Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til midlertidig permeabilisering af adhærerende celler ved anvendelse af en inert gas jet. Denne teknik letter overførsel af genetisk materiale og biomolekyler i adhærente mammale celler ved anvendelse af mekaniske kræfter til at forstyrre plasmamembranen.
Abstract
Findes forskellige Celletransfektion teknikker, og disse kan opdeles i tre hovedkategorier: viral, kemiske og mekaniske. Denne protokol beskriver en mekanisk metode til tidsmæssigt permeabilisere adhærente celler under anvendelse af en inert gas jet, der kan lette overførsel af normalt ikke-permeable makromolekyler i celler. Vi mener, at denne teknik virker ved at bibringe forskydningskræfter på plasmamembranen af adhærente celler, hvilket resulterer i den midlertidige dannelse af mikroporer. Når disse porer er oprettet, cellerne derefter permeabel for genetisk materiale og andre biomolekyler. De mekaniske kræfter involveret løber en risiko for permanent beskadige eller adskillelse af celler fra deres substrat. Der er derfor et snævert udvalg af inerte gasdynamik hvor teknikken er effektiv. En inert gas jet har vist sig effektive til permeabilisering forskellige adhærente cellelinjer, herunder HeLa, HEK293 og menneskelige abdominale aorta endotelceller. Denne protokol er egnet til permeabilization af adhærente celler både in vitro og, som vi har vist in vivo, viser den kan anvendes til forskning og potentielt i fremtidige kliniske anvendelser. Det har også den fordel, at permeabiliserende celler i et rumligt restriktivt, hvilket kan vise sig at være en værdifuld forskning værktøj.
Introduction
Med udviklingen af biomedicin og forståelsen af celle mekanik, har levering af biomolekyler i celler bliver afgørende for mange forskningsområder og medicinske behandlinger. Forskellige teknikker er blevet udviklet til at indføre fremmede molekyler gennem plasmamembranen og ind i cellecytosolen. Disse kan generelt klassificeres som enten viral, kemiske eller mekaniske teknikker. Viral teknikker kan transficere genetisk materiale, såsom RNA og DNA ved anvendelse af virale vektorer 1. Virale teknikker tendens til at have høje virkningsgrader i visse cellelinjer, men de har potentiale for immune og inflammatoriske reaktioner 2. Almindelige kemiske transfektionsfremgangsmåder indbefatter udfældning med calciumphosphat 3 bakterielle exotoksiner 4 og lipofektion 5. Disse teknikker har vist sig at være effektive, men der opstår visse problemer, såsom celletoksicitet og ikke-specificitet. Endvidere teknikker såsom calcium phosphate udfældning er blevet fundet at have transfektionseffektiviteten op til 70%, men kun i visse cellelinier, sjældent i primære celler 6. Dette er noten som stigende forskningsindsats bliver sat i primære celler, især i tilfælde af at designe forskellige behandlinger til klinisk brug og undersøgelse af DNA-funktion.
Temporal afbrydelse af cellemembranen ved mekanisk stimuli er et alternativ til indføring af fremmede molekyler i celler. Teknikker indbefatter: mikroinjektion af molekyler 7, elektroporering ved anvendelse af et elektrisk felt til at forstyrre membranen 8,9, sonoporation hjælp ultralydbølger at forstyrre cellemembranen 10-12, partikelbombardement som det fremgår af "gen-gun", som skyder partikler bundet med gener i cellen 13, og mere for nylig, anvendelsen af væske shear stress, der har vist sig at timeligt permeabilisere pattedyrceller 14,15. Selvom mekanikeral metoder undgå nogle af de førnævnte problemer, er de typisk ledsaget af lavere effektivitet og meget komplekse og specialiserede opsætninger. En atmosfærisk afgangstryk glød fakkel (APGD-t) blev udviklet på McGill med det oprindelige mål om functionalizing overflader og aftagning adhærente celler in vitro 16. Lykketræf, blev det opdaget, at en live / dead plet bliver brugt en eller anden måde blev taget i af celler uden en permeabiliserende agent bliver tilføjet. Desuden er denne syntes at have forekom kun i begrænsede områder af brøndene, der skete for at matche op med faklen sti. Undersøgelse af permeabilization kapaciteter APGD-t fortsatte, og i kontrol studier, blev det konstateret, at transportøren inaktiv gas jet af plasma uden excitation var også i stand til at permeabilisere celler. Dette modsiges den indledende hypotese, at de reaktive arter skabt af plasma jet midlertidigt nedsat funktion membranen og foreslog, at blot de mekaniskecal styrker var tilstrækkelig til at forårsage celle permeabilization. Herfra undersøgelser fortsatte i vores laboratorium for at forsøge at kvantificere og karakterisere permeabilization effektiviteten af en inaktiv gas jet samt kig på dens transfektionsforsøg kapaciteter 16.
