक्साइड परत (सी) पर. अंत में, stiffeners 49% Hydrofluoric एसिड (डी) में गीला नक़्क़ाशी दफन ऑक्साइड परत द्वारा जारी किया जाता है.
चित्रा 4. दृढकारी जलाशय में पॉलीथीन ग्लाइकोल. दृढकारी के जलाशय में रखा पॉलीथीन ग्लाइकॉल की एक परत. एक बार गरम, यह पिघल जलाशय को भरने, और बहेगाwicking चैनल में.
चित्रा 5. फ्लिप चिप संबंध के योजनाबद्ध. दृढकारी फ्लिप चिप bonder के उपकरण सिर पर एक निर्वात द्वारा चैनल नीचे के साथ आयोजित किया जाता है. तंत्रिका जांच नीचे का सामना आधार चरण पर है.
चित्रा 6. दृढकारी टैब पर पॉलीथीन ग्लाइकोल. अतिरिक्त पॉलीथीन ग्लाइकोल उदारता सुदृढीकरण के रूप में दृढकारी के टैब पर लागू किया जाता है. एक Polyimide जांच की केबल भाग दृढकारी के शीर्ष पर दिखाई देता है.
चित्रा 7. में योजनाबद्धsertion और निकासी अनुक्रम. ए) जांच दृढकारी विधानसभा micromanipulator. बी) कनेक्टर सिरे पास के एक सतह के लिए ले जाया जाता है का उपयोग ऊतक में डाला जाता है. सी) पीबीएस, जा. डी) दृढकारी निकाला जाता है दृढकारी के टैब पर खूंटी भंग करने के लिए लागू है लक्ष्य में जांच.
चित्रा 8. इन विट्रो परीक्षण की स्थापना. फॉस्फेट बफर खारा में 0.6% agarose जेल में परीक्षण जांच प्रविष्टि और दृढकारी निकासी के लिए निर्धारित किया है. जांच दृढकारी विधानसभा micromanipulator हाथ से जुड़ी है और संदर्भ असंदिग्ध के पास जेल लक्ष्य पर तैनात है. एक डिजिटल माइक्रोस्कोप agarose जेल में जांच और दृढकारी निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 9. जांच दृढकारी का पालन किया. कारण एक कण के लिए अच्छा संरेखण और पूरा चिपकने वाला कवरेज. बी) चिपकने वाला कवरेज में एक अंतर का एक उदाहरण के साथ एक दृढकारी से जुड़ी जांच के ए) शीर्ष देखें.
चित्रा 10. एक बहु टांग जांच का उदाहरण है. प्रस्तावित विधानसभा की प्रक्रिया एक मेल सिलिकॉन दृढकारी को इस चार टांग जांच संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
चित्रा 11. (शीर्ष) से पहले और agarose जेल में एक पतली फिल्म Polyimide जांच के साथ (नीचे) दृढकारी निकासी के बाद से दृढकारी निकासी का परिणाम है. फोटो का उदाहरण. प्रकाश सोने डॉट्स पर हैंसंदर्भ असंदिग्ध और छवियों की तुलना और जांच विस्थापन को मापने के लिए संदर्भ सुविधाओं के रूप में उपयोग किया जाता है. जांच की अनुमानित विस्थापन 28 ± 9 माइक्रोन (मतलब ± मानक त्रुटि, एन = 5) है.
चित्रा 12. शारीरिक रिकॉर्डिंग का उदाहरण है. ये एक न्यूरॉन spikes इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक हटाये दृढकारी साथ प्रत्यारोपित एक लचीला microelectrode जांच से प्राप्त किया गया.
चित्रा 13. एक दोहरी तरफा जांच आगे और पीछे दोनों सतहों पर इलेक्ट्रोड था कि एक लचीला सरणी के एक हटाये दृढकारी सक्षम परीक्षण के साथ. निवेशन से LFP रिकॉर्डिंग. ये LFP रिकॉर्डिंग सी का प्रदर्शनआरोपण के बाद दोनों पक्षों पर omparable इलेक्ट्रोड प्रदर्शन.
| खूंटी को भंग करने के बाद: | |||||
| जांच लंबाई (मिमी) | दृढकारी चौड़ाई (माइक्रोन) | खूंटी आणविक वजन (छ / mol) | 10 मिनट | 15 मिनट | 30 मिनट |
| 6 | 306 | 6000 | हां | हां | |
| 10,000 | हां | ||||
| 20,000 | नहीं | हां | |||
तालिका 1. विभिन्न आणविक भार के खूंटी के विघटन पर 0.6% agarose जेल में खूंटी विघटन समय. टिप्पणियोंसमय की मात्रा बदलती के बाद, एक सिलिकॉन दृढकारी के लिए एक लचीला जांच देते थे.
