Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पालन कोशिकाओं के permeabilization

Published: September 4, 2013 doi: 10.3791/50612
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Chemical Engineering, McGill University, 2Montreal Heart Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं के अस्थायी permeabilization के लिए एक विधि का वर्णन करता है. इस तकनीक प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करने के लिए यांत्रिक बलों के उपयोग के द्वारा पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री और biomolecules के हस्तांतरण की सुविधा.

Abstract

विभिन्न सेल अभिकर्मक तकनीक मौजूद हैं और इन तीन व्यापक श्रेणियों के लिए नीचे टूट सकता है: वायरल, रासायनिक और यांत्रिक. इस प्रोटोकॉल अस्थायी कोशिकाओं में सामान्य रूप से गैर पारगम्य बड़े अणुओं के हस्तांतरण की सुविधा कर सकते हैं कि एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं permeabilize करने के लिए एक यांत्रिक विधि का वर्णन करता है. हम इस तकनीक micropores के अस्थायी गठन में जिसके परिणामस्वरूप, पक्षपाती कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर कतरनी बलों प्रदान करके काम करता है विश्वास. इन छिद्रों से बनाया जाता है एक बार, कोशिकाओं तो आनुवंशिक सामग्री और अन्य biomolecules के लिए प्रवेश के योग्य हैं. शामिल यांत्रिक बलों उनके सब्सट्रेट से स्थायी रूप से हानिकारक या detaching कोशिकाओं के जोखिम को चलाते है. तकनीक कारगर है जहां अक्रिय गैस गतिशीलता का एक संकीर्ण सीमा है, इसलिए वहाँ है. एक आभ्यांतरिक गैस जेट हेला, HEK293 और मानव उदर महाधमनी endothelial कोशिकाओं सहित विभिन्न पक्षपाती सेल लाइनों permeabilizing में कुशल साबित कर दी है. इस प्रोटोकॉल पी के लिए उपयुक्त हैहम इसे भविष्य के नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में संभावित अनुसंधान और के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, दिखा vivo में, प्रदर्शन किया है के रूप में इन विट्रो में और, दोनों पक्षपाती कोशिकाओं की ermeabilization. यह भी एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण साबित हो सकता है, जो एक spatially प्रतिबंधात्मक ढंग से कोशिकाओं permeabilizing का लाभ दिया है.

Introduction

बायोमेडिसिन के विकास और सेल यांत्रिकी की समझ के साथ, कोशिकाओं में biomolecules के वितरण में कई अनुसंधान क्षेत्रों और चिकित्सा उपचार के लिए महत्वपूर्ण बन गया है. विभिन्न तकनीकों प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से और सेल cytosol में विदेशी अणुओं को पेश करने के लिए विकसित किया गया है. वायरल, रासायनिक या यांत्रिक तकनीक: ये आम तौर पर या तो के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है. वायरल तकनीक जैसे वायरल वैक्टर 1 का उपयोग आरएनए और डीएनए के रूप में आनुवंशिक सामग्री transfect कर सकते हैं. वायरल तकनीक हालांकि वे प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 2 के लिए क्षमता है, कुछ सेल लाइनों में उच्च क्षमता हो जाते हैं. आम रासायनिक अभिकर्मक तरीकों कैल्शियम फॉस्फेट 3, बैक्टीरियल exotoxins 4 और lipofection 5 के साथ वर्षा शामिल हैं. इन तकनीकों में प्रभावी होना सिद्ध कर दिया है, लेकिन, कुछ समस्याओं जैसे सेल विषाक्तता और गैर विशिष्टता के रूप में उत्पन्न होती हैं. इसके अलावा, जैसे कैल्शियम phosphat के रूप में तकनीकई तेज़ी शायद ही कभी प्राथमिक कोशिकाओं 6 में, 70% करने के लिए, लेकिन केवल कुछ सेल लाइनों में अभिकर्मक क्षमता है पाया गया है. बढ़ती अनुसंधान प्रयासों विशेष रूप से चिकित्सीय उपयोग और डीएनए कामकाज का अध्ययन के लिए विभिन्न उपचार के डिजाइन के मामले में, प्राथमिक कोशिकाओं में रखा जा रहा है के रूप में इस नोट की है.