Gennem disse undersøgelser har det vist sig, at mikroporer faktisk udgør i plasmamembranen, og disse porer har tendens til at genforsegle inden for ca 5 sek 15. Vi har vist, at teknikken anvendelighed in vitro og in vivo i fosterhinder en kyllingeembryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udvikling af LabView Program
- En massestrømmen controller (MKS M100B Mass-Flo Controller) er fastgjort til helium gasledningen for at sikre en nøjagtig gas flow. Denne enhed er styret af en indgangsspænding på mellem 0 og 5 V. reguleringssløjfe i LabView programmet den påkrævede spænding på ethvert givet tidspunkt. Samspil mellem computeren og massestrømmen controlleren er udført af en enhed til dataopsamling (NI USB-6009), og en 12 V strømforsyning leverer strøm til massestrømmen controller.
- To positionering lineære dias anvendes til at styre bevægelsen af den 6-brønds plade, en for hver retning. Hver samling består af en MA15-serie Velmex UniSlide Assembly kombineret med en stepmotor, og begge forsamlinger styres af en enkelt Velmex VXM Stepping Motor Controller. Styringen giver mulighed for manuel jogging af hver motor eller accepterer en streng af eksterne serielle kommandoer, kombinationen af som giver mulighed for specifik bevægelse patterns. Adskillige mønstre kan programmeres ind i LabView program kræver, at brugeren kun at give det ønskede fakkel hastighed samt stien dimensioner.
2. Udarbejdelse af udstyr
- Åbn både helium cylinder og regulator.
- Tænd motorstyringen.
- Åbn LabView program og kontrollere alle forhold.
- Sørg for, at platformen er centreret. For at kontrollere, se på hver motor fase, og kontrollere, at hver vogn er ikke tæt på en scene ende. Enten har programmet center vognene eller manuelt justere ved hjælp af jogging kontrol på forsiden af motorstyringen.
- Hvis det er den første kørsel af dagen, anbefales det at køre programmet én gang uden celler, for at sikre opsætningen fungerer korrekt.
3. Forberedelse af Gas Jet kapillardyse Højde
- Fjern kapillarrøret fra holderen og nul højden drejeknappen.
- Placer 6-brønds plade on platformen.
- Udskift og sænke gasstrålen kapillar til bunden af brønden, indtil den rammer dækglasset. Fastgør kapillarrøret i holderen.
- Ved hjælp af højden dial, hæve kapillar 3 mm. Markere denne højde på kapillær base.
- Hæv kapillarrøret til en sikker højde og derefter fjerne 6-brønds plade.
4.. Cell Permeabilisering Protocol
- Kultur adhærent cellelinje til konfluens på dækglas i en 6-brønds plade under anvendelse af standard dyrkningsteknikker. For HeLa-celler, frø 6-brønds plader med 2 x 10 5 celler per brønd og inkuberes i 48 timer før behandling.
- Forbered passende volumen af en opløsning indeholdende den ønskede vektor. For hrGFPII-1, en koncentration på 50 ng / ul i 1x PBS giver et stærkt fluorescerende signal i HeLa-celler 24 timer efter transfektion. For dextran undersøgelser er 80 ug / ml 10 kDa grønt fluorescerende dextran anbefales. Fremover vil denne løsning blive henvist til ens "vektor løsning".