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Discussion
विधि यहाँ वर्णित एक biodissolvable चिपकने के साथ अलग stiffeners के लिए पतली फिल्म बहुलक जांच संलग्न करने के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित प्रक्रिया प्रदान करता है. इसके अलावा इन हटाने योग्य stiffeners और एक दिया जांच दृढकारी विन्यास के लिए इन विट्रो में प्रक्रिया को मान्य करने के लिए एक तकनीक को लागू करने की सिफारिश की शल्य प्रक्रिया है प्रस्तुत किया. दृढकारी मनमाने ढंग से कठोर बनाया जा सकता है, विधि अपेक्षाकृत लंबी जांच (> 3 मिमी) की प्रविष्टि की सुविधा कर सकते हैं. जैसे, सम्मिलन विधि गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन (डीबीएस), रीढ़ की हड्डी उत्तेजना, और परिधीय तंत्रिका इंटरफेस में आवेदन के लिए एक समर्थकारी प्रौद्योगिकी होने की उम्मीद है.
एक wicking चैनल और फ्लिप चिप आधारित विधानसभा की प्रक्रिया के साथ उपन्यास दृढकारी विभिन्न सामग्रियों और जांच विन्यास के लिए उपयुक्त हैं. ज्यामितीय, दृढकारी जांच पदचिह्न मैच के लिए नहीं है और, उदाहरण के लिए, जांच से संकरा हो सकता है. एसटीआई की मोटाई ffener भी भिन्न हो सकते हैं. हम अन्य सामग्री के साथ, सिलिकॉन से बने एक दृढकारी वर्णित किया है, यह कुछ अनुप्रयोगों के लिए अधिक वांछनीय यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने के लिए संभव हो सकता है. विधानसभा की प्रक्रिया भी तरल चिपकने के अन्य प्रकार के लिए उपयुक्त है. खूंटी क्योंकि कई बार जम और remelted किया जा करने की क्षमता के साथ काम करने के लिए विशेष रूप से आसान है. इस संपत्ति की जरूरत नहीं है कि अन्य तरल चिपकने के मामले में, विधानसभा अनुक्रम संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. यह खूंटी के लिए एक अलग आणविक भार का उपयोग करना संभव है. एक उच्च आणविक भार सर्जरी के दौरान वांछनीय हो सकता है, जो भंग करने के लिए लंबे समय तक ले जाएगा. जांच और दृढकारी के बीच संपर्क के क्षेत्र में भी जांच प्रविष्टि के बाद चिपकने वाला भंग करने के लिए आवश्यक समय को प्रभावित करेगा. यह चिपकने वाला भंग करने के लिए आवश्यक समय को चिह्नित करने के लिए धारा 3 में वर्णित के रूप में चुना आणविक वजन के साथ जांच दृढकारी विन्यास विट्रो में परीक्षण किया जा सिफारिश की है.
_content "> हम ठीक निकासी की गति को नियंत्रित करने के लिए कम से कम जांच विस्थापन के साथ दृढकारी निकालने के लिए महत्वपूर्ण है कि पाया. विशेष रूप से, एक प्रारंभिक त्वरित गति स्थिर घर्षण से उबरने और, इस के बाद. जांच से निकासी के शेष दृढकारी अलग करने के लिए मदद करता है कई तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं KOPF stereotaxic सिस्टम का उपयोग करें. agarose जेल परीक्षण में मनाया के रूप में, नगण्य अतिरिक्त जांच के विस्थापन के साथ एक धीमी गति से पूरा किया, और इन प्रणालियों को जोड़ा जा सकता है कि KOPF (जैसे मॉडल 2662) से एक मोटर चालित mircopositioner मॉड्यूल है किया. यह इसी तरह गतिशील प्रदर्शन किया था, लेकिन कम खर्चीला था और अधिक लचीला गति नियंत्रण था क्योंकि हम एक न्यूपोर्ट मोटर चालित actuator चुना है. (यह हमारे micropositioner प्रणाली को actuator संलग्न करने के लिए एक सरल ब्रैकेट बनाना जरूरी हो गया था.) KOPF प्रणाली दो निष्कर्षण लागू कर सकते हैं हम विकसित प्रोटोकॉल के समान गति. हालांकि, KOPF actuator की अधिकतम गति 4 मिमी / सेक, जबकि हैहम न्यूपोर्ट actuator का उपयोग प्रारंभिक विस्थापन के लिए 5 मिमी / सेक इस्तेमाल किया.इन विट्रो और इन विवो परीक्षण के दौरान, जांच दृढकारी विधानसभा की प्रविष्टि 0.13-0.5 मिमी / सेक लेकर गति के साथ, एक मैन्युअल संचालित micromanipulator, या एक मोटर चालित micromanipulator के साथ या तो प्रदर्शन किया गया था. नहीं करने के लिए क्षति या जांच के delamination मनाया गया. हायर प्रविष्टि गति जांच दृढकारी विधानसभा को नुकसान के जोखिम को निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन नहीं किया गया.