यांत्रिक उत्तेजनाओं के माध्यम से कोशिका झिल्ली के अस्थायी व्यवधान कोशिकाओं में विदेशी अणुओं शुरू करने के लिए एक विकल्प है. तकनीकों में शामिल हैं: अणुओं 7 के microinjection, झिल्ली 8,9 बाधित करने के लिए एक बिजली के क्षेत्र का उपयोग कर electroporation, sonoporation के साथ ही कणों गोली मारता है जो "जीन बंदूक" ने प्रदर्शन के रूप में कोशिका झिल्ली 10-12, कण बमबारी को बाधित करने के लिए अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग सेल 13 में जीन, और अधिक हाल ही में, अस्थायी स्तनधारी कोशिकाओं 14,15 permeabilize दिखाया गया है कि द्रव कतरनी तनाव के आवेदन. हालांकि मैकेनिकअल तरीकों aforementioned मुद्दों में से कुछ से बचने, वे आम तौर पर कम क्षमता और बहुत जटिल और विशेष setups के साथ कर रहे हैं. एक वायुमंडलीय दबाव चमक निर्वहन मशाल (APGD टी) सतहों functionalizing और इन विट्रो 16 में पक्षपाती कोशिकाओं detaching का प्रारंभिक लक्ष्य के साथ मैकगिल में विकसित किया गया था. Serendipitously, यह प्रयोग किया जा रहा एक लाइव / मृत दाग किसी तरह एक permeabilizing एजेंट जोड़ा जा रहा है बिना कोशिकाओं से लिया जा रहा था की खोज की गई थी. इसके अलावा, यह केवल मशाल पथ के साथ मैच करने के लिए हुआ है, जो वेल्स के प्रतिबंधित क्षेत्रों में हुई है लग रहा था. APGD आयकर की permeabilization क्षमताओं में जांच जारी रखा और नियंत्रण के अध्ययन में, यह उत्तेजना के बिना प्लाज्मा के वाहक अक्रिय गैस जेट भी कोशिकाओं permeabilize करने में सक्षम था कि पाया गया था. यह प्लाज्मा जेट द्वारा बनाई गई प्रतिक्रियाशील प्रजातियों अस्थायी रूप से झिल्ली समारोह बिगड़ा कि प्रारंभिक परिकल्पना का खण्डन किया और सुझाव दिया बस mechani किसीएएल बलों सेल permeabilization पैदा करने के लिए पर्याप्त थे. यहाँ से, पढ़ाई कोशिश करते हैं और यों और permeabilization एक आभ्यांतरिक गैस जेट की दक्षता के साथ ही इसकी अभिकर्मक क्षमताओं 16 पर नज़र चिह्नित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में जारी रखा.

इन अध्ययनों के माध्यम से, यह micropores प्लाज्मा झिल्ली में तथ्य के रूप में करते पाया गया है कि, और इन छिद्रों से लगभग 5 सेकंड 15 के भीतर reseal करने के लिए करते हैं. हम एक लड़की भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली में इन विट्रो में और vivo में तकनीक की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. LabView कार्यक्रम के विकास