- Fjern cellekulturmedier fra brønd og skylles tre gange med 1x PBS.
- Pipette 1.370 pi vektor løsning forberedt i trin 4.2 i godt. Dette skulle resultere i en flydende dybde på ca 1,3 mm.
- Anbring brønd indeholdende vektoren opløsningen i midten af platformen. Sænk gasstråledyse til tidligere markerede niveau, der angiver en dyse højde på 3 mm over objektglasset.
- Indstil helium strømningshastighed i LabView programmet og vælge den ønskede bevægelsesmønster, der skal anvendes. Vælg "Kør" når de er klar til at begynde permeabilization protokollen. Der vil være en indledende forsinkelse periode, hvor massestrømmen controlleren er klar til at yde den nødvendige flow. Når det passende flow er nået, vil LabView program aktivere stepmotorer til at flytte godt i den ønskede permeabilization mønster. Når platformen er stoppet, vent cirka 30 sekunder og fjern vektor løsning.Bemærk: Optimal permeabilisering forekommer i nærheden af en dynamisk tryk på 100 til 200 Pa ved dyseudgangen, afhængigt af kapillær diameter.
- Vask godt tre gange med 1x PBS.
- Fyld godt med frisk dyrkningsmedium.
- Gentag trin 4,3-4,6 for den ønskede række eksperimenter. Bemærk: Vær sikker på at medtage kontrolprøver, som består af brønde bliver fyldt med vektoren løsning uden gasstrålen blive kørt over dem. Lad opløsningen i kontrolbrøndene i ca 1 min og derefter fortsætte til trin 4.5 og 4.6.
- Hvis der kører en hrGFP transfektion eksperiment returnere 6-brønds plade til inkubatoren i 24 timer for at tillade transficerede materiale, der skal transkriberes af cellerne. Hvis du kører en dextran permeabilization eksperiment, returnere 6-brønds plade til inkubator i 15 min.
5.. Cell Imaging
- Hvis det ønskes, umiddelbart før billedbehandling, kontrastfarve med passende levende / død plet at vurdere celledød.
- Billede celler med appropriate mikroskop at undersøge transfektion / permeabilisering effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilisering af HeLa-celler med 10 kDa grønt fluorescerende dextran ved hjælp af en helium gasstråle med en 0,86 mm indre diameter kapillarrøret er vist i figur 1. Cellerne blev modfarvet umiddelbart efter permeabilisering med 2 ul / ml EthD-1 løsning (LIVE / DEAD levedygtighed / Cytotoxicity Kit) til at visualisere celledød. Umiddelbart efter kontrastfarvning blev dækglas monteret og afbildes. Denne figur viser resultaterne af at køre helium gas jet på tre forskellige afgangstryk sammenlignet med en kontrolprøve. Bemærk, at permeabilization sporvidde og effektivitet øges med et højere dynamisk tryk og celledød viste kun en lille stigning (A og B). Men når et højt dynamisk tryk var nået, blev HeLa-celler strippet fra dækglas og meget lidt perifer permeabilization opstod. En mere detaljeret analyse af celle stripning og transfektion effektivitet blev tidligere udført af Chouinard-Pelletier et al. 15.
Ved scanning elektronmikroskopi undersøgelser blev mikroporer observeret i cellemembranen (figur 2). Permeabilisering af HeLa-celler udførtes under anvendelse af en helium gasstråle med en 0,86 mm indre diameter kapillarrør på et afgangstryk på 300 Pa Efter permeabilisering protokol blev cellerne straks fikseret med 1% paraformaldehyd-opløsning i 1x PBS.
Figur 1. Permeabilisering af HeLa-celler med 10 kDa grønt fluorescerende dextran ved hjælp af en helium gasstråle med en kapillardyse indvendig diameter på 0,86 mm. Dextran fluorescerer grønt og døde celler fluorescerer rødt. A) Dynamisk tryk på 100 Pa, B) på 135 Pa og C ) på 175 Pa D) Kontrol med dextran tilføjet But ingen eksponering til helium gas jet.