सम्मिलन / निकालना प्रक्रिया के लिए संशोधन की प्रक्रिया को और अधिक मजबूत बनाने के लिए कार्य प्रगति पर हैं. विशेष रूप से, एक बहुत ही संवेदनशील कदम पास के एक सतह पर micromanipulator के बंद जांच की कनेक्टर सिरे से आगे बढ़ रहा है. यह सुरक्षित किया गया है से पहले जांच परेशान के इस चरण में एक जोखिम है. यह केबल में मोड़ जांच की अनायास ही विस्थापन के लिए अग्रणी जांच के डाला हिस्से पर तनाव पैदा कर सकता है कि यह भी संभव हैदृढकारी निकासी के बाद. वर्तमान में, इन जोखिमों को कम से कम 2.5 सेमी लंबा है कि एक केबल के साथ एक जांच का उपयोग कर को कम कर रहे हैं. हालांकि, यह सम्मिलन / निकालने की प्रक्रिया की जांच के डिजाइन पर कम निर्भर हो कि वांछित है. Micromanipulator उपकरण अंत या अस्थायी रूप से कनेक्टर समर्थन कर सकते हैं कि फिक्स्चर मंचन के अलावा करने के लिए संशोधन की संभावना दृढकारी की अधिक विश्वसनीय निकासी की अनुमति होगी.
इस पद्धति से देने भविष्य के अध्ययन के लिए ले जा सकता है कि कई खुला सवाल कर रहे हैं. 0.6% agarose जेल जांच विस्थापन का सबसे अच्छा विट्रो मस्तिष्क के ऊतकों किराए में जाना जाता है और अनुमति दी इमेजिंग विश्लेषण प्रदान करते हुए सबसे पहले, यह वास्तव में मस्तिष्क के ऊतकों को दोहराने नहीं है. अध्ययन स्थान और इन विवो में जांच के विस्थापन की जांच करने की जरूरत है. दूसरे, लंबी अवधि के आरोपण और ऊतकीय परीक्षण एक हटाये दृढकारी साथ लचीला जांच का लाभ यों की जरूरत है. इस तरह के अध्ययन के सिद्धांत की जांच कर सकता हैकि जांच के अनुपालन micromotion कम कर देता है और इलेक्ट्रोड प्रदर्शन फैली हुई है. अंत में, यह अधिक सही खूंटी की गिरावट की दर को चिह्नित करने के लिए लाभप्रद होगा. यह विशेष रूप से शल्य चिकित्सा की जरूरत के लिए विघटन के समय की बेहतर ट्यूनिंग में सहायता कर सकता है. इस तरह के मापन भी खूंटी के हाइड्रोफिलिक प्रकृति दृढकारी की निकासी की सुविधा के बाद भंग कर खूंटी महत्वपूर्ण है जो जांच और दृढकारी, के बीच बनी हुई है कितनी देर यों सकता.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच NIDCD Y1 डीसी 8002-01 द्वारा समर्थित किया गया. इस काम के अनुबंध डे-AC52-07NA27344 तहत लॉरेंस लिवरमोर राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा अमेरिकी ऊर्जा विभाग के तत्वावधान में प्रदर्शन किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol, 10,000 g/mol | Sigma Aldrich | 309028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Flexible Sub-micron Die Bonder | Finetech | Fineplacer lambda | |
| Micromanipulator | KOPF | 1760-61 | |
| Digital Microscope | Hirox | KH-7700 | |
| Dual Illumination Revolver Zoom Lens | Hirox | MXG-2500REZ | |
| Precision Motorized Actuator | Newport | LTA-HS | w/ CONEX-CC controller |
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