  1. एक जन प्रवाह नियंत्रक (MKS M100B मास-FLO नियंत्रक) एक सटीक गैस प्रवाह दर सुनिश्चित करने के लिए हीलियम गैस लाइन से जुड़ा हुआ है. इस इकाई में 0 और 5 वी. Labview के कार्यक्रम में एक नियंत्रण पाश किसी भी समय पर आवश्यक वोल्टेज निर्धारित करता है के बीच लेकर एक इनपुट वोल्टेज द्वारा नियंत्रित किया जाता है. कंप्यूटर और बीच interfacing जन प्रवाह नियंत्रक एक डाटा अधिग्रहण डिवाइस (एनआई यूएसबी-6009) के द्वारा प्रदर्शन किया, और एक 12 वी बिजली की आपूर्ति जन प्रवाह नियंत्रक को शक्ति प्रदान करता है.
  2. स्थिति दो रैखिक स्लाइड 6 अच्छी तरह से थाली, प्रत्येक दिशा के लिए एक के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रत्येक विधानसभा में एक कदम मोटर के साथ मिलकर एक MA15 सीरीज Velmex Unislide विधानसभा के होते हैं, और दोनों विधानसभाओं मोटर नियंत्रक कदम एक एकल Velmex VXM द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. नियंत्रक प्रत्येक मोटर की पुस्तिका जॉगिंग के लिए अनुमति देता है या बाहरी धारावाहिक आदेशों की एक स्ट्रिंग स्वीकार करता है, जिनमें से संयोजन विशिष्ट आंदोलन पी के लिए अनुमतिatterns. कई पैटर्न ही वांछित मशाल गति के साथ ही पथ आयाम प्रदान करने के लिए उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है, Labview कार्यक्रम में प्रोग्राम किया जा सकता है.

2. उपकरण की तैयारी

  1. हीलियम सिलेंडर और रेगुलेटर दोनों खुला.
  2. मोटर नियंत्रक पर मुड़ें.
  3. LabView कार्यक्रम खोलें और सभी शर्तों को सत्यापित.
  4. मंच केन्द्रित है सुनिश्चित करें. , जाँच प्रत्येक मोटर मंच पर देखने के लिए और प्रत्येक गाड़ी चरण दोनों छोर के पास नहीं है कि सत्यापित करने के लिए. कार्यक्रम केन्द्र गाड़ी है या मैन्युअल मोटर नियंत्रक के मोर्चे पर जॉगिंग नियंत्रण का उपयोग करके समायोजित या तो.
  5. इस दिन का पहला शो है, तो यह सेटअप सही ढंग से काम कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं के बिना एक बार कार्यक्रम चलाने की सिफारिश की है.

3. गैस जेट केशिका नोजल लंबाई की तैयारी

  1. धारक से केशिका निकालें और ऊंचाई डायल शून्य.
  2. 6 अच्छी तरह से थाली ओ रखेंn मंच.
  3. बदलें और इसे कवर पर्ची हिट जब तक अच्छी तरह से नीचे के लिए गैस जेट केशिका कम है. धारक में केशिका सुरक्षित.
  4. ऊंचाई डायल का प्रयोग, केशिका 3 मिमी बढ़ा. केशिका आधार पर इस ऊंचाई निशान.
  5. एक सुरक्षित ऊंचाई को केशिका उठाएँ और फिर 6 अच्छी तरह से थाली हटा दें.