Figur 2. SEM billeder ved en forstørrelse på 50.000 X af overfladen HeLa celler efter gas jet permeabilization ved 300 Pa A) Kontrolprøve udviser en jævn celleoverfladen. B) Overflade af permeabiliserede celle udviser en pore med en 84 nm diameter. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inert gas jet permeabilization er en nyttig teknik til Tilhænger celletransfektion. Det giver mulighed for at overføre biomolekyler i celler med anvendelse af mekaniske kræfter, som eliminerer behovet for potentielt skadelige kemikalier eller virale vektorer. Teknikken kan potentielt giver forskere og klinikere en effektiv og relativt enkel måde til præcist at transficere celler. Selektivitet permeabilization er også unik muligt for forskerne at kun behandle bestemte celler i en enkelt koloni, som kunne være nyttige i flere ansøgninger.
Flere parametre kan justeres for de enkelte eksperimenter såsom kapillardyse diameter og vinkel gasstrømmen, flydende og kapillær højde, cellelinie målbiomolekylet, der skal anvendes, og typen af inaktiv gas. Et sæt væskeniveauet kapillær højde er blevet beskrevet i proceduren, og disse værdier blev valgt for at minimere antallet af variabler involveret i vores experimeNTS. I øjeblikket er vi modellere systemet ved hjælp af eksperimenterende flow visualisering og Computational Fluid Dynamics. Dette vil give os en bedre forståelse af de kræfter bibragt på cellerne, hvilket giver os mulighed for at bestemme permeabilization afhængighed af variabler såsom flydende egenskaber.
Det er vigtigt at notere sig den maksimale dynamiske tryk, hvorunder cellerne kan overleve. Det blev fundet, at når dynamisk tryk nærmede sig 200 Pa for en gasstråledyse højde på 3 mm, blev HeLa-celle stripping sandsynligt. Dette er enig med andre undersøgelser såsom Lu et al. Der observeret WT NR6 fibroblast celle detachement på 200-265 Pa 17. Hvis der opstår store mængder af stripning, bør en lavere gasstrømningshastighed afhjælpe dette problem. Ligeledes medfører høje strømningshastigheder i celledød og falsk-positive permeabilization resultater. Når cellerne er døde de bliver gennemtrængelig for molekyler, og derfor døde celler kan forveksles med permeabiliserede levende celler. DetDerfor anbefales det at foretage en levende / død assay for at sikre, at de permeabiliserede celler er faktisk stadig i live. Død stiger med stigende pres og vores laboratorium fandt, at ved 390 Pa størstedelen af permeabiliserede HeLa-celler var døde 15. Cellelevedygtighed over en længere periode, er også blevet undersøgt med hrGFPII-1-ekspression blive observeret op til 72 timer efter permeabilisering (data ikke vist). Yderligere undersøgelser er i øjeblikket i gang med at undersøge levedygtigheden på endnu længere tidspunkter.
Vores hypotese er, at væske forskydningsspændinger på cellerne, skabt af strålen af gas og forskydningen af medierne, forårsager en midlertidig afbrydelse af celleplasmamembranen. Dette er den samme mekanisme foreslås for de andre mere komplekse fysiske fremgangsmåder, såsom mikrobobler sammenbrud og sonoporation 18. Driftsbetingelserne for denne metode er afhængig af typen af celler, fastgørelse til substratet, mekaniske egenskaber af cellenog celle-væg, molekyle af interesse, egenskaber af væske og gas, og de fysiske dimensioner af opsætningen. Gennem størrelse udelukkelse undersøgelser har vi fundet, at dextranmolekyler større end 40 kDa viser meget lav permeabilisering effektivitet og at en optimal dextran størrelse er 10 kDa for eksperimenter 15. Dette er vigtigt, da det begrænser størrelsen af molekyler, der kan permeabiliserede i celler ved hjælp af denne protokol. Hidtil har vi kun undersøgt transfektion egenskaber plasmider. Yderligere undersøgelser vil undersøge, om større stykker af genetisk materiale er i stand til at blive transficeret med denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke følgende finansieringskilder: Canadisk Institutes of Health Research (CIHR), naturvidenskab og Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