4. सेल Permeabilization प्रोटोकॉल

  1. कांच के कवर पर संगम संस्कृति पक्षपाती सेल लाइन मानक संवर्धन तकनीक का उपयोग कर एक 6 अच्छी तरह से थाली में निकल जाता है. HELA कोशिकाओं के लिए, बीज 6 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं के साथ प्लेटें और उपचार से पहले 48 घंटे के लिए सेते हैं.
  2. वांछित वेक्टर युक्त समाधान का उचित मात्रा तैयार करें. HrGFPII -1, 1x पीबीएस में 50 एनजी / μl के एक एकाग्रता HELA कोशिकाओं में एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत अभिकर्मक के बाद 24 घंटे सुझाता है. Dextran पढ़ाई के लिए, 10 केडीए हरी फ्लोरोसेंट dextran से 80 माइक्रोग्राम / एमएल की सिफारिश की है. इसके बाद, इस समाधान एक के लिए भेजा जाएगाएस "वेक्टर समाधान".
  3. अच्छी तरह से सेल संस्कृति मीडिया निकालें और 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला.
  4. कुएं में 4.2 कदम में तैयार वेक्टर समाधान के 1,370 μl पिपेट. यह लगभग 1.3 मिमी की एक तरल गहराई में परिणाम चाहिए.
  5. मंच के केंद्र में वेक्टर समाधान युक्त अच्छी तरह से रखें. स्लाइड ऊपर 3 मिमी की नोक ऊंचाई का संकेत पहले से चिह्नित स्तर तक गैस जेट नोक कम करें.
  6. Labview के कार्यक्रम में हीलियम प्रवाह दर निर्धारित करने और इस्तेमाल किया जा करने के लिए वांछित आंदोलन पैटर्न का चयन करें. जब permeabilization प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए तैयार "भागो" का चयन करें. जन प्रवाह नियंत्रक आवश्यक प्रवाह की दर प्रदान करने के लिए तैयारी कर रहा है, जिसके दौरान एक प्रारंभिक अंतराल अवधि होगी. उचित प्रवाह की दर पर पहुंच गया है एक बार, Labview कार्यक्रम वांछित permeabilization पैटर्न में अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए stepper मोटर्स को चालू कर पायेगा. मंच बंद कर दिया गया है, लगभग 30 मिनट रुको और वेक्टर समाधान निकालने.नोट: इष्टतम permeabilization केशिका व्यास पर निर्भर करता है, नोक आउटलेट पर 100 से 200 देहात के एक गतिशील दबाव के पास होता है.
  7. 1x पीबीएस के साथ अच्छी तरह से तीन बार धोएं.
  8. ताजा संस्कृति मीडिया के साथ अच्छी तरह से भरें.
  9. प्रयोगों की वांछित संख्या के लिए 4.6 - दोहराएँ 4.3 दोहराएँ. नोट: उन पर चलाया जा रहा है गैस जेट बिना वेक्टर समाधान के साथ भरा जा रहा कुओं से मिलकर जो नियंत्रण के नमूने शामिल करना न भूलें. तब चरणों 4.5 और 4.6 के लिए आगे बढ़ना लगभग 1 मिनट के लिए नियंत्रण कुओं में समाधान छोड़ दें.
  10. एक hrGFP अभिकर्मक प्रयोग चल रहे हैं, ट्रांसफ़ेक्ट सामग्री कोशिकाओं द्वारा लिखित होना अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली वापसी. एक dextran permeabilization प्रयोग चल रहे हैं, तो 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली वापसी.

5. सेल इमेजिंग

  1. अगर वांछित, तुरंत पहले इमेजिंग, कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त मृत / लाइव दाग के साथ counterstain.
  2. Approp साथ छवि कोशिकाओंअभिकर्मक / permeabilization प्रभावकारिता की जांच riate माइक्रोस्कोप.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक 0.86 मिमी भीतरी व्यास केशिका साथ एक हीलियम गैस विमान का उपयोग कर 10 केडीए हरी फ्लोरोसेंट dextran साथ HELA कोशिकाओं के permeabilization चित्र 1 में दिखाया गया है. कोशिकाओं को तुरंत कोशिका मृत्यु कल्पना करने के लिए 2 μl / एमएल EthD -1 समाधान (लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity किट) के साथ permeabilization के बाद counterstained थे. तुरंत counterstaining निम्नलिखित, कवर फिसल जाता है घुड़सवार और imaged थे. यह आंकड़ा एक नियंत्रण नमूना की तुलना में तीन अलग आउटलेट दबाव में हीलियम गैस विमान चलाने का परिणाम दिखाता है. Permeabilization ट्रैक चौड़ाई और दक्षता केवल एक मामूली वृद्धि (ए और बी) से पता चला है कि एक उच्च गतिशील दबाव और कोशिका मृत्यु के साथ वृद्धि हुई है ध्यान दें. एक उच्च गतिशील दबाव पहुँच गया था हालांकि, एक बार, HELA कोशिकाओं कवर फिसल जाता है से छीन लिया और बहुत कम परिधीय permeabilization हुई थे. सेल स्ट्रिपिंग और अभिकर्मक दक्षता की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण पहले Chouinard द्वारा आयोजित किया गया-पेलेटियर एट अल. 15

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के माध्यम से, micropores कोशिका झिल्ली (चित्रा 2) में मनाया गया. HELA कोशिकाओं के permeabilization permeabilization प्रोटोकॉल के बाद 300 फोनों की एक दुकान के दबाव में 0.86 मिमी भीतरी व्यास केशिका साथ एक हीलियम गैस जेट उपयोग किया गया था, कोशिकाओं तुरंत 1x पीबीएस में 1% paraformaldehyde समाधान के साथ तय किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. 0.86 एमएम की एक केशिका नोक भीतरी व्यास के साथ एक हीलियम गैस विमान का उपयोग कर 10 केडीए हरी फ्लोरोसेंट dextran साथ HELA कोशिकाओं के permeabilization. Dextran हरे और मृत कोशिकाओं को 100 देहात के लाल. ए) गतिशील दबाव, बी) 135 Pa की, और सी प्रतिदीप्ति fluoresces dextran के साथ) 175 फोनों डी का) नियंत्रण बी गयीहीलियम गैस जेट के लिए कोई जोखिम ut.

चित्रा 2
चित्रा 2. 300 फोनों ए) एक चिकनी सतह सेल का प्रदर्शन नियंत्रण नमूना. बी) एक 84 एनएम व्यास के साथ एक ताकना प्रदर्शन permeabilized कोशिका की सतह पर गैस जेट permeabilization निम्नलिखित HELA कोशिकाओं की सतह से 50,000 एक्स के एक बढ़ाई SEM छवियों. के लिए क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अक्रिय गैस जेट permeabilization पक्षपाती सेल अभिकर्मक के लिए एक उपयोगी तकनीक है. यह संभवतः हानिकारक रसायनों या वायरल वैक्टर के लिए की आवश्यकता समाप्त जो यांत्रिक बलों के उपयोग के साथ कोशिकाओं में biomolecules हस्तांतरण करने की क्षमता प्रदान करता है. तकनीक संभावित शोधकर्ताओं और चिकित्सकों ठीक कोशिकाओं transfect करने के लिए एक कुशल और अपेक्षाकृत आसान रास्ता दे सकता है. permeabilization के चयनात्मकता भी शोधकर्ताओं ही कई अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकता है जो एक ही कॉलोनी में कुछ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए अनुमति अद्वितीय है.

कई मापदंडों ऐसे केशिका नोक व्यास और कोण, गैस प्रवाह दर, तरल और केशिका ऊंचाई, सेल लाइन का उपयोग किया जा करने के लिए लक्ष्य बायोमोलिक्यूल, और अक्रिय गैस के प्रकार के व्यक्ति के रूप में प्रयोग के लिए समायोजित किया जा सकता है. एक सेट तरल स्तर और केशिका ऊंचाई प्रक्रिया में वर्णित किया गया है और इन मूल्यों को हमारे experime में शामिल चर की संख्या को कम करने के लिए चुना गयाएनटीएस. वर्तमान में, हम प्रयोगात्मक प्रवाह दृश्य और कम्प्यूटेशनल तरल गतिकी का उपयोग कर प्रणाली मॉडलिंग कर रहे हैं. यह हमें इस तरह के तरल संपत्ति के रूप में चर पर permeabilization की निर्भरता निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है, हमें कोशिकाओं पर दिया बल के एक बेहतर समझ दे देंगे.

यह कोशिकाओं को जीवित रह सकते हैं, जिसके तहत अधिकतम गतिशील दबाव का ध्यान रखना जरूरी है. यह एक बार गतिशील दबावों 3 मिमी की एक गैस जेट नोजल ऊंचाई के लिए 200 पा neared पाया गया कि, हेला सेल स्ट्रिपिंग की संभावना बन गई. यह ऐसी लू एट अल के रूप में अन्य अध्ययनों के साथ सहमत हैं. 200-265 पा 17 पर गुम्मट NR6 fibroblast सेल टुकड़ी जो मनाया. अलग करना की बड़ी मात्रा में पाए जाते हैं, तो एक कम गैस प्रवाह दर इस मुद्दे को कम करना चाहिए. इसी तरह, उच्च प्रवाह दरों कोशिका मृत्यु और झूठी सकारात्मक permeabilization परिणामों में परिणाम. कोशिकाओं मर चुके हैं एक बार वे अणुओं के लिए पारगम्य हो जाएगा और इसलिए मृत कोशिकाओं permeabilized जीवित कोशिकाओं के लिए गलत हो सकता है. यहइसलिए permeabilized कोशिकाओं को वास्तव में अब भी जिंदा हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक लाइव / मृत परख का संचालन करने की सिफारिश की है. बढ़ते दबाव और हमारे प्रयोगशाला के साथ मौत बढ़ता है 390 पर पा permeabilized HELA कोशिकाओं के बहुमत 15 मृत थे. समय की एक विस्तारित अवधि में सेल व्यवहार्यता भी 72 घंटा बाद permeabilization (नहीं दिखाया डेटा) के लिए मनाया जा रहा है hrGFPII -1 अभिव्यक्ति के साथ, जांच की गई है. आगे के अध्ययन भी लंबे समय के अंक में व्यवहार्यता की जांच करने के लिए वर्तमान में चल रहे हैं.

हमारी परिकल्पना गैस की जेट और मीडिया के विस्थापन के द्वारा बनाई गई कोशिकाओं पर द्रव कतरनी तनाव, सेल प्लाज्मा झिल्ली की अस्थायी व्यवधान पैदा करता है. इस तरह के microbubble पतन और sonoporation रूप में 18 अन्य अधिक जटिल भौतिक तरीकों के लिए प्रस्तावित एक ही व्यवस्था है. इस विधि के लिए परिचालन की स्थिति सब्सट्रेट, सेल के यांत्रिक गुणों को कोशिकाओं, कुर्की के प्रकार पर निर्भर कर रहे हैंऔर सेल दीवार, ब्याज की अणु, तरल और गैस के गुण, और सेटअप के भौतिक आयाम. आकार अपवर्जन अध्ययन के माध्यम से, हम 40 केडीए से बड़ा dextran अणुओं एक इष्टतम dextran आकार प्रयोग 15 के लिए 10 केडीए है कि बहुत कम permeabilization दक्षता दिखाने के लिए और मिल गया है. यह इस प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं में permeabilized जा सकता है कि अणुओं के आकार को सीमित रूप में यह महत्वपूर्ण है. इस प्रकार अब तक, हम केवल plasmids के अभिकर्मक संपत्तियों की जांच की है. आगे के अध्ययन के आनुवंशिक सामग्री के बड़े टुकड़े इस तकनीक का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहा करने में सक्षम हैं कि क्या पता लगाना होगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC): लेखक निम्न धन स्रोतों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitality hrGFPII-1 Agilent Technologies Canada 240143-57 Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable Life Technologies Inc. D22910 dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies Inc. L3224 for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930 for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium Praxair Canada Inc. HE 5.0UH-T  
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml Thermo Scientific SH30022.01 for HeLa cells
Fetal Bovine Serum Invitrogen 26140079 For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15140-122 For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x Produced in lab
  Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates Corning 3506  
#1 22 x 22 Coverslips Fisher 12-542B  
Glass Capillaries World Precision Instruments WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller MKS M100B01314CS1BV Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device National Instruments 779026-01  
UniSlide Assembly with stepping motor and controller Velmex Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
  Table 2. List of required equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
  2. Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
  3. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
  4. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
  5. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
  6. Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
  7. Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
  8. Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
  10. Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
  11. Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
  12. Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
  13. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
  14. Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
  15. Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
  16. Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
  17. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
  18. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 79 केमिकल इंजीनियरिंग रसायन विज्ञान जैव रसायन सेलुलर जीव विज्ञान आणविक जीव विज्ञान बायोमेडिकल इंजीनियरिंग बायोफिज़िक्स अभिकर्मक Permeabilization अभिकर्मक कतरनी तनाव पक्षपाती कोशिकाओं SEM सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पालन कोशिकाओं के permeabilization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cooper, S., Jonak, P.,… More

Cooper, S., Jonak, P., Chouinard-Pelletier, G., Coulombe, S., Jones, E., Leask, R. L. Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet. J. Vis. Exp. (79), e50612, doi:10.3791/50612 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter